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Dokumentenidentifikation DE69935603T2 06.12.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001115425
Titel INHIBITOREN VON AUTOANTIKÖRPERN
Anmelder The Regents of the University of California, Oakland, Calif., US
Erfinder GENAIN, Cl., San Francisco, CA, US;
HAUSER, St., San Francisco, CA, US
Vertreter Murgitroyd & Company, 48149 Münster
DE-Aktenzeichen 69935603
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 26.08.1999
EP-Aktenzeichen 999495559
WO-Anmeldetag 26.08.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/US99/19546
WO-Veröffentlichungsnummer 2000012126
WO-Veröffentlichungsdatum 09.03.2000
EP-Offenlegungsdatum 18.07.2001
EP date of grant 21.03.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 06.12.2007
IPC-Hauptklasse A61K 39/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61K 39/395(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   G01N 33/53(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Das Gebiet dieser Erfindung sind Polypeptid-Autoantikörper-Inhibitoren und Verfahren der Verwendung davon.

Hintergrund

Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische Krankheit mit rezidivierenden, remittierenden Störungen des zentralen Nervensystems, die 350 000 Amerikaner befällt und nach Traumata an zweiter Stelle der Hauptursachen einer Behinderung unter jungen Erwachsenen steht. MS ist eine Autoimmunerkrankung, pathologisch gekennzeichnet durch perivenuläre Infiltrate weißer Hirn- und Rückenmarkssubstanz, die Makrophagen und mononukleäre Zellen (Entzündung) beinhalten, und Zerstörung der Myelinscheiden, die Nervenfasern isolieren (Demyelinisierung).

Experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE) bei Nagetieren ist das am meisten gebrauchte Modell zum Untersuchen von Therapien für MS bei Menschen gewesen. Diese traditionellen Krankheitsmodelle für MS haben im Allgemeinen das Konzept gefördert, dass MS eine T-zellvermittelte Erkrankung ist. Die Autoantigene, die als Ziel für den Immunangriff dienen, sind jedoch nicht identifiziert worden, und die mit dem Myelinschaden verwickelten molekularen Mechanismen bleiben ungewiss. Während klar ist, dass eine Entzündung des ZNS bei EAE durch autoagressive T-Zellen ausgelöst wird, die Myelinantigene in dem Kontext von Molekülen der MHC-Klasse II erkennen, mangelt es vielen der Modelle an der frühen Demyelinisierungskomponente der MS-Läsion. Die Aktivierung von B-Zellen und die Reaktionen von Antikörpern erscheinen für die volle Entwicklung von EAE notwendig, und frühere Studien über autoimmune Demyeliniesierung unter Verwendung von myelinisierten Kulturen von ZNS-Gewebe haben humorale Faktoren als Effektor-Mechanismen angedeutet.

Somit ist es nicht überraschend, dass EAE bei Nagetieren kein stabiler Prädiktor der Wirksamkeit bei Menschen gewesen ist, da fundamentale Unterschiede bei dem klinischen Verlauf, der Symptomatik und der immunologischen Reaktion auf Myelinproteine EAE bei Nagetieren von MS bei Menschen unterscheiden.

Ein Beispiel einer derartigen Studie ist die von Linington et al. (Brain 112, 895-911, 1989), die die Rolle des Komplements in der Pathogenese von Demyelinisierung und Entzündung in einem synergistischen Modell akuter EAE bei der Lewis-Ratte erforscht haben.

Kürzlich wurde eine neue MS-artige Erkrankung bei einem nicht menschlichen Auszucht-Primaten, dem Weißbüscheläffchen Callithrix jacchus definiert. Die EAE bei Weißbüscheläffchen weist eine herausragende MS-artige frühe Demyelinisierungskomponente auf, die die Gegenwart Myelin-spezifischer Autoantikörper erfordert, und hat eine Gelegenheit geboten, die Wechselwirkung zwischen diesen Antikörpern und ihren Zielantigenen auf dem Myelin zu verstehen. Charakteristika des Modells umfassen Folgendes: a. milde klinische Befunde und einen rezidivierenden, remittierenden, MS-ähnlichen Verlauf; b. eine primäre demyelinisierende Symptomatik mit früher Gliose, die nicht von MS-Läsionen (demyelinisierenden Plaques) zu unterscheiden ist; c. natürlichen Knochenmarks-Chimärismus, der erfolgreiche adoptive Übertragung enzephalitogener (z. B. Krankheit hervorrufender) T-Zell-Klone und – Linien erlaubt; d. Diversität des enzephalitogenen Repertoires von T-Zellen, die dem Hauptmyelinprotein, dem Myelinbasisprotein (MBP), gegenüber reaktiv sind; e. unterschiedliche Krankheitsphänotypen, die von der Immunisierung mit unterschiedlichen Myelinbestandteilen herrühren: Im Gegensatz zu dem Gesamtmyelin produziert die Immunisierung mit MBP eine nicht demyelinisierende Form von EAE; f. Demonstration, dass Demyelinisierung antikörpervermittelt ist, aber ebenfalls eine enzephalitogene T-Zell-Reaktion erfordert, um den Zugang der Autoantikörper zu dem Nervensystem zu erleichtern; und g. eine Schlüsselrolle des Myelin-Oligodendrozyt-Glykoproteins (MOG) bei der Plaquebildung: adoptive Übertragung von Anti-MOG-Antikörpern bei nicht demyelinisierender MBP-EAE reproduziert eine voll entwickelte MS-ähnliche Symptomatik.

