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Dokumentenidentifikation DE60218998T2 06.12.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001383534
Titel Auf Bläschen basierender Impfstoff gegen Chlamydia
Anmelder GlaxoSmithKline Biologicals S.A., Rixensart, BE
Erfinder Berthet, Jacqueline, Rixensart, BE;
Lobet, Yves, Rixensart, BE;
Poolman, Jan, Rixensart, BE;
Verlant, Vincent, Rixensart, BE
Vertreter HOFFMANN & EITLE, 81925 München
DE-Aktenzeichen 60218998
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 08.02.2002
EP-Aktenzeichen 027129014
WO-Anmeldetag 08.02.2002
PCT-Aktenzeichen PCT/EP02/01356
WO-Veröffentlichungsnummer 2002062380
WO-Veröffentlichungsdatum 15.08.2002
EP-Offenlegungsdatum 28.01.2004
EP date of grant 21.03.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 06.12.2007
IPC-Hauptklasse A61K 39/116(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61P 31/04(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet von Gram-negativen bakteriellen Impfstoffzusammensetzungen und ihre Herstellung. Insbesondere betrifft sie das Gebiet von nützlichen Gram-negativen bakteriellen Außenmembranvesikel-(oder Bläschen-("bleb"))Zusammensetzungen, die heterolog exprimierte Chlamydia-Antigene umfassen, und vorteilhafte Verfahren, um diese Zusammensetzungen wirksamer und sicherer als Impfstoff zu machen.

Hintergrund der Erfindung

Chlamydiae sind obligatorische intrazelluläre Gram-negative Bakterien, die sich nur in cytoplasmatischen Einschlüssen eukaryontischer Zellen vermehren. Sie haben einen besonderen Entwicklungszyklus, der durch zwei Hauptformen dargestellt wird, das sporenartige Elementarkörperchen (EB), das die von Zelle zu Zelle übertragene infektiöse Form ist, und das nicht-infektiöse, stoffwechselaktive Retikularkörperchen (RB), das sich in der Wirtszelle vermehrt.

Von den vier bekannten Chamydia-Arten sind Chlamydia trachomatis und C. pneumoniae die wichtigen humanen Pathogene. Die kürzlich definierte Art C. pneumoniae (Grayston 1989) wird jetzt als Hauptursache für Atemwegsinfektionen anerkannt (Grayson 1993), und Daten nehmen jetzt für eine Verbindung mit Atherosklerose zu. Die Verbindung wird durch seroepidemiologische Studien gestützt, Studien, die die Gegenwart des Bakteriums in den atherosklerotischen Läsionen zeigen, Studien, die die Fähigkeit von C. pneumoniae zur Vermehrung in den unterschiedlichen Zelltypen zeigen, die in den atherosklerotischen Läsionen vorhanden sind, Eingriffsversuchen mit Antibiotika bei Patienten mit Herkranzerkrankung und experimentelle Atemwegsinfektion bei Kaninchen oder Apolipoprotein-E-Mangel-Mäusen, die zu inflammatorischen Veränderungen in der Aorta führt (Danesh 1997, Fong 1997, Laitinen 1997, Moazed 1997). Insgesamt implizieren diese Daten C. pneumoniae als verursachenden und/oder verschlimmernden Faktor von Atherosklerose.

C. trachomatis ist ein humanes Hauptpathogen; übertragen von Mensch zu Mensch (es gibt kein bekanntes Tierreservoir) verursacht es okulare und genitale Infektionen, die zu Langzeitfolgen führen können. Ein Trachom, eine okulare Chlamydia-Infektion, ist endemisch in mehreren Entwicklungsländern und ist die führende Ursache in der Welt für vermeidbare Erblindung bei Millionen Menschen, die von dieser Krankheit betroffen sind. Genitale Chlamydia-Infektionen stellen die häufigste bakterielle, geschlechtlich übertragene Krankheit ("sexually transmitted disease", STD) weltweit dar. 1996 erstellte die WHO einen neuen Satz globaler Abschätzungen für vier Haupt-STDs, wobei eine umfassende Übersicht über die veröffentlichten und unveröffentlichten Verbreitungsdaten gezeichnet wurde (Gerbase 1998). Es wurde geschätzt, daß 1995 4 und 5,2 Millionen neue Fälle von Infektion mit C. trachomatis in Individuen im Alter von 15–49 Jahren für Nordamerika bzw. Westeuropa erfolgten; weltweit summierte sich C. trachomatis auf schätzungsweise 89,1 Millionen neue Fälle. Kollektiv zeigen die Daten höhere Infektionsraten bei Frauen im Vergleich mit Männern (Washington 1987, Peeling 1995, Cates 1991); ein höheres Auftreten wird bei Heranwachsenden und jungen Erwachsenen festgestellt, wobei ca. 70 % der Chlamydia-Infektionen in der Altersgruppe von 15–24 Jahren angegeben werden (Peeling 1995).

Es besteht ein klarer Bedarf an wirksamen Impfstoffen gegen Chlamydia trachomatis und Chlamydia pneumoniae.

Außenmembranvesikel (Bläschen, "blebs")

Gram-negative Bakterien sind vom äußeren Medium durch zwei aufeinanderfolgende Schichten aus Membranstrukturen getrennt. Diese als die cytoplasmatische Membran und die Außenmembran (OM) bezeichneten Strukturen unterscheiden sich sowohl strukturell als auch funktionell. Die Außenmembran spielt eine wichtige Rolle in der Wechselwirkung von pathogenen Bakterien mit ihren jeweiligen Wirten. Entsprechend stellen die oberflächenexponierten bakteriellen Moleküle wichtige Ziele für die Immunreaktion des Wirtes dar, was Außenmembrankomponenten zu attraktiven Kandidaten bei der Bereitstellung von Impfstoff-, diagnostischen und therapeutischen Reagenzien macht.

Bakterielle Ganzzellimpfstoffe (abgetötet oder abgeschwächt (attenuiert)) haben den Vorteil der Bereitstellung mehrfacher Antigene in ihrer natürlichen Mikroumgebung. Nachteile um diesen Ansatz sind die durch bakterielle Komponenten wie Endotoxin- und Peptidoglycan-Fragmente induzierten Nebenwirkungen. Andererseits können azelluläre Spaltimpfstoffe, die gereinigte Komponenten aus der Außenmembran enthalten, nur begrenzten Schutz liefern und mögen die Antigene nicht angemessen dem Immunsystem des Wirtes präsentieren.

Proteine, Phospholipide und Lipopolysaccharide sind die drei Hauptbestandteile, die in der Außenmembran aller Gram-negativen Bakterien gefunden werden. Diese Moleküle sind asymmetrisch verteilt: Membranphospholipide (hauptsächlich im inneren Blättchen), Lipooligosaccharide (ausschließlich im äußeren Blättchen) und Proteine (innere und äußere Blättchen-Lipoproteine, integrale oder polytopische Membranproteine). Für viele bakterielle Pathogene, die die menschliche Gesundheit beeinflussen, haben sich Lipopolysaccharid und Außenmembranproteine als immunogen und zugänglich zum Verleihen von Schutz gegen die entsprechende Krankheit durch Immunisierung erwiesen.

Die OM von Gram-negativen Bakterien ist dynamisch und kann in Abhängigkeit von den Umweltbedingungen drastische morphologische Transformationen erfahren. Unter diesen Erscheinungsformen wurde die Bildung von Außenmembranvesikeln oder "Bläschen" in vielen Gram-negativen Bakterien untersucht und dokumentiert (L. Zhou et al. 1998, FEMS Microbiol. Lett. 163: 223–228). Darunter schließt eine nicht-erschöpfende Liste von bakteriellen Pathogenen, von denen die Erzeugung von Bläschen berichtet wurde, ein: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa und Yersinia enterocolitica. Obwohl der für die Produktion von OM-Bläschen verantwortliche biochemische Mechanismus nicht vollständig verstanden wird, wurden diese Außenmembranvesikel umfassend untersucht, da sie eine mächtige Methodik zur Isolierung von Außenmembranproteinzubereitungen in ihrer nativen Konformation darstellen.

Beispiele für Bakterienarten, aus denen Bläschenimpfstoffe hergestellt werden können, wurden besprochen in WO 01/09350. Zum Beispiel scheidet N. meningitidis Serogruppe B (menB) Außenmembranbläschen in ausreichenden Mengen aus, um ihre Herstellung im industriellen Maßstab zu erlauben. Solche Mehrkomponenten-Außenmembranproteinimpfstoffe aus natürlich vorkommenden menB-Stämmen wurden als wirksam im Schutz von Jugendlichen vor menB-Krankheit aufgefunden und wurden in Lateinamerika zugelassen. Ein alternatives Verfahren zur Herstellung von Außenmembranvesikeln erfolgt über das Verfahren der Detergensextraktion der bakteriellen Zellen (EP 11243).

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfinder haben festgestellt, daß Gram-negative bakterielle Bläschen ein idealer Zusammenhang zur Präsentation von Chlamydia-Außenmembranproteinen sind. Insbesondere sind Gonokokkenbläschen nützlich im Fall der Präsentation von C. trachomatis-OMPs, und Meningokokkenbläschen sind nützlich im Fall der Präsentation von C. pneumonieae-OMPs. Dies ist so, weil a) diese Außenmembranproteine solche Bläschen in einer nativen (oder annähernd nativen) Konformation integrieren können, wodurch eine nützliche immunologische Wirkung bewahrt wird; b) Bläschen (insbesondere aus Neisseria-Stämmen) in industriellen Mengen erzeugt werden können, c) Bläschen mukosal verabreicht werden können und d) die Kombination von Chlamydia-Antigenen mit nativen Bläschenantigenen wichtige Wechselwirkungen für bestimmte Zustände wie Salpingitis haben kann.

Die vorliegende Erfindung stellt somit vorteilhafte Gram-negative bakterielle Bläschenzubereitungen (abgeleitet aus oben aufgeführten Bläschen-erzeugenden bakteriellen Stämmemn und bevorzugt nicht abgeleitet aus Chlamydia) bereit, die auf ihrer Oberfläche ein oder mehrere rekombinante (und bevorzugt heterologe) Proteinantigene aus Chlamydia trachomatis oder Chlamydia pneumoniae präsentieren. Vorteilhafte Impfstofformulierungen und Verfahren zur Verabreichung werden ebenfalls bereitgestellt.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Gram-negatives bakterielles Bläschen bereit, das nicht aus Chlamydia stammt und auf seiner Oberfläche das PorB-Außenmembranprotein von Chlamydia traochmatis präsentiert, worin die Kombination des Chlamydia-Antigens mit den nativen Gram-negativen bakteriellen Bläschenantigenen in der Prävention oder Behandlung von Salpingitis, bei Vorhandensein in einer Impfstofformulierung, wechselwirkt.

Auch bereitgestellt wird ein Gram-negatives Bläschen, das nicht aus Chlamydia stammt und auf seiner Oberfläche sowohl die PmpG- als auch MOMP-(aus einem oder mehreren Serovars)Außenmembranproteine von Chlamydia trachomatis präsentiert, worin die Kombination der Chlamydia-Antigene mit den nativen Gram-negativen bakteriellen Bläschenantigenen in der Prävention oder Behandlung von Salpingitis, bei Vorhandensein in einer Impfstofformulierung, wechselwirkt.