Die hoch immunogenen Eigenschaften von MOG (< 0,05 % des gesamten Myelinproteins) können mit seinem extrazellulären Standort auf den äußersten Lamellen der Myelinscheide zusammenhängen, wo es dem pathogenen Antkörper in dem Kontext einer Störung der Blut-Hirn-Schranke durch enzephalitogene T-Zellen zugänglich ist. Das C. jacchus-Modell erlaubt präzise Identifizierung zellulärer und humoraler Immunreaktionen, die zu einer MS-Läsion bei einer Art mit Immun- und Nervensystemgenen führen, die zu Menschen 90-95 % homolog sind. Die Relevanz dieses Modells für MS bei Menschen wird durch die kürzliche Erkenntnis über starke T-Zell- und Antikörperreaktionen auf MOG bei MS-Patienten hervorgehoben.

WO 95/07096 offenbart Verfahren zum Behandeln von MS unter Verwendung von MOG.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt die Verwendung eines Myelin-Oligodendrozyt-Glykoprotein(MOG)-Polypeptid-spezifischen Antikörperfragments, das keinen funktionellen Fc-Abschnitt aufweist, für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung einer Demyelinisierung, welche mit der Bindung eines Autoantikörpers an ein MOG-Polypeptid verbunden ist, durch das Verabreichen des Antikörperfragments an einen Wirt, der für eine pathogene Bindung zwischen MOG-Polypeptid und Autoantikörper anfällig ist, bereit.

Das Medikament kann ferner ein MOG-tolerogenes T-Zell-Epitop beinhalten.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich somit auf die Inhibierung einer pathogenen Bindung eines Autoantikörpers an ein Autoantigen, wobei die Bindung zwischen Autoantigen und Autoantikörper mit einer demyelinisierenden Krankheit des zentralen oder peripheren Nervensystems verbunden ist. In einer besonderen Ausführungsform ist die Krankheit mit einer pathogenen Autoantikörperbindung, wie etwa MS, Lupus, Arthritis oder Diabetes verbunden. In genaueren Ausführungsformen ist das Autoantigen ein MOG-Autoantigen, und das Fragment ist ein F(ab')2-Fragment.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Inhibieren der mit der Bindung eines Autoantikörpers an ein MOG-Polypeptid verbundenen Symptomatik, wie sie bei MS auftritt. Dies beinhaltet das Verabreichen einer effektiven Menge einer Zusammensetzung, die ein MOG-Polypeptid-spezifisches Antikörperfragment beinhaltet, das keinen funktionellen Fc-Abschnitt aufweist und ausreicht, um das MOG-Polypeptid spezifisch zu binden und die Bindung des Autoantikörpers an das MOG-Polypeptid kompetitiv zu inhibieren, an einen Wirt, der für eine pathogene Bindung zwischen MOG-Polypeptid und Autoantikörper anfällig ist, wodurch die Symptomatik inhibiert wird. In einer besonderen Ausführungsform wird das Fragment aus der Gruppe, bestehend aus Fv, F(ab')2, F(ab), F(ab)2 und Fragmenten davon, ausgewählt.

Die Zusammensetzungen umfassen pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein MOG-Polypeptid-spezifisches Antikörperfragment beinhalten, das ausreicht, um ein natürliches MOG-Polypeptid spezifisch zu binden und die Bindung eines Antikörpers an das MOG-Polypeptid kompetitiv zu inhibieren, wobei das Fragment keinen funktionellen Fc-Abschnitt beinhaltet, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Die Zusammensetzungen können ebenfalls ein MOG-tolerogenes T-Zell-Epitop beinhalten, das Toleranz hervorruft und synergistisch mit dem Antikörperfragment wirkt, um die Symptomatik zu inhibieren.

Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Antikörper" auf rekombinierte Immunproteine wie etwa T-Zell-Antigen-Rezeptoren und Immunoglobuline, wie auch auf chimäre, humanisierte oder andere rekombinante Antikörper. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Antikörperfragment" auf Fragmente von Antikörpern wie etwa Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 und Fv oder jede beliebige Kombination davon. Fv und Fragmente davon können einwertig oder zweiwertig sein. Fv ist auf dem Stand der Technik ebenfalls als ein minimales Antikörperfragment bekannt. Verfahren zur Fertigung von Antikörperfragmenten, insbesondere F(ab'), sind auf dem Stand der Technik bekannt. (Siehe zum Beispiel Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)). Zum Beispiel können F(ab), Fv usw. ebenfalls durch rekombinante Technologie produziert werden.

Wie hierin verwendet, bezieht sich „andere als natürliche MOG-angrenzende Reste von Menschen oder Weißbüscheläffchen" auf alles andere als Reste, die an die erwähnten Peptide in den arteigenen Proteinen natürlich angrenzen. Zum Beispiel umfassen andere als natürliche angrenzende Reste keine angrenzenden Reste oder angrenzende Reste, die sich von dem unterscheiden, was natürlicherweise an das erwähnte Peptid angrenzt.

MOG wurde ursprünglich durch den monoklonalen Antikörper 8.18.C5 von Mäusen identifiziert, der gegen zerebellare Glykoproteine von Ratten aufgebracht wurde. Es handelt sich um ein in geringen Mengen vorliegendes Protein, das lediglich 0,01 bis 0,05 % der gesamten Myelinproteine repräsentiert und keine bekannte Funktion innerhalb des ZNS aufweist. MOG ist ein Mitglied der Immunoglobulin(Ig)-Überfamilie mit einer immunoglobulin-ähnlichen, extrazellulären Domäne, die 121 Aminosäuren beinhaltet, welche eine Glykosylierungsstelle (Asn in Position 31) enthalten, und zwei hoch hydrophoben Regionen, die transmembrane Domänen repräsentieren könnten, für eine Gesamtlänge von 224 Aminosäuren. MOG wird weitläufig auf Oligodendrozyt-Zellkörpern und Fortsätzen exprimiert, vor allem auf den äußersten Schichten der Myelinscheiden, und kann dem Antikörperangriff möglicherweise leichter zugänglich sein als intrazytoplasmisches MBP oder intra- und intermembranöses Proteolipidapoprotein (PLP). Bei allen untersuchten Arten, einschließlich C. jacchus, genügt die glykosylierte, rekombinante extrazelluläre Domäne von MOG (rMOG), die hoch konserviert ist, zum Sensibilisieren von Tieren für EAE. Wir haben minimale T-Zell- und B-Zell-Epitope identifiziert, die die Reste 28-36, 13-21, 62-74, 27-34 oder 40-45 umfassen; natürliche MOG-Sequenzen bei Menschen und Ratten sind auf dem Stand der Technik bekannt; natürliches MOG bei Weißbüscheläffchen ist identisch mit dem von Menschen, abgesehen von den folgenden Substitutionen: 9S, 13Q, 19A, 20A, 42S, 60E, 75D, 84K, 91P, 112Q, 137F, 148Y und 151H.

Die Immunreaktion bei Autoimmunkrankheiten kann sowohl zelluläre als auch humorale Komponenten besitzen. Unsere Daten zeigen an, dass die folgende Sequenz an Vorgängen bei der Autoimmun-Demyelinisierung des ZNS zu einer Zerstörung von Myelin führt:

  • 1) Vakuolisierung von Myelin, die von löslichen Mediatoren (Zytokinen, Antikörpern, freien Radikalen) und/oder zellulärer Zytotoxizität verursacht wird. Ein Muster eines Intramyelin-Ödems, das ähnlich diesem ist, wurde ebenfalls zuvor in dem ZNS von Ratten beobachtet, die mit Triethylzinnsulfat vergiftet wurden, und interessanterweise waren diese Änderungen umkehrbar.
  • 2) Umwandlung von vakuolisiertem Myelin in Netze kleiner Vesikel, die durch 2-3 Schichten veränderten Myelins mit einer reduzierten Periodizität (5-6 nm) getrennt sind. Diese drastische Umwandlung scheint mit der Ablagerung von MOG-spezifischem IgG verbunden zu sein und antikörpervermittelte Schäden, möglicherweise aufgrund einer Komplementaktivierung, oder eine durch Makrophagen, die unveränderlich mit vesikulärer Myelinstörung verbunden sind, vermittelte antikörperabhängige Zytotoxizität, zu reflektieren. Es ist anzunehmen, dass die anfängliche vakuoläre Läsion die Myelin-Membranen zugänglich zu einem Angriff durch Autoantikörper macht.
  • 3) Aktivierung von Makrophagen, die zu rezeptorvermittelter Phagozytose der blasigen nekrotischen Myelin-Zelltrümmer führt. Dieser Mechanismus wurde zuvor bei MS und bei EAE demonstriert, wobei IgG als ein Ligand zwischen den nekrotischen Myelin-Zelltrümmern und den Fc-Rezeptoren in clathrinbeschichteten Vertiefungen auf der Oberfläche der Makrophagen gedient hat. Diese Stufe der Läsionspathogenese kann unabhängig von der Spezifität der Antikörper sein, obwohl sie antikörpervermittelt ist.