Zusätzlich wird ein Gram-negatives Bläschen bereitgestellt, das von Neisseria meningitidis, Moraxella catarrhalis oder Haemophilus influenzae erzeugt wird und auf seiner Oberfläche ein Schutzantigen von Chlamydia pneumoniae präsentiert.

Im Zusammenhang dieser Anmeldung zeigt der Begriff "präsentiert auf seiner Oberfläche" an, daß das Chlamydia-Protein auf der äußeren Oberfläche des Bläschens exponiert und an die Außenmenbran gebunden sein sollte (bevorzugt durch Integration in die Außenmembran). Am meisten bevorzugt sollte es seine native Faltung innerhalb des heterologen Bläschenzusammenhangs annehmen.

Eine effiziente Stragegie zur Modulation der Zusammensetzung einer Bläschenzubereitung auf diese Weise besteht in der Übertragung einer oder mehrerer Kopien eines DNA-Segments, das eine Expressionskassette enthält, die ein Gen umfaßt, das das Chlamydia-Außenmembranprotein codiert, in das Genom eines Gram-negativen Bakteriums.

Eine nicht-erschöpfende Liste von bevorzugten bakteriellen Arten, die als Empfänger für eine solche Kassette verwendet werden könnten, schließt ein: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa und Yersinia enterocolitica. Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae und Pseudomona aeruginos sind besonders bevorzugt für diesen Zweck, und Neisseria gonorrhoeae und Neisseria meningitidis sind am meisten bevorzugt zur Herstellung der Bläschen dieser Erfindung. Die Chlamydia-OMPs werden heterolog exprimiert, und in solchen Situationen sollten Chlamydia-Stämme nicht zur Herstellung der Bläschen der Erfindung verwendet werden.

Das Gen (die Gene), das in der Expressionskassette enthalten ist, kann homolog (oder endogen) (d.h. es existiert natürlich im Genom des manipulierten Bakteriums) oder bevorzugt heterolog sein (d.h. es existiert nicht natürlich im Genom des manipulierten Bakteriums). Die eingeführte Expressionskassette kann aus unmodifizierten, "natürlichen" Promotor/Gen/Operon-Sequenzen oder veränderten Expressionskassetten bestehen, in denen die Promotorregion und/oder die codierende Region oder beide verändert wurden. Eine nicht-erschöpfende Liste von bevorzugten Promotoren (bevorzugt stark), die zur Expression verwendet werden könnten, schließt die Promotoren porA, porB, lbpB, tbpB, p110, lst, hpuAB von N. meningitidis oder N. gonorrhoeae, die Promotoren p2, p5, p4, ompF, p1, ompH, p6, hin47 von H. influenzae, die Promotoren ompH, ompG, ompCD, ompE, ompB1, ompB2, ompA von M. catarrhalis, die Promotoren &lgr;pL, lac, tac, araB von Escherichia coli oder die Promotoren ein, die spezifisch durch Bakteriophagen-RNA-Polymerase, wie zum Beispiel E. coli Bakteriophage T7, erkannt werden.

Die Expressionskassette kann in das bakterielle Chromosom mittels homologer und/oder ortsspezifischer Rekombination übertragen und integriert werden (wie in WO 01/09350 erörtert). Zur Übertragung solcher Gene und/oder Operons verwendete integrative Vektoren können bedingt replikative oder Suizidplasmide, Bakteriophagen, Transposonen oder lineare DNA-Fragmente sein, die durch Restriktionshydrolyse oder PCR-Amplifikation erhalten werden. Die Integration ist bevorzugt auf chromosomale Regionen gerichtet, die entbehrlich für das Wachstum in vitro sind. Eine nicht-erschöpfende Liste von bevorzugten Loci, die zur Ausrichtung der DNA-Integration verwendet werden können, schließt die porA-, porB-, opa-, opc-, rmp-, omp26-, lecA-, cps-, lgtB-Gene von Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae, die P1-, P5-, hmw1/2-, IgA-Protease-, fimE-Gene von NTHi; die lecA1-, lecA2-, omp106-, uspA1-, uspA2-Gene von Moraxella catarrhalis ein. Alternativ kann die zur Modulation der Expression von Bläschenkomponente(n) verwendete Expressionskassette in ein Bakterium der Wahl mittels episomaler Vektoren, wie zum Beispiel kreisförmige/lineare replikative Plasmide, Cosmide, Phasmide, lysogene Bakteriophagen oder bakterielle künstliche Chromosomen, übertragen werden. Die Auswahl des Rekombinationsereignisses kann mittels selektierbarer genetischer Marker ausgewählt werden, wie zum Beispiel durch Gene, die Resistenz gegen Antibiotika verleihen (zum Beispiel Kanamycin, Erythromycin, Chloramphenicol oder Gentamycin), Gene, die Resistenz gegen Schwermetalle und/oder toxische Verbindungen verleihen, oder Gene, die auotrophe Mutationen ergänzen (zum Beispiel pur, leu, met, aro). Bläschen können aus dem resultierenden modifizierten Stamm hergestellt werden.

Die Expression einiger heterologer Proteine in bakteriellen Bläschen kann die Zugabe von Außenmembran-Zielsignal(en) erfordern. Das bevorzugte Verfahren zum Lösen dieses Problems besteht in der Schaffung einer genetischen Fusion zwischen einem heterologen Gen und einem Gen, das für ein residentes OMP codiert, als spezifischer Ansatz, um rekombinante Proteine auf Bläschen auszurichten. Am meisten bevorzugt wird das heterologe Gen mit den Signalpeptidsequenzen eines solchen OMP fusioniert.

Eine besonders bevorzugte Anwendung dieser Erfindung ist die Einführung von Chlamydia-(trachomatis oder pneumoniae)Schutzantigenen (bevorzugt Außenmembranproteine) in Gram-negative bakterielle Bläschen, die nicht aus Chlamydia-Stämmen stammen. Dies hat mehrere Vorteile, die die Tatsache einschließen, daß solche Bläschen (und sie umfassende Impfstoffe) äußerst geeignet zur mukosalen Verabreichung sind, was vorteilhaft ist, da eine mukosale (IgA-) Immunreaktion gegen die im Bläschen vorhandenen Chlamydia-Antigene schützender gegen Chlamydia-Infektion sein wird, die sich selbst in der Schleimhaut zeigen.

In ein Gram-negatives bakterielles Bläschen integrierte Chlamydia trachomatis-Antigene

Eine besonders bevorzugte Verwendung liegt auf dem Gebiet der Prophylaxe oder Behandlung von geschlechtlich übertragenen Krankheiten (STDs). Es ist häufig schwierig für Ärzte zu bestimmen, ob die Hauptursache für eine STD in einer Gonokokken- oder Chlamydia trachomatis-Infektion liegt. Die zwei Organismen sind Hauptursachen für Salpingitis – eine Krankheit, die zu Sterilität im Wirt führen kann. Es wäre nützlich, falls gegen eine STD geimpft oder sie mit einem kombinierten Impfstoff behandelt werden könnte, der wirksam gegen Krankheit ist, die durch beide Organismen verursacht wird. Das Hauptaußenmembranprotein (MOMP oder OMP1 oder OMPI) von C. trachomatis hat sich als Ziel von Schutzantikörpern erwiesen. Jedoch ist die strukturelle Integrität diese integralen Membranproteins wichtig zur Induzierung solcher Antikörper. Zusätzlich sind die durch diese Antikörper erkannten Epitope variabel und definieren mehr als 10 Serovars. Der Bläschenzusammenhang der Erfindung erlaubt die geeignete Faltung eines oder mehrerer MOMP oder anderer Chalydia-Membranproteine für Impfstoffzwecke. Die Veränderung von (bevorzugt) einem Gonokokken-Stamm, der ein oder mehrere C. trachomatis-MOMP-Serovars und/oder ein oder mehrere andere schützende Chlamydia-OMPs in der Außenmembran exprimiert, und die Produktion von Bläschen daraus erzeugt eine Einzellösung für die mehrfachen Probleme von korrekt gefalteten Membranproteinen, die Präsentation von ausreichenden MOMP-Serovars und/oder anderen Chlamydia-OMPS zum Schutz gegen ein weites Spektrum von Serovars und die gleichzeitige Prophylaxe/Behandlung von Gonokokkeninfektion (und entsprechend das fehlende Erfordernis für den Arzt, zunächst zu entscheiden, welcher Organismus besondere klinische Symptome verursacht – gegen beide Organismen kann gleichzeitig geimpft werden, was somit die Behandlung der STD in einem sehr frühen Stadium erlaubt). Bevorzugte Loci für die Geninsertion im Gonokokkenchromosom sind oben angegeben. Nevorzugte schützende C. trachomatis-Gene, die aufgenommen werden könnten, sind HMWP, PmpG und die in WO 99/28475 offenbarten OMPs.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung stellt ein Gram-negatives bakterielles Bläschen (bevorzugt von Gonokokken) bereit, das auf seiner Oberfläche das PorB-Außenmembranprotein (siehe unten) von Chlamydia trachomatis präsentiert.

PorB Chlamydia trachomatis-Serovar D (D/UW-3/Cx) DNA-Sequenz

Translatierte Aminosäuresequenz

Die Gegenwart von PorB in den Bläschen bedeutet, daß das Antigen leichter mukosal verabreicht werden kann, und stellt einen wirksameren Schutz als bei alleiniger Verabreichung bereit.

Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich ein Gram-negatives bakterielles Bläschen (bevorzugt von Gonokokken) bereit, das auf seiner Oberfläche ein oder mehrere der folgenden Proteine von Chlamydia trachomatis oder C. trachomatis PorB in Kombination mit einem oder mehreren der folgenden Proteine präsentiert. Es wird einem Fachmann ersichtlich sein, daß statt der nachfolgenden Sequenzen (und der obigen PorB-Sequenz) das natürliche Analogon der Sequenzen von anderen C. trachomatis-Serovars oder -Serotypen verwendet werden könnte, ebenso wie Gene verwendet werden könnten, die funktionelle Analoga der Proteine codieren, die Insertionen, Deletionen oder Substitutionen aus den genannten Sequenzen umfassen, die die immunologischen Eigenschaften des codierten Proteins nicht beeinflussen. Bevorzugt sollte eine Sequenz aus einem Serovar D-Stamm ausgewählt werden. Ein bakterieller Stamm, der ein solches Bläschen erzeugen kann ist ein weiterer Aspekt der Erfindung.

Erneut können solche Bläschen, wenn sie in einer Impfstofformulierung vorhanden sind, schützender gegen Chlamydia trachomatis-Infektion als die Verwendung des Proteins in Isolierung sein.

Besonders vorteilhafte Paare von Chlamydia trachomatis-Antigenen sind weitere bevorzugte Ausführungsformen dieser Erfindung. So wird in einem weiteren Aspekt ein Gram-negatives Bläschen (bevorzugt von Gonokokken) bereitgestellt, das auf seiner Oberfläche sowohl die PorB- als auch PmpG-Außenmembranproteine von Chlamydia trachomatis präsentiert. Ferner wird ein Gram-negatives Bläschen (bevorzugt von Gonokokken) bereitgestellt, das auf seiner Oberfläche sowohl die PorB- als auch MOMP-(aus einem oder mehreren Serovars)Außenmembranproteine von Chlamydia trachomatis präsentiert. Schließlich wird ein Gram-negatives Bläschen (bevorzugt von Gonokokken) bereitgestellt, das auf seiner Oberfläche sowohl die PmpG- als auch MOMP-(aus einem oder mehreren Serovars)Außenmembranproteine von Chlamydia trachomatis präsentiert.