Wie gerade oben umrissen, ist zum Beispiel die entzündliche Komponente bei MS T-zellvermittelt, während die demyelinisierende Komponente B-zellvermittelt zu sein scheint. Somit sollten sich effektive Behandlungen gegen beide Komponenten richten.

Zusammensetzungen, die die immundominanten Epitope von MOG beinhalten, werden beschrieben. Die Aufhebung der peripheren T-Zell-Reaktion durch ein Tolerisierungsprotokoll an dem extrazellulären Abschnitt von rekombinantem MOG (aa 1-125) (rMOG; rMOG beinhaltet die Reste 1-125 des extrazellulären Aminoterminus von MOG, der durch MRGS an dem NH2-Terminus ausgedehnt ist, und ASES(H)6 an den COOH-Terminus) stellt die Basis für die epitopabgeleiteten Peptidzusammensetzungen bereit. Das Mapping der kritischen MOG-Epitope (einschließlich 26-38 und 64-72) wurde durch Klonen von T-Zellen von rMOG-immunisierten Tieren und durch Analysieren von T-Zell- und Antikörperreaktionen auf kurze Peptide von MOG bei rMOG-immunisierten Weißbüscheläffchen erreicht.

Das Mapping der Antikörperreaktion auf MOG bei C. jacchus zeigt eine eingeschränkte Heterogenität an Epitop-Erkennung durch Antikörper an. Wir haben unter Verwendung linearer Peptide Regionen von MOG identifiziert, an die sich demyelinisierende Antikörper anhaften. Die arteigenen polyklonalen Serumantikörper bei rMOG-immunisierten Weißbüscheläffchen werden gegen 4 diskrete Epitope entlang der Aminosäuresequenz aa 13-21, 28-34, 40-45, 65-74 oder kürzerer Sequenzen, von denen die meisten artenübergreifende konservierte Sequenzen sind, geleitet. Diese Peptide unterscheiden sich von denen, die bislang als Antikörper-Epitope bei Nagetieren (aa 35-55) identifiziert wurden, sie binden sich jedoch an Antikörper, die innerhalb des Netzes blasigen Myelins bei akuten Läsionen von MS beim Menschen gegenwärtig sind, wie in den Beispielen unten gezeigt. Da die meisten Antikörper im Allgemeinen diskontinuierliche Epitope auf Proteinen erkennen, stellt unsere Analyse-Methodologie die Kenntnis der Struktur von MOG bereit, die benötigt wird, um das antigene Repertoire von demyeliniesierenden Antikörpern bei dem C. jacchus und bei Menschen vollständig zu definieren. Kombinatorische Bibliotheken wurden dann gefertigt, um F(ab')2-Fragmente mit hoher Affinität zu MOG zu erzeugen, die die Fähigkeit besitzen, mit pathogenem IgG zu konkurrieren und komplementvermittelte und antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität zu inhibieren. Diese F(ab')2-Fragmente wurden alleine und in Kombination mit T-zelltolerogenen Peptiden auf ihre Fähigkeit untersucht, die Krankheit bei C. jacchus zu verhindern und zu behandeln.

Ein kürzlich identifizierter Patient mit einer fortschreitenden Rückenmarkserkrankung in Verbindung mit einer monoklonalen IgG-Gammopathie, die auf MOG reagiert, bot ein einzigartiges Beispiel der pathophysiologischen Konsequenzen einer Anti-MOG-Antikörperreaktion in einem natürlichen Experiment. Der menschliche monoklonale Antikörper wurde adoptiv auf einen C. jacchus mit nicht demyelinisierender EAE übertragen. Im Anschluss an die adoptive Übertragung entwickelte das Weißbüscheläffchen eine Demyelinisierung. Die Übertragung von menschlichem IgG bei dieser Art wird gut toleriert, und die Blockier-Fähigkeit von F(ab')2-Fragmenten wird in dem adoptiven Übertragungssystem demonstriert. Die Antikörperfragmente bewahren ihre Fähigkeit, antigene Epitope zu erkennen, besitzen jedoch nicht die Fähigkeit, das Komplement zu aktivieren oder Makrophagen zu binden, sie umhüllen das Autoantigen, so dass die endogenen Autoantikörper unfähig sind, eine pathologische Ebene zu binden.

Bei der Vorbereitung der pharmazeutischen Zusammensetzungen kann eine Vielfalt von Arzneiträgern und Bindemitteln und Verabreichungsrouten verwendet werden, wie dem erfahrenen Fachmann ersichtlich sein wird. Repräsentative Formulierungstechnologie wird inter alia in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. Auflage, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1995; z. B. Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9. Auflage, 1996, McGraw-Hill gelehrt.

Beispiele

Die folgenden Beispiele werden geboten, um diese Erfindung darzustellen, und sollten nicht so ausgelegt werden, dass sie den Bereich dieser Erfindung einschränken.

Wir zeigen, dass Antikörper gegen MOG, die eine Demyelinisierung bei Weißbüscheläffchen verursachen, chemisch modifiziert und als therapeutische Werkzeuge verwendet werden können, um die Bindung eines pathogenen Antikörpers aus dem wirklichen Leben kompetitiv zu blockieren. Dies wird durch enzymatische Verdauung erreicht, z. B. mit Pepsin, das den intakten Antikörper in eine großes Fragment (F[ab']2), welches die Stellen enthält, die sich an das Zielantigen (MOG) binden, und kleinere Fragmente, die den Fc-Abschnitt, einen Abschnitt von Antikörpern, der dafür bekannt ist, dass er Rezeptoren für Systeme wie etwa Komplement und Makrophagen enthält (ebenfalls dafür bekannt, viele pathogene oder zytotoxische Eigenschaften von Antikörpern zu vermitteln) umfassen, spaltet. Somit bewahrt das F(ab')2 die Kapazität, sich an MOG in dem Gehirn zu binden, ist aber ohne Kapazität, Komplement oder Makrophagen mit Fc zu aktivieren, und verbirgt MOG, das andernfalls von den pathogenen Antikörpern erkannt wird. In einem besonderen Beispiel wurde ein Paar Weißbüscheläffchen zuerst mit MBP (nicht demyelinisierend) für EAE sensibilisiert, dann wurden beiden intravenöse demyelinisierende Antikörper (monoklonale 8.18.C5 von Mäusen) gegen MOG gegeben. Gleichzeitig erhielt ein Tier (Kontrolle) eine Placebo-F(ab')2-Injektion, und das andere erhielt F(ab')2-Fragmente, die aus demselben demyelinisierenden Antikörper zubereitet wurden. Das Kontrolltier zeigte eine Verschlimmerung der klinischen Befunde von EAE, und das experimentelle Tier tat dies nicht. Die Tiere wurden 3-5 Tage später gopfert und die Gewebestruktur des Gehirns und des Rückenmarks eingeholt. Das Kontrolltier wies Anzeichen für demyelinisierende Läsionen auf, und das experimentelle Tier wies Läsionen mit Entzündung (zelluläre Infiltration), aber keine Demyelinisierung (keine Myelin-Zerstörung) auf. Dieses Experiment zeigt, dass Weißbüscheläffchen durch MOG-spezifische F(ab')2-Fragmente vor antikörpervermittelter Demyelinisierung geschützt werden können.

Komplementäre Experimente des oben Genannten zeigen an, dass ein derartiges therapeutisches Prinzip von F(ab')2- oder F(ab')-Fragmenten für MS bei Menschen oder ähnliche Erkrankungen hilfreich sein könnte: Antikörper gegen MOG sind innig mit aktiven Läsionen von MS verbunden, wo morphologische Anzeichen für die laufende Zersetzung von Mylin (siehe „Identifizierung von Autoantikörpern, die mit Demyelinisierung bei multipler Sklerose verbunden ist" unten) vorhanden sind. In dieser Arbeit werden die Epitope von MOG, die von Weißbüscheläffchen erkannt werden, zum ersten Mal offenbart, und diese Information wird verwendet, um Goldkonjugate als Immunsonden zu konstruieren, um die Gegenwart von MOG-spezifischen Autoantikörpern in sowohl Primaten-Geweben als auch menschlichen Geweben zu identifizieren.

Induktion von EAE bei Weißbüscheläffchen. EAE wurde in Weißbüscheläffchen induziert wie von Genain et al. (1999) Nature Medicine 5, 170-175 beschrieben. Sechs Weißbüscheläffchen wurden aktiv mit 50 bis 100 &mgr;g von rekombinantem Ratten-MOG sensibilisiert, das in 100 &mgr;l phosphatgepufferter Kochsalzlösung aufgelöst und mit einem gleich großen Volumen an komplettem Freund-Adjuvans (CFA), das 3 mg/ml abgetötetes Mycobacterium tuberculosis (h37Ra; DIFCO, Detroit, Michigan) enthielt, emulgiert wurde. Die MOG/CFA-Emulsion wurde mit einem Gesamtvolumen von 0,2 ml an vier Injektionsstellen intradermal in die Skapula- und Hüftregionen gegeben. An dem Tag der Immunisierung mit MOG/CFA wurden 1 × 1010 inaktivierte Bordetella pertussis-Organismen in 2,5 ml isotonischer Kochsalzlösung intravenös gegeben, und die Dosis wurde 2 Tage später wiederholt. Zum Vergleich wurden 4 Weißbüscheläffchen, die mit 200 mg ganzer weißer Hirn- und Rückenmarkssubstanz (WM)/CFA und B. pertussis sensibilisiert wurden, zwischen 18 und 39 Tagen nach der Immunisierung untersucht. MOG-sensibilisierte Weißbüscheläffchen wurden für bis zu 93 Tage nach der Immunisierung behalten. Tiere, die entweder mit WM oder mit MOG sensibilisiert wurden, zeigten innerhalb von 21 Tagen Immunisierung Zeichen von EAE auf. Die Tiere wurden durch intrakardiale Perfusion unter tiefer Anästhesie 18 bis 93 nach der Immunisierung geopfert.