Durch MOMP (oder OMP1 oder OMPI) aus einem oder mehreren (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Serovars ist es bevorzugt, daß ein oder mehrere aus einer Liste von Serovars ausgewählt werden sollten, die aus B, Ba, D, Da, E, L1, L2, L2a, F, G, K, L3, A, C, H, I, Ia und J besteht; besonders bevorzugt aus einer Liste, die aus D, E, F, G, K, H, I und J besteht. Am meisten bevorzugt sollten ein oder mehrere MOMPs wenigstens MOMP aus Serovar D oder E (am meisten bevorzugt D) umfassen. Eine weitere bevorzugte Strategie ist die Auswahl eines oder mehrerer MOMP aus jeder der folgenden drei Serogruppen: B-Serogruppe (bestehend aus Serovars B, Ba, D, Da, E, L1, L2 und L2a, und bevorzugt ausgewählt aus Serovars D, Da und E); F-G-Serogruppe (bestehend aus Serovars F und G); und C-Serogruppe (bestehend aus Serovars A, C, H, I, Ia, J, K und L3, und bevorzugt ausgewählt aus Serovars H, I, Ia, J und K).

Am meisten bevorzugt sollten die Gene für die Chlamydia trachomatis-Antigene am PorA-Locus von Neisseria (bevorzugt von Gonokokken) inseriert werden.

Eine solche als Impfstoff formulierte Zubereitung kann erhöhten Schutz für einen Wirt gegen Chlamydia trachomatis ergeben, als wenn ein einzelnes Antigen verabreicht wird.

Bevorzugt stammt das Bläschen aus einem Stamm (bevorzugt von Gonokokken), der zur Aufregulierung eines oder mehrerer schützender Außenmembranantigene modifiziert wurde (wie nachfolgend beschrieben).

Bevorzugt stammt das Bläschen aus einem Stamm (bevorzugt von Gonokokken), der zur Abregulierung eines oder mehrere immundominanter variabler oder nicht-schützender Außenmembranantigene modifiziert wurde (wie nachfolgend beschrieben).

Bevorzugt stammen die Bläschen aus einem Stamm (bevorzugt von Gonokokken), der einen entgifteten Lipid-A-Teil von bakteriellem LPS aufweist, weil der Stamm verändert wurde, um die Expression eines oder mehrerer Gene zu reduzieren oder auszuschalten, die dazu führen, daß LPS toxisch ist (bevorzugt ausgewählt aus den folgenden Genen oder Homologen davon: htrB, msbB und lpxK; siehe nachfolgender Abschnitt).

Bevorzugt stammen die Bläschen aus einem Stamm (bevorzugt von Gonokokken), der einen entgifteten Lipid A-Teil von bakteriellem LPS aufweist, weil der Stamm manipuliert wurde, um eine größere Menge eines oder mehrerer Gene zu exprimieren, die ein Genprodukt erzeugen, das LPS entgiften kann (bevorzugt ausgewählt aus den folgenden Genen oder Homologen davon: pmrA, pmrB, pmrE und pmrF; siehe nachfolgender Abschnitt).

Impfstoffzusammensetzungen, die das Bläschen der Erfindung und einen pharmazeutisch geeigneten Exzipienten oder Träger umfassen, werden auch erwogen. Bevorzugt umfaßt der Impfstoff zusätzlich einen mukosalen Hilfsstoff. Mukosale Hilfsstoffe sind allgemein fachbekannt (siehe "Vaccine Design – The subunit and adjuvant approach" (Hrsg. M.F. Powell & M.J. Newman) (1995) Plenum Press, New York). Ein bevorzugter mukosaler Hilfsstoff ist LT2 (oder LTII, das in LTIIa und LTIIb gespalten werden kann – siehe Martin et al., Infection and Immunity, 2000, 68:281–287). Bevorzugt sollten solche Impfstoffe wie nachfolgend unter "Impfstoffformulierungen" beschrieben formuliert und verabreicht werden.

Der Gehalt an Bläschen pro Dosis im Impfstoff wird typischerweise im Bereich von 1–100 &mgr;g, bevorzugt 5–50 &mgr;g und ganz besonders typisch im Bereich von 5–25 &mgr;g sein.

Optimale Mengen von Komponenten für einen besonderen Impfstoff können durch Standarduntersuchungen sichergestellt werden, die die Beobachtung geeigneter Immunreaktionen in Probanden beinhalten. Nach einer Erstimpfung können Patienten eine oder mehrere Auffrischungsimmunisierungen in angemessenem Abstand erhalten.

Ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention von Chlamydia trachomatis-Infektion in einem Wirt wird ebenfalls bereitgestellt, das die Schritte der Verabreichung einer wirksamen Menge des obigen Impfstoffs an einen bedürftigen Wirt umfaßt. Bevorzugt wird der Impfstoff mukosal über einen entweder intranasalen, oralen, intradermalen oder intravaginalen Weg verabreicht.

In ein Gram-negatives bakterielles Bläschen integrierte Chlamydia pneumoniae-Antigene

In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Gram-negatives Bläschen bereit, das auf seiner Oberfläche ein Schutzantigen aus Chlamydia pneumoniae präsentiert. Neisseria meningitidis, Moraxella catarrhalis und Haemophilus influenzae sind die Arten zur Herstellung des Bläschens. Solche Schutzantigene sind bevorzugt eines oder mehrere aus den nachfolgend aufgeführten:

1) Zellhülle: Membranproteine, Lipoproteine und Porine

2) Codierende Gene (nicht in C. trachomatis)

3) Chlamydia-spezifische Proteine

(Die vollständigen Sequenzangaben wurden auf der Homepage von Chlamydia Genome Project veröffentlicht: http://chlamydia-www.berkeley.edu:4231/index.html).

Zusätzliche Chlamydia-Gene und codierte Proteine, die zur Expression in einem Gram-negativen Bakterium zur OMV-Impfstoffherstellung geeignet sind:

Wenn solche Bläschen in einer Impfstofformulierung vorhanden sind, können sie stärker schützend gegen Chlamydia pneumoniae-Infektion als die Verwendung des Protein/Antigens in Isolation sein.

Besonders vorteilhafte Paare von Chlamydia pneumoniae-Antigenen wurden ebenfalls gefunden. So wird in einem weiteren Aspekt ein Gram-negatives Bläschen (bevorzugt von Meningokokken) bereitgestellt, das auf seiner Oberfläche sowohl die PorB- als auch MOMP-Außenmembranproteine von Chlamydia pneumoniae präsentiert. Außerdem wird ein Gram-negatives Bläschen (bevorzugt von Meningokokken) bereitgestellt, das auf seiner Oberfläche sowohl MOMP- als auch ein oder mehrere Pmp-Außenmembranproteine von Chlamydia pneumoniae präsentiert. Ein Gram-negatives Bläschen (bevorzugt von Meningokokken) wird zusätzlich bereitgestellt, das auf seiner Oberfläche sowohl die PorB- als auch ein oder mehrere Pmp-Außenmembranproteine von Chlamydia pneumoniae präsentiert. Ein Gram-negatives Bläschen (bevorzugt von Menigokokken) wird ebenfalls bereitgestellt, das auf seiner Oberfläche sowohl die PorB- als auch Npt1-Proteine von Chlamydia pneumoniae präsentiert. Ein Gram-negatives Bläschen (bevorzugt von Meningokokken) wird zusätzlich bereitgestellt, das auf seiner Oberfläche sowohl die Npt1- als auch ein oder mehrere Pmp-Proteine von Chlamydia pneumoniae präsentiert. Schließlich wird ein Gram-negatives Bläschen (bevorzugt von Meningokokken) bereitgestellt, das auf seiner Oberfläche sowohl die Npt1- als auch MOMP-Proteine von Chlamydia pneumoniae präsentiert.

Als Impfstoff formulierte Zubereitungen können gesteigerten Schutz für einen Wirt gegen Chlamydia ergeben, als wenn ein einzelnes Antigen verabreicht wird.

Bevorzugt stammt das Bläschen aus einem Stamm, der modifiziert wurde, um ein oder mehrere schützende Außenmembranantigene aufzuregulieren (siehe unten; für schützende Menigokokken-Außenmembranantigene sie beispielsweise den Abschnitt "Neisseria-Bläschenzubereitungen" für diejenigen Antigene, die bevorzugt auf reguliert werden sollten).

Bevorzugt stammt das Bläschen aus einem Stamm, der modifiziert wurde, um ein oder mehrere immundominante variable oder nicht-schützende Außenmembranantigene abzuregulieren (wie nachfolgend beschrieben; für variable/nicht-schützende Menigokokken-Außenmenbranantigene siehe beispielsweise den Abschnitt "Neisseria-Bläschenzubereitungen" für diejenigen Antigene, die bevorzugt abreguliert werden sollten).

Bevorzugt stammen die Bläschen aus einem Stamm, der einen entgifteten Lipid A-Teil von bakteriellem LPS aufweist, weil der Stamm manipuliert wurde, um die Expression eines oder mehrer Gene zu reduzieren oder auszuschalten, die dazu führen, daß LPS toxisch ist (bevorzugt ausgewählt aus den folgenden Genen oder Homologen davon: htrB, msbB und lpxK; siehe nachfolgender Abschnitt).

Bevorzugt stammen die Bläschen aus einem Stamm, der einen eintgifteten Lipid A-Teil von bakteriellem LPS aufweist, weil der Stamm manipuliert wurde, um ein oder mehrere Gene in einer höheren Menge zu exprimieren, die ein Genprodukt erzeugen, das LPS entgiften kann (bevorzugt ausgewählt aus den folgenden Genen oder Homologen davon: pmrA, pmrB, pmrE und pmrF; siehe nachfolgender Abschnitt).

Impfstoffzusammensetzungen, die das Bläschen der Erfindung und einen pharmazeutisch geeigneten Exzipienten oder Träger umfassen, werden auch erwogen. Bevorzugt umfaßt der Impfstoff zusätzlich einen mukosalen Hilfsstoff. Mukosale Hilfsstoffe sind allgemein fachbekannt (siehe "Vaccine Design – The subunit and adjuvant approach" (Hrsg. M.F. Powell & M.J. Newman) (1995) Plenum Press, New York). Ein bevorzugter mukosaler Hilfsstoff ist LT2 (oder LTII, das in LTIIa und LTIIb gespalten werden kann – siehe Martin et al., Infection and Immunity, 2000, 68:281–287). Bevorzugt sollten solche Impfstoffe wie nachfolgend unter "Impfstoffformulierungen" beschrieben formuliert und verabreicht werden.

Der Gehalt an Bläschen pro Dosis im Impfstoff wird typischerweise im Bereich von 1–100 &mgr;g, bevorzugt 5–50 &mgr;g und ganz besonders typisch im Bereich von 5–25 &mgr;g sein.

Optimale Mengen von Komponenten für einen besonderen Impfstoff können durch Standarduntersuchungen sichergestellt werden, die die Beobachtung geeigneter Immunreaktionen in Probanden beinhalten. Nach einer Erstimpfung können Probanden eine oder mehrere Auffrischungsimmunisierungen in angemessenem Abstand erhalten.

Die Wirksamkeit eines C. pneumoniae-Impfstoffes kann in einem Mäusemodell der Infektion ausgewertet werden, wie dem von Murdin et al. beschriebenen, 2000, J. Infect. Dis. 181 (Suppl. 3):55444–51. Der durch eine Impfstofformulierung hervorgerufene Schutz kann durch die Reduzierung der bakteriellen Last in der Lunge nach einer Kontaktinfektion mit C. pneumoniae getestet werden.

Ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention von Chlamydia pneumoniae-Infektion in einem Wirt wird ebenfalls bereitgestellt, das die Schritte der Verabreichung einer wirksamen Menge des obigen Impfstoffs an einen bedürftigen Wirt umfaßt. Bevorzugt wird der Impfstoff mukosal über einen entweder intranasalen, oralen, intradermalen oder intravaginalen Weg verabreicht.

Weitere Verbesserungen für die Bakterien und Bläschen der Erfindung

Das Gram-negative Bakterium kann ferner durch ein oder mehrere Verfahren gentechnisch verändert werden, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: (a) ein Verfahren der Abregulation der Expression von immundominanten variablen oder nicht-schützenden Antigenen, (b) ein Verfahren der Aufregulation der Expression von schützenden OMP-Antigenen, (c) ein Verfahren der Abregulation eines Gens, das daran beteiligt ist, den Lipid A-Teil von LPS toxisch zu machen, (d) ein Verfahren der Aufregulation eines Gens, das daran beteiligt ist, den Lipid A-Teil von LPS weniger toxisch zu machen, und (e) ein Verfahren der Abregulation der Synthese eines Antigens, das eine strukturelle Ähnlichkeit mit einer humanen Struktur teilt und eine Autoimmunreaktion in Menschen induzieren kann. Diese Verfahren werden im Detail in WO 01/09350 beschrieben.

Solche Bläschenimpfstoffe der Erfindung werden geschaffen, um die Immunreaktion auf einige schützende (bevorzugt konservierte) Antigene oder Epitope zu fokussieren – formuliert in einem Mehrkomponentenimpfstoff. Wenn solche Antigene integrale OMPs sind, werden die Außenmembranvesikel von Bläschenimpfstoffen ihre geeignete Faltung sicherstellen. Diese Erfindung stellt Verfahren zur Optimierung der OMP- und LPS-Zusammensetzung von OMV-(Bläschen)-Impfstoffen durch Deletieren von immundominanten variablen sowie nicht-schützenden OMPs bereit, indem konservierte OMPs durch Deletion von variablen Regionen geschaffen werden, indem die Expression von schützenden OMPs auf reguliert wird, und indem Kontrollmechanismen zur Expression (wie Eisenrestriktion) von schützenden OMPs eliminiert werden. Zusätzlich wird die Reduzierung der Toxizität von Lipid A durch Modifikation des Lipidteils oder durch Veränderung der Phosphorylzusammensetzung, während seine Adjuvansaktivität bewahrt wird, oder durch Maskieren bereitgestellt. Jedes dieser neuen Verfahren zur Verbesserung verbessert individuell den Bläschenimpfstoff, jedoch funktioniert eine Kombination aus einem oder mehreren dieser Verfahren in Verbindung, um einen optimierten manipulierten Bläschenimpfstoff zu erzeugen, der immunschützend und nicht-toxisch ist – insbesondere geeignet zur pädiatrischen Verwendung.

(a) Ein Verfahren zur Abregulation der Expression von immundominanten variablen oder nicht-schützenden Antigenen

Viele Oberflächenantigene sind variabel unter bakteriellen Stämmen und sind als Ergebnis schützend nur gegen einen beschränkten Satz von eng verwandten Stämmen. Die Reduzierung der Expression oder bevorzugt die Deletion des Gens (der Gene), das variables Oberflächenprotein (Proteine) codiert, wird beschrieben, was zu einem bakteriellen Stamm führt, der Bläschen erzeugt, die bei Verabreichung in einem Impfstoff ein stärkeres Potential für Kreuzreaktivität gegen verschiedene Stämme aufgrund eines höheren Einflusses haben, der durch konservierte Proteine (auf den Außenmembranen bewahrt) auf das Immunsystem des Impflings ausgeübt wird. Beispiele für solche variablen Antigene schließen ein: für Neisseria – Pili (PilC), das antigene Variationen erfährt, PorA, Opa, TbpB, FrpB; für H. influenzae – P, P5, Pilin, IgA1-Protease; und für Moraxella – CopB, OMP106.

Andere Gentypen, die abreguliert oder ausgeschaltet werden könnten, sind Gene, die in vivo durch das Bakterium leicht eingeschaltet (exprimiert) oder ausgeschaltet werden können. Da durch solche Gene codierte Außenmembranproteine nicht immer auf den Bakterien vorhanden sind, kann die Gegenwart solcher Proteine in den Bläschenzubereitungen auch nachteilig für die Wirksamkeit des Impfstoffs aus den oben genannten Gründen sein. Ein bevorzugtes Beispiel zur Abregulation oder Deletion ist Neisseria-Opc-Protein. Durch einen Opc-haltigen Bläschenimpfstoff induzierte Anti-Opc-Immunität würde nur begrenzte Schutzfähigkeit besitzen, da der infizierende Organismus leicht Opc- werden könnte. H. influenzae HgpA und HgpB sind andere Beispiele für solche Proteine.

In Verfahren a) werden diese variablen oder nicht-schützenden Gene in der Expression abreguliert oder endgültig ausgeschaltet. Dies hat den überraschenden Vorteil des Konzentrierens des Immunsystems auf bessere Antigene, die in geringen Mengen auf der Außenoberfläche von Bläschen vorhanden sind.

Der Stamm kann auf diese Weise durch eine Anzahl von Strategien manipuliert werden, die die Transposoninsertion zur Unterbrechung der codierenden Region oder Promotorregion des Gens oder Punktmutationen oder Deletionen zum Erreichen eines ähnlichen Ergebnisses einschließen. Eine homologe Rekombination kann auch zur Deletion eines Gens aus einem Chromosom verwendet werden (wenn Sequenz X einen Teil (bevorzugt alles) der codierenden Sequenz des Gens von Interesse umfaßt). Sie kann zusätzlich zur Veränderung seines starken Promotors gegen einen schwächeren (oder keinen) Promotor verwendet werden. All diese Techniken werden in WO 01/09350 beschrieben.

(b) Ein Verfahren zur Aufregulation der Expression von schützenden OMP-Antigenen

Dies kann durch Inserieren einer Kopie eines solchen schützenden OMP in das Genom (bevorzugt durch homologe Rekombination) oder durch Aufregulation der Expression des nativen Gens durch Austauschen des nativen Promotors gegen einen stärkeren Promotor oder Inserieren eines starken Promotors stromaufwärts des fraglichen Gens erfolgen (auch durch homologe Rekombination). Solche Verfahren können unter Verwendung der in WO 01/09350 beschriebenen Techniken erreicht werden.

Solche Verfahren sind besonders nützlich zur Steigerung der Produktion von immunologisch relevanten Bläschenkomponenten wie Außenmembranproteinen und Lipoproteinen (bevorzugt konservierte OMPs, gewöhnlich vorhanden in Bläschen in geringen Konzentrationen).

(c) Ein Verfahren zur Abregulation eines Gens, das daran beteiligt ist, den Lipid-A-Teil von LPS toxisch zu machen

Die Toxizität von Bläschenimpfstoffen stellt eines der größten Probleme bei der Verwendung von Bläschen in Impfstoffen dar. Ein Verfahren zum genetischen Entgiften des in Bläschen vorhandenen LPS wird offenbart. Lipid A ist die Hauptkomponente von LPS, die für die Zellaktivierung verantwortlich ist. Viele Mutationen in Genen, die an diesem Reaktionsweg beteiligt sind, führen zu wesentlichen Phänotypen. Jedoch führen Mutationen in den Genen, die für die letztlichen Modifikationsschritte verantwortlich sind, zu temperaturempfindlichen (htrB) oder permissiven (msbB) Phänotypen. Mutationen, die zu einer verringerten (oder keiner) Expression dieser Gene führen, führen zu veränderter toxischer Aktivität von Lipid A. Tatsächlich sind das nicht-lauroylierte (htrB-Mutante) [auch definiert durch das resultierende LPS, dem beide sekundären Acylketten fehlen] oder nicht-myristoylierte (msbB-Mutante) [auch definiert durch das resultierende LPS, dem nur eine einzelene sekundäre Acylkette fehlt] Lipid A ist weniger toxisch als das Lipid A vom Wildtyp. Mutationen im Lipid A 4'-Kinase-codierenden Gen (lpxK) verringern ebenfalls die toxische Aktivität von Lipid A.

Verfahren c) involviert somit die Deletion eines Teils (oder bevorzugt von allem) eines oder mehrerer der obigen offenen Leseraster oder Promotoren. Alternativ könnten die Promotoren durch schwächere Promotoren ersetzt werden. Bevorzugt werden die homologen Rekombinationstechniken zur Durchführung des Verfahrens verwendet. Bevorzugt werden die in WO 01/09350 beschriebenen Verfahren verwendet. Die Sequenzen der htrB- und msbB-Gene von Neisseria meningitidis B, Moraxella catarrhalis und Haemophilus influenzae werden für diesen Zweck in WO 01/09350 bereitgestellt.

(d) Ein Verfahren zur Aufregulation eines Gens, das daran beteiligt ist, den Lipid A-Teil von LPS weniger toxisch zu machen

Toxische Aktivität von LPS könnte auch durch Einführung von Mutationen in Gene/Loci verändert werden, die an Polymyxin B-Resistenz beteiligt sind (eine solche Resistenz wurde mit der Addition von Aminoarabinose an das 4'-Phosphat von Lipid A korreliert). Diese Gene/Loci könnten pmrE sein, das eine UDP-Glucosedehydrogenase codiert, oder eine Region von antimikrobiellen Peptidresistenzgenen, die vielen Enterobacteriaceae gemein sind, die an der Aminoarabinosesynthese und -übertragung beteiligt sein könnten. Das Gen pmrF, das in dieser Region vorhanden ist, codiert eine Dolicol-Phosphatmanosyltransferase (J.S. Gunn, B.L. Kheng, J. Krueger, K. Kim, L. Guo, M. Hackett, S.I. Miller 1998, Mol. Microbiol. 27: 1171–1182).

Mutationen im PhoP-PhoQ-Regulationssystem, das ein Phospho-Relais-Zweikomponentenregulationssystem ist (z.B. PhoP-konstitutiver Phänotyp, PhoPC), oder Umwelt- oder Kulturbedingungen mit wenig Mg++ (die das PhoP-PhoQ-Regulationssystem aktivieren) führen zur Addition von Aminoarabinose an das 4'-Phosphat und zum Ersatz von Myristat durch 2-Hydroxymyristat (Hydroxylierung von Myristat). Dieses modifizierte Lipid A zeigt eine reduzierte Fähigkeit zur Stimulation der E-Selectinexpression durch humane Endothelzellen und TNF-&agr;-Sezernierung aus humanen Monozyten.

Verfahren d) beinhaltet die Aufregulation dieser Gene unter Verwendung einer Strategie wie in WO 01/09350 beschrieben.