MS-Gewebe von Menschen. Menschliche ZNS-Gewebe wurden von 3 Testpersonen mit MS durch Biopsie oder Autopsie (8 Wochen, 11 Jahre und 17 Jahre nach der Diagnose) erhalten. Patient 1 war eine 18-jährige weiße Frau mit einer 3-monatigen Vorgeschichte sich akut entwickelnder rechtsseitiger Hemiplegie, Sinnesverlust und Spastik. Eine computertomographische Abtastung deckte WM-Hypodensität in der linken parieto-okzipitalen Region auf. Eine Gehirn-Biopsie wurde für die neuropathologische Evaluierung durchgeführt. Die resultierende Diagnose waren aktiv demyeliniesierende, entzündliche, ödematöse Läsionen kürzlichen Ursprungs, typisch bei fulminanten, entzündlichen demyelinisierenden Leiden, entsprechend akuter MS.

Patient 2 war eine 31-jährige weiße Frau mit einer 8-jährigen Vorgeschichte chronischer fortschreitender MS, gekennzeichnet durch Taubheit und Schwäche der Glieder, Gangstörung, Harninkontinenz, Tremor, Nystagmus und verschwommenes Sehvermögen. Schlussendlich war die Patientin an den Rollstuhl gebunden, entwickelte Anfälle und Aspirationspneumonie und starb. Eine Autopsie wurde innerhalb von 1,5 Stunden post mortem durchgeführt. Eine neuropathologische Untersuchung deckte eine Dominanz kleiner (3-5 mm), verbreiteter, kürzlicher, intensiv entzündeter, ödematöser, demyelinisierender Läsionen sowie großer, etablierterer Plaques mit fibröser Astrogliose und gut demarkierten Grenzlinien auf.

Patient 3 war eine 34-jährige weiße Frau mit einer Vorgeschichte von rezidivierender remittierender MS für 10 Jahre nach der anfänglichen Diagnose im Alter von 20. Die Krankheit trat während der letzten 7 Jahre ihres Lebens in einen chronischen fortschreitenden Verlauf. Zu dem Zeitpunkt ihres Todes wies die Patientin bilaterale Optikusatrophie, internukleäre Ophthalmoplegie, spastische Paraparese und gemäßigte Gliedataxie auf. Die Todesursache war Atmungsversagen. Eine Autopsie wurde 4 Stunden post mortem durchgeführt. Die Neuropathologie dieses Falls deckte intensiv entzündliche, ödematöse, aktiv demyelinisierende Läsionen kürzlichen Ursprungs sowie aktive chronisch demyelinisierte Läsionen auf.

Gewebevorbereitung zur Analyse. Zu der Zeit der Probenahme wurden Tiere unter Pentobarbitalanästhesie durch intrakardiale Perfusion mit 200 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung, gefolgt von 150 bis 200 ml kaltem PO4-gepuffertem 2,5-prozentigem Glutaraldehyd geopfert. Zwei MOG-sensibilisierte Weißbüscheläffchen wurden während der akuten Phase der Krankheit (14-16 Tage nach der Immunisierung) erprobt, 3 wurden nach der akuten Phase, entweder während der Rezidive oder der Remission (23, 25 und 27 Tage nach der Immunisierung) genommen, und 1 wurde nach zwei Rezidiven 93 Tage nach der Immunisierung untersucht. Die 4 mit ganzem WM sensibilisierten Tiere wurden 18, 30, 30 und 39 Tage nach der Immunisierung nach akutem Ausbruch, aber vor dem Rezidiv untersucht. Aus den glutaraldehydperfundierten Tieren wurde das ZNS entnommen und eine routinemäßige Neuropathologie auf mit Formalin nachfixiertem, paraffineingebettem Material durchgeführt, das mit Hematoxylin und Eosin, Lusol Fast Blue (für Myelin) und der Versilberungstechnik nach Bodian (für Axone) gefärbt war.

Für eine Analyse der Feinstruktur von Weißbüscheläffchen-Geweben wurden 1-mm-Scheiben aus dem Sehnerv, den Gehirnhälften, dem Kleinhirn, dem Gehirnstamm, dem Knochenmark und dem Rückenmark bei C7, T3, L2, L5, L6 und L7 entnommen. Zusätzlich dazu wurden Proben aus den Rückenmarksnervenwurzeln und den Ischiasnerven genommen. Die Scheiben des glutaraldehydfixierten Gehirngewebes wurden zu flachen Rechtecken (~ 4 × 6 mm) zurechtgeschnitten, und das Rückenmark wurde in ganzen Scheiben belassen. Aus den 3 Fällen von MS, die in Beispiel 2 beschrieben wurden, wurden kleine Stücke von Biopsie-Gewebe oder Scheiben von autopsiertem ZNS-Material, 3 bis 5 mm dick, 4 bis 24 Stunden lang bei 4 °C immersionsfixiert, dann in dünne 1-mm-Scheiben auf 3 bis 5 mm Durchmesser geschnitten. Glutaraldehydfixierte Gewebe wurden dann in PO4-gepuffertem 1-prozentigem OsO4 1 Std lang auf Eis nachfixiert. Die Proben wurden entwässert, in Propylenoxid gereinigt und flach in Epoxidharz eingebettet. Dünne (1 &mgr;m) Teilabschnitte von epoxid-eingebettetem Gewebe wurden für eine Licht-Mikroskopie (LM) zubereitet und mit Toluidinblau gefärbt oder für die Immunocytochemie zur Reaktion gebracht. Für die Elektronenmikroskopie (EM) wurden Teilabschnitte auf Kupfergittern platziert, mit Blei- und Uransalzen (Bleizitrat und Uranylazetat) kontrastiert, mit Kohlenstoff beschichtet und in einem Siemens 101 oder Hitachi H 600-S abgetastet.

Ultrastrukturelle Muster von Demyelinisierung sind bei C. jacchus-EAE und bei akuten MS-Plaques identisch. ZNS-Gewebe von 6 C. jacchus-Pinseläffchen mit MOG-induzierter EAE und von 3 menschlichen Testpersonen mit MS, die alle akute Läsionen zeigten, wurden durch Elektronenmikroskopie (EM) untersucht. Bei Weißbüscheläffchen-EAE waren große demyelinisierte Plaques bis zu einigen mm Durchmesser im ganzen ZNS verteilt, immer auf Venulen zentriert und durch perivaskuläre Entzündung und einen hervortretenden Rand, entlang dem viele myelinisierte Nervenfasern vakuolisierte Myelinscheiden aufzeigten, gekennzeichnet. Dieses typische Muster einer Myelinvakuolisierung resultierte aus der Erweiterung individueller Myelinscheiden aufgrund interlamellarer Spaltung und Schwellung, wobei das Axon zu einer Seite, die von einigen Schichten intakten Myelins umgeben war, versetzt war. Mikrographische Darstellungen, die den Sehnerv eines Tieres mit akuter EAE, die durch Immunisierung mit 50 &mgr;m von rekombinatem Ratten-MOG in dem Adjuvans induziert wurde, das 3 Tage nach Beginn klinischer Befunde geopfert wurde, zeigen, demonstrierten die Gegenwart großer Intramyelin-Vakuolen an dem Perimeter einer demyelinisierten Läsion, wobei die Axone andernorts von normal erscheinenden Myelinscheiden umgeben waren.

Zwischen dem Läsionszentrum und dem Rand war eine breite Zone von Demyelinisierung, die mit nekrotischen Myelin-Zelltrümmern beladene Makrophagen enthielt. Die auffälligste Erkenntnis war die Gegenwart großer Anzahlen an Axonen innerhalb der demyelinisierten Zone, die von Aggregaten zerstörten Myelins umgeben waren, das als ein erweitertes Netz neu angeordnet war. Diese Axone wurden lateral versetzt, als das Membrannetz allmählich von dem Axon dissoziiert und von den anrenzenden Makrophagen aufgenommen wurde.

Die Demyelinisierung von Fasern bei akuter MS war mit der, die bei der Weißbüscheläffchen-EAE gesehen wurde, strukturell identisch, wobei das demyelinisierte Axon innerhalb eines Membrannetzes von Myelin lag. Andernorts in dem ödematösen Parenchym kamen frei schwebende Aggregate von nekrotischen Myelin-Zelltrümmern häufug vor. Elektronenmikroaufnahmen von Gewebe, das aus einer Biopsie der subkortikalen weißen Hirn- und Rückenmarkssubstanz einer 18-jährigen Patientin mit einer 8-wöchigen Vorgeschichte neurologischer Anzeichen, Hypodensität von weißer Hirn- und Rückenmarkssubstanz auf einem MRI-Bild und eine Diagnose akuter MS genommen wurde, zeigten Myelin um Axone, die in ein vesikuläres Netz, ähnlich dem oben beschriebenen, transformiert waren. Fibröse Astrogliafortsätze, nackte Axone und eine reaktive amöboide Mikroglia-Zelle (unten) wurden ebenfalls identifiziert. Eine hochauflösende Analyse der Myelinnetze bei sowohl Weißbüscheläffchen-EAE als auch menschlicher MS deckte Vesikel auf, die im Vergleich zu intaktem Myelin in normalem Gewebe von 2 oder 3 Schichten lose verdichteter Membranen mit einer reduzierten Periodizität (5-6 nm) umgeben waren.