(e) Ein Verfahren zur Abregulation der Synthese eines Antigens, das eine strukturelle Ähnlichkeit mit einer humanen Struktur teilt und eine Autoimmunreaktion in Menschen induzieren kann

Die Isolation von bakteriellen Außenmembranbläschen aus verkapselten Gram-negativen Bakterien führt häufig zur gleichzeitigen Reinigung von Kapselpolysaccharid. In manchen Fällen kann sich dieses "verunreinigende" Material als nützlich erweisen, da Polysaccharid die Immunreaktion steigern kann, die durch andere Bläschenkomponenten verliehen wird. In anderen Fällen kann sich jedoch die Gegenwart von verunreinigendem Polysaccharidmaterial in bakteriellen Bläschenzubereitungen als nachteilig für die Verwendung der Bläschen in einem Impfstoff erweisen. Zum Beispiel wurde zumindest für den Fall von N. meningitidis gezeigt, daß Kapselpolysaccharid der Serogruppe B keine schützende Immunität verleiht und dafür anfällig ist, eine nachteilige Autoimmunreaktion in Menschen zu induzieren. Entsprechend ist das Verfahren e) die Manipulation des bakteriellen Stammes zur Bläschenproduktion, so daß er frei von Kapselpolysaccharid ist. Die Bläschen werden dann zur Verwendung in Menschen geeignet sein. Ein besonders bevorzugtes Beispiel für eine solche Bläschenzubereitung ist eine aus N. meningitidis Serogruppe B, die frei von Kapselpolysaccharid ist.

Dies kann unter Verwendung von modifizierten Stämmen zur Bläschenproduktion erreicht werden, in denen die für die Kapselbiosynthese und/oder den Kapselexport notwendigen Gene beeinträchtigt wurden, wie in WO 01/09350 beschrieben. Ein bevorzugtes Verfahren ist die Deletion einiger oder aller der Neisseria meningitidis cps-Gene, die für die Polysaccharidbiosynthese und den Polysaccharidexport erforderlich sind. Für diesen Zweck kann das Austauschplasmid pMF121 (beschrieben in Frosh et al., 1990, Mol. Microbiol. 4:1215–1218) zur Übertragung einer Mutation verwendet werden, die den cpsCAD-(+galE)-Gencluster deletiert. Alternativ könnte das siaD-Gen deletiert oder dessen Expression abreguliert werden (das Meningokokken-siaD-Gen codiert alpha-2,3-Sialyltransferase, ein Enzym, das zur Kapselpolysaccharid- und LOS-Synthese erforderlich ist). Solche Mutationen können auch Wirt-ähnliche Strukturen auf dem Saccharid-Teil des LPS der Bakterien entfernen.

Kombinationen der Verfahren a)–e)

Man mag einsehen, daß eines oder mehrere der obigen Verfahren verwendet werden können, um einen modifizierten Stamm zu erzeugen, um daraus verbesserte Bläschenzubereitungen der Erfindung herzustellen. Bevorzugt wird ein solches Verfahren verwendet, besonders bevorzugt werden zwei oder mehr (2, 3, 4 oder 5) der Verfahren verwendet, um den Bläschenimpfstoff herzustellen. Da jedes zusätzliche Verfahren in der Herstellung des Bläschenimpfstoffs verwendet wird, arbeitet jede Verbesserung in Verbindung mit den anderen verwendeten Verfahren, um eine optimierte manipulierte Bläschenzubereitung herzustellen.

Eine bevorzugte Bläschenzubereitung aus Menigokokken (insbesondere N. meningitidis B) umfaßt die Verwendung der Verfahren b), c) und e) (gegebenenfalls kombiniert mit Verfahren a)). Solche Bläschenzubereitungen sind sicher (keine Strukturen ähnlich den Wirtstrukturen), nicht-toxisch und so strukturiert, daß die Immunreaktion des Wirtes auf große Mengen von schützenden (und bevorzugt konservierten) Antigenen fokussiert werden wird.

Alle obigen Elemente arbeiten zusammen, um einen optimierten Bläschenimpfstoff bereitzustellen.

Ähnlich wie für M. catarrhalis, nicht-typisierbares H. influenzae, Gonococcus und Nicht-Serotyp B-Meningokokkenstämme (z.B. Serotyp A, C, Y oder W) umfassen bevorzugte Bläschenzubereitungen die Verwendung der Verfahren b) und c), gegebenenfalls kombiniert mit Verfahren a).

Bevorzugte Neisseria-Bläschenzubereitungen

Eines oder mehrere der folgenden Gene (die schützende Antigene codieren) sind zur Aufregulation über Verfahren b) bevorzugt, wenn es an einem Neisseria-Stamm durchgeführt wird, einschließlich Gonococcus und Meningococcus (insbesondere N. meningitidis B): NspA (WO 96/29412), Hsf-artig (WO 99/31132), Hap (PCT/EP99/02766), PorA, PorB, OMP85 (WO 00/23595), PilQ (PCT/EP99/03603), PldA (PCT/EP99/06718), FrpB (WO 96/31618), TbpA (US 5,912,336), TbpB, FrpA/FrpC (WO 92/01460), LbpA/LbpB (PCT/EP98/05117), Fhab (WO 98/02547), HasR (PCT/EP99/05989), lipo02 (PCT/EP99/08315), Tbp2 (WO 99/57280), MltA (WO 99/57280) und ctrA (PCT/EP00/00135). Sie sind auch als Gene bevorzugt, die heterolog in andere Gram-negative Bakterien eingeführt werden können.

Eines oder mehrere der folgenden Gene sind zur Abregulation über Verfahren a) bevorzugt: PorA, PorB, PilC, TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, Opa und Opc (am meisten bevorzugt PorA).

Eines oder mehrere der folgenden Gene sind bevorzugt zur Abregulation über Verfahren c): htrB, msbB und LpxK (am meisten bevorzugt msbB, das nur eine einzelne sekundäre Acylkette vom LPS-Molekül entfernt).

Eines oder mehrere der folgenden Gene sind bevorzugt zur Aufregulation über Verfahren d): pmrA, pmrB, pmrE und pmrF.

Eines oder mehrerer der folgenden Gene sind bevorzugt zur Abregulation über Verfahren e): galE, siaA, siaB, siaC, siaD, ctrA, ctrB, ctrC und ctrD (die Gene werden in WO 01/09350 beschrieben).

Viele der obigen offenen Leseraster und stromaufwärts gelegenen Regionen werden in WO 01/09350 beschrieben.

Bevorzugte Gonokokken-Gene zur Aufregulation über Verfahren b) schließen eines oder mehrere der folgenden ein:

Bevorzugte Gonokokkengene zur Abregulation über Verfahren a) schließen eines oder mehrere der folgenden ein:

Bevorzugte Pseudomonas aeruginosa-Bläschenzubereitungen

Eines oder mehrere der folgenden Gene (die Schutzantigene codieren) sind bevorzugt zur Aufregulation über Verfahren b): PcrV, OprF, OprI. Sie sind auch als Gene bevorzugt, die heterolog in andere Gram-negative Bakterien eingeführt werden können.

Bevorzugte Moraxella catarrhalis-Bläschenzubereitungen

Eines oder mehrerer der folgenden Gene (die Schutzantigene codieren) sind bevorzugt zur Aufregulation über Verfahren b): OMP106 (WO 97/41731 & WO 96/34960), HasR (PCT/EP99/03824), PilQ (PCT/EP99/03823), OMP85 (PCT/EP00/01468), lipo06 (GB 9917977.2), lipo10 (GB 9918208.1), lipo11 (GB 9918302.2), lipo18 (GB 9918038.2), P6 (PCT/EP99/03038), ompCD, CopB (M.E. Helminen et al., (1993) Infect. Immun. 61:2003–2010), D15 (PCT/EP99/03822), OmplA1 (PCT/EP99/06781), Hly3 (PCT/EP99/03257), LbpA und LbpB (WO 98/55606), TbpA and TbpB (WO 97/13785 & WO 97/32980), OmpE, UspA1 und UspA2 (WO 93/03761), FhaB (WO 99/58685) und Omp21. Sie sind auch als Gene bevorzugt, die heterolog in andere Gram-negative Bakterien eingeführt werden können.

Eines oder mehrere der folgenden Gene sind bevorzugt zur Abregulation über Verfahren a): CopB, OMP106, OmpB1, TbpA, TbpB, LbpA und LbpB.

Eines oder mehrere der folgenden Gene sind bevorzugt zur Abregulation über Verfahren c): htrB, msbB und IpxK (am meisten bevorzugt msbB).

Eines oder mehrere der folgenden Gene sind bevorzugt zur Aufregulation über Verfahren d): pmrA, pmrB, pmrE und pmrF.

Viele der obigen offenen Leseraster und stromaufwärts gelegenen Regionen werden in WO 01/09350 beschrieben.

Bevorzugte Haemophilus influenzae-Bläschenzubereitungen

Eines oder mehrerer der folgenden Gene (die schützende Antigene codieren) sind bevorzugt zur Aufregulation über Verfahren b): D15 (WO 94/12641), P6 (EP 281673), TbpA, TbpB, P2, P5 (WO 94/26304), OMP26 (WO 97/01638), HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Hap, Hin47, Iomp1457 (GB 0025493.8), YtfN (GB 0025488.8), VirG (GB 0026002.6), Iomp1681 (GB 0025998.6), OstA (GB 0025486.2) und Hif (alle Gene in diesem Operon sollten aufreguliert werden, um Pilin aufzuregulieren). Sie sind auch bevorzugt als Gene, die heterolog in andere Gram-negative Bakterien eingeführt werden können.

Eines oder mehrere der folgenden Gene sind bevorzugt zur Abregulation über Verfahren a): P2, P5, Hif, IgA1-Protease, HgpA, HgpB, HMW1, HMW2, Hxu, TbpA und TbpB.

Eines oder mehrere der folgenden Gene sind bevorzugt zur Abregulation über Verfahren c): htrB, msbB und LpxK (am meisten bevorzugt msbB).

Eines oder mehrere der folgenden Gene sind bevorzugt zur Aufregulation über Verfahren d): pmrA, pmrB, pmrE und pmrF.

Viele der obigen offenen Leseraster und stromaufwärts gelegenen Regionen werden in WO 01/09350 beschrieben.

Zubereitungen von Membranvesikeln (Bläschen) der Erfindung

Die Herstellung von Bläschenzubereitungen aus beliebigen der zuvor genannten modifizierten Stämme kann durch Ernten von natürlich durch die Bakterien abgestoßenen Bläschen oder durch jedes der einem Fachmann wohlbekannten Verfahren erreicht werden (z.B. wie in EP 301992, US 5,597,572, EP 11243 oder US 4,271,147 offenbart). Für Neisseria wird bevorzugt das im nachfolgenden Beispiel beschriebene Verfahren verwendet.

Bevorzugt kann die Zubereitung von Membranvesikeln durch eine 0,22 &mgr;m-Membran filtriert werden.

Eine sterile (bevorzugt homogene) Zubereitung von Membranvesikeln, die durch Leiten der Membranvesikel durch eine 0,22 &mgr;m-Membran erhältlich ist, wird ebenfalls erwogen.

Impfstofformulierungen

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Formulierung der Bläschenzubereitungen der Erfindung in einem Impfstoff, der auch einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten umfassen kann.

Die Impfstoffherstellung wird allgemein beschrieben in "Vaccine Design-The subunit and adjuvant approach", Hrsg. M.F. Powell & M.J. Newman, (1995) Plenum Press, New York).

Die Bläschenzubereitungen der vorliegenden Erfindung können in der Impfstofformulierung der Erfindung mit Hilfsstoff versetzt werden. Geeignete Hilfsstoffe schließen ein Aluminiumsalz wie Aluminiumhydroxidgel (Alaun) oder Aluminiumphosphat ein, aber können auch ein Salz von Calcium (insbesondere Calciumcarbonat), Eisen oder Zink sein, oder können eine unlösliche Suspension von acyliertem Tyrosin oder acylierten Zuckern, kationisch oder anionisch derivatisierten Polysacchariden oder Polyphosphazenen sein.

Geeignete Th1-Hilfsstoffsysteme, die verwendet werden können, schließen Monophosphoryllipid A, insbesondere 3-des-O-acyliertes Monophosphoryllipid A, und eine Kombination aus Monophosphoryllipid A, bevorzugt 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A (3D-MPL), zusammen mit einem Aluminiumsalz ein. Ein gesteigertes System ivolviert die Kombination eines Monophosphoryllipid A und eines Saponin-Derivats, insbesondere die Kombination aus QS21 und 3D-MPL, wie in WO 94/00153 offenbart, oder eine weniger reaktogene Zusammensetzung, worin das QS21 mit Cholesterin abgeschreckt ist, wie in WO96/33739 offenbart. Eine besonders wirksame Hilfsstoffformulierung, die QS21, 3D-MPL und Tocopherol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion beinhaltet, wird in WO95/17210 beschrieben und ist eine bevorzugte Formulierung.

Der Impfstoff kann ein Saponin umfassen, besonders bevorzugt QS21. Er kann auch eine Öl-in-Wasser-Emulsion und Tocopherol umfassen. Unmethylierte CpG-haltige Oligonukleotide (WO 96/02555) sind auch bevorzugte Induktoren einer TH1-Reaktion und sind geeignet zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung.

Die Impfstoffzubereitung der vorliegenden Erfindung kann zum Schützen oder Behandeln eines für eine Infektion anfälligen Säugetiers mittels Verabreichung des Impfstoffs über den systemischen oder mukosalen Weg verwendet werden. Diese Verabreichungen können die Injektion über die intramuskulären, intraperitonealen, intradermalen oder subkutanen Wege; oder über die mukosale Verabreichung in die oralen/Ernährungs-, respiratorischen oder urogenitalen Trakte einschließen.

Die Menge an Antigen in jeder Impfstoffdosis wird als eine Menge ausgewählt, die eine immunprotektive Reaktion ohne signifikante, nachteilige Nebenwirkungen in typischen Impflingen induziert. Eine solche Menge wird in Abhängigkeit davon variieren, welches spezifische Immunogen eingesetzt wird und wie es präsentiert wird. Allgemein wird erwartet, daß jede Dosis 1–100 &mgr;g Proteinantigen, bevorzugt 5–50 &mgr;g und besonders typisch im Bereich von 5–25 &mgr;g umfassen wird.

Eine optimale Menge für einen besonderen Impfstoff kann durch Standardstudien sichergestellt werden, die die Beobachtung von geeigneten Immunreaktionen in Probanden beinhalten. Nach einer Erstimpfung können Probanden ein oder mehrere Auffrischungsimpfungen in angemessenem Abstand erhalten.

Ghost- oder abgetötete Ganzzellimpfstoffe

Die Erfinder erwägen, daß die obigen modifizierten bakteriellen Stämme nicht nur nützlich in der Erzeugung von Bläschenzubereitungen sein können, die nützlich in Impfstoffen sind – sie können auch leicht zur Herstellung von Ghost- oder abgetöteten Ganzzellzubereitungen und -Impfstoffen (mit identischen Vorteilen) verwendet werden. Verfahren zur Herstellung von Ghost-Zubereitungen (leere Zellen mit intakten Hüllen) aus Gram-negativen Stämmen sind allgemein fachbekannt (siehe zum Beispiel WO 92/01791). Verfahren zum Abtöten von ganzen Zellen zur Herstellung inaktivierter Zellzubereitungen zur Verwendung in Impfstoffen sind ebenfalls wohlbekannt. Die Begriffe "Bläschenzubereitungen" und "Bläschenimpfstoffe" sowie die in diesem Dokument beschriebenen Verfahren sind deshalb auf die Begriffe "Ghost-Zubereitung" und "Ghost-Impfstoff" bzw. "abgetötete Ganzzellzubereitung" und "abgetöteter Ganzzellimpfstoff" für die Zwecke dieser Erfindung anwendbar.

Beispiele

Die nachfolgenden Beispiele werden unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die den Fachleuten wohlbekannt und für sie Routine sind, ausgenommen wenn im Detail anders beschrieben. Die Beispiele sind illustrativ, aber beschränken nicht die Erfindung.

Beispiel 1: Zuvor angegebene Beispiele

Die Beispiele wurden in WO 01/09350 beschrieben: Konstruktion eines Neisseria meningitidis Serogruppe B-Stammes, dem Kapselpolysaccharide fehlen; Konstruktion von vielseitigen Genübertragungsvektoren (die pCMK-Reihe), die die Integration in den porA-Locus von Neisseria meningitidis ausrichten; Konstruktion eines Neisseria meningitidis Serogruppe B-Stammes, dem sowohl Kapselpolysaccharide als auch das hauptsächliche immundominante Antigen PorA fehlen; Aufregulation der NspA-Außenmembranproteinproduktion in Bläschen, die aus einem rekombinanten Neisseria meningitidis Serogruppe B-Stamm stammen, dem funktionelle porA- und cps-Gene fehlen; Aufregulation des D15/Omp85-Außenmembranproteinantigens in Bläschen, die aus einem rekombinanten Neisseria meningitidis Serogruppe B-Stamm stammen, dem funktionelle cps-Gene fehlen, der aber PorA exprimiert; Konstruktion von vielseitigen Promotorübertragungsvektoren; Fermentationsverfahren zur Erzeugung rekombinanter Bläschen; Identifizierung von bakteriellen Promotoren, die zur Aufregulation von Antigen-codierenden Genen geeignet sind; Aufregulation des N. meningitidis Serogruppe B Omp85-Gens durch Promotoraustausch; Aufregulation des Hsf-Proteinantigens in einem rekombinanten Neisseria meningitidis Serogruppe B-Stamm, dem funktionelle cps-Gene fehlen, der aber PorA exprimiert; Expression des grün fluoreszierenden Proteins in einem rekombinanten Neisseria meningitidis Serogruppe B-Stamm, dem funktionelle cps-Gene fehlen, der aber PorA exprimiert; Aufregulation des N. meningitidis Serogruppe B NspA-Gens durch Promotoraustausch; Aufregulation des N. meningitidis Serogruppe B pldA-(omp1A)-Gens durch Promotoraustausch; Aufregulation des N. meningitidis Serogruppe B tbpA-Gens durch Promotoraustausch; Aufregulation des N. meningitidis Serogruppe B pilQ-Gens durch Promotoraustausch; Konstruktion einer kanR/sacB-Kassette zur Einführung von "sauberen", unmarkierten Mutationen in das N. meningitidis-Chromosom; Verwendung von kleinen rekombinogenen Sequenzen (43 bp), um die homologe Rekombination im Chromosom von Neisseria meningitidis zu erlauben; aktiver Schutz von mit WT und rekombinanten Neisseria meningitidis-Bläschen immunisierten Mäusen; und Immunogenität von rekombinanten Bläschen, gemessen durch Ganzzell- und spezifische ELISA-Verfahren.

Beispiel 2: Gonokokkenbläschen, die Chlamydia trachomatis-Proteine auf ihrer Oberfläche exprimieren, zur Verwendung in einer Impfstoffzusammensetzung

Sowohl Chlamydia trachomatis als auch N. gonorrhoeae verursachen geschlechtlich übertragene Krankheiten, die Urethritis, Cervicitis, Salpingitis und entzündliche Beckenerkrankung einschließen. Eine gemischte Infektion mit sowohl CT als auch GC tritt auf. Deshalb schafft in der Entwicklung eines Impfstoffs, der auf eine oder mehrere dieser Krankheiten abzielt, die Möglichkeit, Schutz gegen beide Organismen mit einer Einzelformulierung zu liefern, einen technischen Vorteil.

Schutz gegen N. gonorrhoeae

N. gonorrhoeae OMV-Impfstoff kann auch Bläschen-erzeugendem Stamm (Stämmen) erhalten werden, in dem die Expression eines oder mehrerer Gene auf- oder abreguliert wurde. Eine Liste von Genen, die N. gonorrhoeae-Proteine codieren, für die es besonders nützlich ist, die Regulation auf/abzuregulieren, ist oben bereitgestellt.

Ein erfolgreicher Impfstoff zur Prävention von Infektion durch N. gonorrhoeae kann mehr als eines der folgenden Elemente erfordern: Erzeugung von Serum- und/oder mukosalen Antikörpern zur Erleichterung der Komplement-vermittelten Abtötung des Gonucoccus und/oder zur Steigerung von Phagozytose und mikrobieller Abtötung durch Leukozyten wie polymorphkernige Leukozyten und/oder zur Verhinderung der Anhaftung der Gonokokken an den Wirtsgeweben; Induzierung einer Zell-vermittelten Immunreaktion kann ebenfalls zum Schutz beitragen.

Das Potential einer Bläschen-Gonokokken-Impfstoffzubereitung kann durch Analysieren der induzierten Immunreaktion auf Serum- und/oder mukosale Antikörper ausgewertet werden, die Antianhaftung und/oder opsonisierende Eigenschaften und/oder bakterizide Aktivität besitzen, wie von anderen beschrieben (D. McChesney et al., Infect. Immun. 36: 1006, 1982; J. Boslego et al.: "Efficacy trial of a purified gonococcal pilus vaccine", Programm und Zusammenfassung der 24. Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Whashington, Amercian Society for Microbiology, 1984; M. Siegel et al., J. Infect. Dis. 145:300, 1982; de la Pas, Microbiology, 141 (Pt4): 913–20, 1995).

Ein Mäusemodell von genitaler Infektion durch N. gonorrhoeae wurde kürzlich beschrieben (M. Plante, J. Infect. Dis., 182: 848–55, 2000). Die Wirksamkeit eines Bläschen-Gonokokkenimpfstoffs könnte auch durch seine Fähigkeit zur Prävention oder zur Reduzierung der Besiedelung durch N. gonorrhoeae in diesem Mäusemodell der Infektion ausgewertet werden.

Schutz gegen CT

Ein GC/CT-Bläschenimpfstoff kann aus einem Stamm erhalten werden, der ein oder mehrere Chlamydiagene exprimiert, bevorzugt ausgewählt aus der obigen Liste von Genen, die vorhergesagte Außenmembranproteine codieren.

Andere Gene von Interesse zur Überexpression in Neisseria sind C. trachomatis-Gene, für die kein Homolog in C. pneumoniae gefunden wurde. Ein solcher Satz von Genen wurde beschrieben in S. Richard, "Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis and Immunity", S. 9–27, Stephens, Hrsg., ASM Press, Washington DC, ISBN: 1-55581-155-8, Seiten: 380.

Die am meisten bevorzugten Kombinationen von Chlamydia trachomatis-Genen sind wie folgt: Hauptaußenmembranprotein MOMP (aus einem oder mehreren unterschiedlichen Serovars) und das Außenmembranproteinanalogon (auch als PorB bekannt), MOMP (aus einem oder mehreren unterschiedlichen Serovars) und das mutmaßliche Außenmembranprotein G (pmpG); und PorB und pmpG.

Obwohl die Immunität gegen CT nicht vollständig verstanden wird, gibt es Hinweise, daß Antikörper eine Rolle im Schutz spielen. Antikörper gegen CT in Genitalflüssigkeiten wurden mit Immunität gegen CT in Verbindung gebracht (R.C. Brunham, Infect Immun. März 1983, 39(3): 149-4). Eine schützende Rolle von Serumantikörper in der Immunität gegen genitale Chlamydia-Infektion wurde ebenfalls gezeigt (R.G. Rank, Infect. Immun., Jan. 1989; 57(1): 299–301). Es wurde ebenfalls gezeigt, daß Antikörper, z.B. MOMP-spezifische Antikörper, eine CT-Infektion in vitro und in vivo neutralisieren können (Caldwell et al., 1982, Infect. Immun. 38: 745–54, Lucero et al., 1985, Infect. Immun. 50: 595–97, Zhang et al., 1987, J. Immunol. 138: 575–581). Es wurde ebenfalls gezeigt, daß das MOMP-Oberflächenantigen von CT nicht-lineare Oberflächenepitope trägt, die das Ziel neutralisierender Antikörper sind (J. Fan, J. Infect. Dis. 1997, 176(3): 713–21).

Somit schließt ein wichtiges Ziel in der Konstruktion eines schützenden Chlamydia-Impfstoffs die Identifizierung einer Formulierung (Formulierungen) der CT-Antigene ein, die die Induzierung einer Chlamydia-spezifischen Antikörperreaktion optimieren können. Die Optimierung der Antikörperreaktion schließt das Abzielen auf die genitale Schleimhaut und/oder die Präsentation von angemessen gefalteten Chlamydia-Antigenen und/oder die Kombination mehrerer Antikörperziele ein.

Die mukosale Ausrichtung der Immunreaktion gegen Chlamydia-Antigen kann durch mukosale Verabreichung des Impfstoffs erreicht werden. Die intranasale Verabreichung eines Außenmembranvesikelimpfstoffs kann andauernde lokale mukosale Antikörper und Serumantikörper mit starker bakterizider Aktivität in Menschen induzieren.

Für bestimmte B-Zellepitope wie nicht-lineare Epitope ist die Präsentation des Antigens für das Immunsystem in einer geeignet gefalteten Weise kritisch. Ein aus einem Stamm, der Chlamydia-Antigen e) exprimiert, hergestellter Bläschenimpfstoff bietet für Chlamydia-OMP eine Außenmembranumgebung, die kritisch zur Aufrechterhaltung dieser Antigene in einer geeignet gefalteten Struktur sein kann.

Die Kombination mehrerer Antikörperziele kann eine erhöhte Wirksamkeit durch Angreifen der Infektion zu unterschiedlichen Schritten des Lebenszyklus der Bakterien schaffen, wie zum Beispiel bei der Adhäsion an die Wirtszelle, Internalisierung durch die Wirtszelle und/oder Wechselwirkung mit weiteren Schritten der intrazellulären Entwicklung.

Die Induzierung und Rekrutierung von Th1-Zellen in die lokalen genitalen Schleimhäute sind wichtig für die Immunität gegen Chlamydia. Somit schließt ein wichtiges Ziel in der Konstruktion eines schützenden Anti-Chlamydia-Impfstoffs die Identifizierung einer Formulierung (Formulierungen) von CT-Antigen(en) ein, die die Induzierung von Chlamydia-spezifischen Th1-Zellen und bevorzugt die Rekrutierung dieser Zellen in die genitalen Schleimhäute optimieren kann. Ein aus einem Stamm, der Chlamydia-Antigen(e) exprimiert, hergestellter Bläschenimpfstoff kann eine Chlamydia-spezifische CMI-Reaktion induzieren. Antigen-spezifische T-Zellreaktionen können in Menschen nach intranasaler Immunisierung mit einem Außenmembranvesikelimpfstoff induziert werden.

Ein besonderer Vorteil eines GC/CT-Bläschenimpfstoffs ist seine Fähigkeit zur Induzierung von sowohl Antikörper- als auch CMI-Reaktionen.

Die Wirksamkeit des GC/CT-Bläschenimpfstoffs kann durch seine Fähigkeit zur Hervorrufung von Antigen- oder Chlamydia-spezifischen Antikörper- und/oder CMI-Reaktionen ausgewertet werden. Antikörper-Reaktionen können durch klassische Techniken wie ELISA oder Western-Blot ausgewertet werden. Bevorzugt können die induzierten Antikörper die Infektiosität von Chlamydia in einem in-vitro-Test neutralisieren (G. Byrne et al., J. Infect. Dis., Aug. 1993; 168(2): 415–20). Bevorzugt ist die CMI-Reaktion zum Th1-Phänotyp verschoben. Eine Th1-verschobene Immunreaktion kann durch erhöhte Antigenspezifische IgG2a/IgG1-Verhältnisse in Mäusen beurteilt werden (Snapper et al., 1987, Science 236:944–47). Ein erhöhtes Verhältnis von Th1/Th2-Cytokin, z.B. ein erhöhtes IFN-gamma/IL-5-Verhältnis, nach in-vitro-Restimulation von Immun-T-Zellen mit dem Antigen (Antigenen) kann auch eine solche verschobene Th1-Reaktion anzeigen.

Die Fähigkeit der Formulierung, Antigen-spezifische mukosale Antikörper hervorzurufen, ist von besonderem Interesse und kann durch Detektion von Antikörpern wie IgG und/oder IgA in mukosalen Flüssigkeiten wie Sekreten des Genitaltrakts und Vaginalspülungen gezeigt werden. In dieser Hinsicht kann ein bestimmter Verabreichungsweg des Impfstoffs besonders erwünscht sein, wie intranasale, orale, intravaginale und intradermale Übertragungen.

Die Wirksamkeit des GC/CT-Bläschenimpfstoffs kann durch seine Fähigkeit zur Induzierung von Schutz gegen eine Chlamydia-Exposition in einem Tiermodell (Tiermodellen) ausgewertet werden. Beispiele für solche Tiermodelle wurden in der Literatur beschrieben: genitale Infektion mit MoPn in Mäusen (Barron et al., J. Infect. Dis. 1143:63–66), genitale Infektion mit humanen Stämmen in Mäusen (Igietseme et al., 2000, Infect. Immun. 68:6798–806, Tuffrey et al. 1992, J. Gen. Microbiol. 138: 1707–1715), genitale Infektion mit einem GPIC-Stamm in Meerschweinchen (Rank et al., 1992, Am. J. Pathol. 140:927–936). Schutz gegen Infektion kann durch Reduzierung der abgesonderten Chlamydien aus dem infizierten Ort und/oder eine Reduzierung der histopathologischen Reaktionen nach einer Kontaktinfektion in immunisierten Tieren getestet werden.

Der Vorteil der Kombination von zwei oder mehr Chlamydia-Antigenen (wie oben beschrieben) kann durch eine oder mehrere der folgenden Techniken ausgewertet werden:

  • – Fähigkeit zur Hervorrufung einer mehrschichtigen Antikörper- und/oder T-Zell-Schutzreaktion.
  • – Fähigkeit zur Hervorrufung von Antikörpertitern in einem neutralisierenden Test in vitro und/oder von neutralisierendem Antikörper gegen mehrfache Stämme (antigenisch verschieden)
  • – Fähigkeit zur Hervorrufung einer Schutzimmunreaktion gegen Chlamydia in einem Mäusemodell der genitalen Infektion gemäß Test durch eine reduzierte Absonderung von Bakterien und/oder Pathologie nach Exposition.

Beispiel 3: Expression von heterologen Antigenen (Chlamydia trachomatis MOMP und PorB) in Bläschen, die aus einem rekombinanten Neisseria meningitidis Serogruppe B-Stamm stammen, dem funktionale porA- und cps-Gene fehlen

Andere Gene von Interesse zur Überexpression in Neisseria sind Chlamydia trachomatis-Gene, für die kein Homolog in Chlamydia pneumoniae gefunden wurde. Darunter wurde gezeigt, daß das Hauptaußenmembranprotein (MOMP) und das Außenmembranproteinanalogen (PorB) eine schützende Rolle gegen genitale Chlamydia-Infektion spielen. Die Optimierung der Antikörperreaktion könnte durch Präsentation von geeignet gefalteten Proteinen erreicht werden.

MenB-Bläschenvesikel können als Übertragungsvektoren zur Expression heterologer Membranproteinantigene unter der Kontrolle des veränderten porA-lacO-Promotors verwendet werden, der in WO 01/09350 beschrieben wird. Exprimiert im Bläschenzusammenhang können rekombinantes MOMP und PorB aus Chlamydia trachomatis Serovar D und K in der Membran korrekt gefaltet und an der Oberfläche exponiert werden. Neisseria meningitidis-Stämme, denen funktionelle cps-Gene fehlen, werden vorteilhaft als Empfängerstämme zur Expression der heterologen Antigene verwendet (WO 01/09350).

PCR-Amplifikationen der Gene, die für MOMP codieren (Chlamydia trachomatis)

Murine McCoy-Zellen (ATCC), die mit entweder Chlamydia trachomatis Serovar K (UW31-CX-serK) oder Serovar D (UW31-CX-serD) infiziert waren, wurden in 400 &mgr;l Lysepuffer lysiert: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 2,5 mM MgCl2, 0,45 % Nonidet P40, 0,45 % Tween 20, enthaltend 60 &mgr;g/ml Proteinase K, 3 Stunden bei 56°C. 10 &mgr;l des Lysats wurden als Matrize zur Amplifizierung der entsprechenden Gene verwendet. Das Gen, das für MOMP codiert (Serovar K) (SEQ ID NO:1 unten), wurde unter Verwendung der Oligonukleotidprimer CYK/OMP/5/NDE und CYKD/OMP/3/BG PCR-amplifiziert (siehe Tabelle 1). Das Gen, das für MOMP codiert (Serovar D) (SEQ ID NO:2 unten), wurde unter Verwendung der Oligonukleotidprimer CYD/OMP/5/NRU und CYKD/OMP/3/BG PCR-amplifiziert (siehe Tabelle 1). Die für die PCR-Amplifikation verwendeten Bedingungen waren die vom Lieferanten beschrieben (HiFi DNA-Polymerase, Boehringer Mannheim GmbH). Der Thermozyklus war der folgende: 25-mal (94°C 1 min., 52°C 1 min, 72°C 3 min) und einmal (72°C 10 min, 4°C bis zur Gewinnung). Die entsprechenden Amplikons (1194 bp) wurden mit entweder NdeI/BglII- oder NruI/BglI2-Restriktionsenzymen verdaut und können in die entsprechenden Restriktionsorte von pCMK(+)-Übertragungsvektor kloniert werden (wie in WO 01/09350 beschrieben).

PCR-Amplifikationen der Gene, die für PorB codieren (Chlamydia trachomatis)

Murine McCoy-Zellen (ATCC), die mit entweder Chlamydia trachomatis Serovar K (UW31-CS-serK) oder Serovar D (UW31-CX-serD) infiziert waren, wurden in 400 &mgr;l Lysepuffer lysiert: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 2,5 mM MgCl2, 0,45 % Nonidet P40, 0,45 % Tween 20, enthaltend 60 &mgr;g/ml Proteinase K, 3 Stunden bei 56°C. 10 &mgr;l des Lysats wurden als Matrize zur Amplifikation der entsprechenden Gene verwendet.

PorB-Sequenzen sind hoch konserviert unter den Serovars D und K (SEQ ID NO:3 unten). Die gleichen Primer wurden zur Amplifikation der entsprechenden Gene in beiden Serovars verwendet: CYD/PORB/5/NRU und CYD/PORB/3/BG (siehe Tabelle 1). Die für die PCR-Amplifikation verwendeten Bedingungen waren die vom Lieferanten beschriebenen (HiFi DNA-Polymerase, Boehringer Mannheim GmbH). Der Thermozyklus war wie folgt: 25-mal (94°C 1 min, 52°C 1 min, 72°C 3 min) und 1-mal (72°C 10 min, 4°C bis zur Gewinnung). Die entsprechenden Amplikons (1035 bp) wurden mit NruI/BglII-Restriktionsenzymen verdaut und können in die entsprechenden Restriktionsorte von pCMK(+)-Übertragungsvektor kloniert werden (wie in WO 01/09350 beschrieben).

Transformation

Linearisierte rekombinante pCMK-Plasmide können innerhalb eines Neisseria meningitidis-Serogruppe B-Stammes transformiert werden, dem funktionelle cps-Gene fehlen (beschrieben in WO 01/09350). Die aus einem Doppel-Crossing-over zwischen den pCMK-Vektoren und dem chromosomalen porA-Locus resultierende Integration kann durch eine Kombination von PCR und Western-Blot-Durchmusterung wie in WO 01/09350 beschrieben selektiert werden.

Tabelle 1: In dieser Arbeit verwendete Oligonukleotide

SEQ ID NO:1 Nukleotidsequenz von DNA, die für Chlamydia trachomatis MOMP Serovar K-Protein codiert.

SEQ ID NO:2 Nukleotidsequenz von DNA, die für Chlamydia trachomatis MOMP Serovar D-Protein codiert.

SEQ ID NO:3 Nukleotidsequenz von DNA, die für Chlamydia trachomatis PorB Serovar D-Protein codiert.

Beispiel 4: Isolierung und Reinigung von Bläschen von Menigokokken, denen Kapselpolysaccharid fehlt

Rekombinante Bläschen können wie nachfolgend beschrieben gereinigt werden. Die Zellpaste (42 g) wird in 211 ml von 0,1 M Tris-Cl-Puffer, pH 8,6, der 10 mM EDTA und 0,5 % Natriumdesoxychlolat (DOC) enthält, suspendiert. Das Verhältnis von Puffer zu Biomasse sollte 5/1 (V/G) sein. Die Biomasse wird durch Rühren mit einem Magnetrührer für 30 Minuten bei Raumtemperatur extrahiert. Der Gesamtextrakt wird dann mit 20 000 g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert (13 000 U/min in einem JA-20-Rotor, Beckman J2-HS-Zentrifuge). Das Pellet sollte verworfen werden. Der Überstand wird mit 125 000 g für 2 Stunden bei 4°C ultrazentrifugiert (40 000 U/min in einem 50.2 Ti-rotor, Beckman L8-70M-Ultrazentrifuge), um Vesikel aufzukonzentrieren. Der Überstand sollte verworfen werden. Das Pellet wird vorsichtig in 25 ml von 50 mM Tris-Cl-Puffer, pH 8,6, der 2 mM EDTA, 1,2 % DOC und 20 % Saccharose enthält, suspendiert. Nach einem zweiten Ultrazentrifugenschritt mit 125 000 g für 2 Stunden bei 4°C werden die Vesikel vorsichtig in 44 ml 3%iger Saccharose suspendiert und bei 4°C gelagert. Alle für die Bläschenextraktion und Reinigung verwendeten Lösungen enthielten 0,01 % Thiomersalat. Wie in WO 01/019350 veranschaulicht, liefert dieses Verfahren Proteinzubereitungen, die stark mit Außenmembranproteinen angereichtert sind.

Beispiel 5: Modelle zur Untersuchung von Schutz gegen Gonokokken- und C. trachomatis-Infektion

Die kann wie oben in Beispiel 2 beschrieben erfolgen. Zusätzlich ist Whittum-Hudson et al. (Vaccine 16. Juli 2001; 19(28–29): 4061–71), "The anti-idiotypic antibody to chlamydial glycolipid exoantigen (GLXA) protects mice against genital infection with a human biovar of Chlamydia trachomatis", ein vaginales Impfmodell für C. trachomatis, das auch zur Untersuchung von Impfstoffwirksamkeit verwendet werden kann.

SEQUENZPROTOKOLL


Anspruch[de]
Gram-negatives bakterielles Bläschen, das nicht aus Chlamydia stammt und auf seiner Oberfläche das PorB-Außenmembranprotein von Chlamydia trachomatis präsentiert, worin die Kombination des Chlamydia-Antigens mit den nativen Gram-negativen bakteriellen Bläschenantigenen in der Prävention oder Behandlung von Salpingitis, bei Vorhandensein in einer Impfstofformulierung, wechselwirkt. Gram-negatives Bläschen gemäß Anspruch 1, das ferner auf seiner Oberfläche die PmpG-Außenmembranproteine von Chlamydia trachomatis präsentiert. Gram-negatives Bläschen gemäß Anspruch 1, das ferner auf seiner Oberfläche MOMP aus einem oder mehreren Serovars von Chlamydia trachomatis präsentiert. Gram-negatives Bläschen, das nicht aus Chlamydia stammt und auf seiner Oberfläche sowohl die PmpG- als auch MOMP-(aus einem oder mehreren Serovars)Außenmembranproteine von Chlamydia trachomatis präsentiert, worin die Kombination der Chlamydia-Antigene mit den nativen Gram-negativen bakteriellen Bläschenantigenen in der Prävention oder Behandlung von Salpingitis, bei Vorhandensein in einer Impfstofformulierung, wechselwirkt. Bläschen gemäß Ansprüchen 1 bis 4, die Gonokokkenbläschen sind. Bläschen gemäß Anspruch 5, das aus einem Gonokokkenstamm stammt, der zur Aufregulierung eines oder mehrerer Gonokokken-Außenmembran-Schutzantigene modifiziert wurde. Bläschen gemäß Ansprüchen 5 und 6, das aus einem Gonokokkenstamm stammt, der zur Abregulierung eines oder mehrerer immundominanter variabler oder nicht-schützender Gonokokken-Außenmembranantigene modifiziert wurde. Bläschen gemäß Ansprüchen 5 bis 7, das aus einem Stamm stammt, der einen entgifteten Lipid A-Anteil von bakteriellem LPS aufgrund der Tatsache hat, daß der Stamm verändert wurde, um die Expression eines oder mehrerer Gene zu reduzieren oder auszuschalten, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus htrB, msbB und lpxK besteht. Bläschen gemäß Ansprüchen 5 bis 8, worin die Bläschenzubereitung aus einem Stamm stammt, der einen entgifteten Lipid A-Anteil von bakteriellem LPS aufgrund der Tatsache hat, daß der Stamm verändert wurde, um ein oder mehrere Gene mit höherer Stärke zu exprimieren, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus pmrA, pmrB, pmrE und pmrF besteht. Impfstoffzusammensetzung, die das Bläschen gemäß Ansprüchen 1 bis 9 und einen pharmazeutisch geeigneten Exzipienten oder Träger umfaßt. Impfstoff gemäß Anspruch 10, der zusätzlich einen mukosalen Hilfsstoff umfaßt. Verwendung des Bläschens gemäß Ansprüchen 1 bis 9 in der Herstellung eines Impfstoffs zur Prävention von Chlamydia trachomatis-Infektion in einem Wirt, umfassend die Schritte der Verabreichung einer wirksamen Menge des Impfstoffs gemäß Anspruch 10 oder 11 an einen Wirt, der dessen bedarf. Verwendung gemäß Anspruch 12, worin der Impfstoff mukosal über einen entweder intranasalen, oralen oder intravaginalen Weg verabreicht wird. Gram-negatives Bläschen, das von Neisseria meningitidis, Moraxella catharralis oder Haemophilus influenzae erzeugt wird und auf seiner Oberfläche ein Schutzantigen von Chlamydia pneumoniae präsentiert. Gram-negatives Bläschen gemäß Anspruch 14, das auf seiner Oberfläche ein PorB-Außenmembranprotein von Chlamydia pneumoniae präsentiert. Gram-negatives Bläschen gemäß Anspruch 15, das ferner auf seiner Oberfläche MOMP-Außenmembranprotein von Chlamydia pneumoniae präsentiert. Gram-negatives Bläschen gemäß Anspruch 15, das ferner auf seiner Oberfläche ein oder mehrere Pmp-Außenmembranproteine von Chlamydia pneumoniae präsentiert. Gram-negatives Bläschen gemäß Anspruch 15, das ferner auf seiner Oberfläche Npt1-Protein von Chlamydia pneumoniae präsentiert. Gram-negatives Bläschen gemäß Anspruch 14, das auf seiner Oberfläche ein oder mehrere Pmp-Proteine von Chlamydia pneumoniae präsentiert. Gram-negatives Bläschen gemäß Anspruch 19, das ferner auf seiner Oberfläche Npt1-Protein von Chlamydia pneumoniae präsentiert. Gram-negatives Bläschen gemäß Anspruch 19, das ferner auf seiner Oberfläche MOMP-Protein von Chlamydia pneumoniae präsentiert. Gram-negatives Bläschen gemäß Anspruch 14, das auf seiner Oberfläche MOMP-Protein von Chlamydia pneumoniae präsentiert. Gram-negatives Bläschen gemäß Anspruch 22, das ferner auf seiner Oberfläche Npt1-Protein von Chlamydia pneumoniae präsentiert. Bläschen gemäß Ansprüchen 14 bis 23, die Meningokokkenbläschen sind. Bläschen gemäß Anspruch 24, das aus einem Meningokokkenstamm stammt, der zur Aufregulierung eines oder mehrerer Meningokokken-Außenmembran-Schutzantigene modifiziert wurde. Bläschen gemäß Anspruch 24 oder 25, das aus einem Meningokokkenstamm stammt, der zur Abregulierung eines oder mehrerer immundominanter variabler oder nicht-schützender Meningokokken-Außenmembranantigene modifiziert wurde. Bläschen gemäß Ansprüchen 24 bis 26, das aus einem Stamm stammt, der einen entgifteten Lipid A-Anteil von bakteriellem LPS aufgrund der Tatsache hat, daß der Stamm verändert wurde, um die Expression eines oder mehrerer Gene zu reduzieren oder auszuschalten, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus htrB, msbB und lpxK besteht. Bläschen gemäß Ansprüchen 24 bis 27, worin die Bläschenzubereitung aus einem Stamm stammt, der einen entgifteten Lipid A-Anteil von bakteriellem LPS aufgrund der Tatsache hat, daß der Stamm verändert wurde, um ein oder mehrere Gene mit höherer Stärke zu exprimieren, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus pmrA, pmrB, pmrE und pmrF besteht. Impfstoffzusammensetzung, die das Bläschen gemäß Ansprüchen 14 bis 28 und einen pharmazeutisch geeigneten Exzipienten oder Träger umfaßt. Impfstoff gemäß Anspruch 29, der zusätzlich einen mukosalen Hilfsstoff umfaßt. Verwendung von Bläschen gemäß Ansprüchen 14 bis 28 in der Herstellung eines Impfstoffs zur Prävention von Chlamydia pneumoniae-Infektion in einem Wirt, umfassend die Schritte der Verabreichung einer wirksamen Menge des Impfstoffs gemäß Anspruch 29 oder 30 an einen Wirt, der dessen bedarf. Verwendung gemäß Anspruch 31, worin der Impfstoff mukosal über einen entweder intranasalen oder oralen Weg verabreicht wird.






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