MOG-spezifische Autoantikörper sind bei der C. jacchus-EAE-Läsion mit Myelin-Vesikulation verbunden. MOG ist ein in geringen Mengen vorliegendes Myelinprotein (weniger als 0,05 % des totalen Myelinproteins) mit einer immunoglobulin(Ig)-ähnlichen extrazellulären Domäne, die in Fülle auf der äußersten Schicht der Myelinscheiden exprimiert wird, was sie Antikörperangriffen zugänglich machen kann. Obwohl gezeigt wurde, dass Autoantikörper gegen MOG Demyelinisierung bei einigen EAE-Modellen steigern, wurden die detaillierten Wechselwirkungen zwischen diesen Antikörpern und Myelinmembranen nicht erforscht. Um diese Bindungsstellen von Autoantikörpern innerhalb demyelinisierender Läsionen zu identifizieren, haben wir an gefrorenem und epoxideingebettetem Weißbüscheläffchen-ZNS-Gewebe mit goldmarkiertem anti-menschlichem IgG-Antikörper (kreuzreaktiv mit Weißbüscheläffchen-IgG) gefolgt von Silberverstärkung Immunocytochemie durchgeführt.

Zur Demonstration antigen-spezifischer Autoantikörper bei Weißbüscheläffchen- und menschlichem MS-Gewebe in situ wurde eine Auswahl an myelin-bezogenen und Kontrollpeptiden direkt an Immunogold gekoppelt und auf Gewebeteilabschnitte aufgetragen. Immunogoldmarkierung wurde auf ultradünnen Teilabschnitten gefrorener oder fixierter Gewebe durchgeführt. Goldkonjugate wurden aus (1) drei MOG-Peptiden (Aminosäuren [aa] 1-20, aa 21-40 und aa 41-60 von menschlichem MOG) mit bekannter enzephalitogener Aktivität bei Weißbüscheläffchen; (2) einem MOG-Peptid, das sich als nicht enzephalitogen bei Weißbüscheläffchen erwies (aa 101-120); (3) einem menschlichen Myelinbasisprotein(MBP)-Peptid (aa 82-101), das enzephalitogen bei Weißbüscheläffchen und immundominant bei Menschen mit dem DR2-Haplotyp ist; und zur Kontrolle (4) einem Peptid eines Serumalbumins der Maus (MSA; aa 560-574) zubereitet. Peptide, die menschliche MOG-Subsequenzen aufwiesen, wurden unter Verwendung der Standard-Fmoc-Chemie synthetisiert und durch HPLC (Research Genetics Inc., Huntsville, Alabama) gereinigt (> 95 %): MOG 1-20, MOG 21-40, MOG 61-80, MBP 82-101 und MSA 560-574. Die Goldkonjugate wurden unter Verwendung eines Monosulfo-N-Hydroxysuccinimid-Nanogold-markierenden Reagens (Partikeldurchmesser 1,4 nm) gemäß den Anweisungen des Herstellers (Nanoprobes, Stonybrook, New York) synthetisiert, gefolgt von einer umfangreichen Dialyse, um nicht umgesetzte Peptide zu entnehmen. Immunreaktivität wurde auf 1-&mgr;m-Epoxidteilabschnitten des Rückenmarksgewebes von Weißbüscheläffchen und aktiven MS-Läsionen nachgewiesen. Dafür wurden Teilabschnitte mit Natriumethylat geätzt, in PO4-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,05 % Triton X-100 enthielt, equilibriert und mit 10 % normalem Kaninchenserum blockiert. Die Teilabschnitte wurden mit Peptid-Immunogoldkonjugaten (1:100 in Puffer) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurde der Nachweis durch Verwendung von Silberverstärkung (Nanoprobes) durchgeführt. Die Teilabschnitte wurden mit Toluidinblau gegengefärbt. Für den Nachweis von IgG wurden die Teilabschnitte mit goldmarkiertem anti-affen- oder antimenschlichem IgG (Nanoprobes) bei 1:100 zur Reaktion gebracht.

Als Kontrollen wurden Teilabschnitte entweder mit unmarkierten enzephalitogenen MOG-Peptiden oder MBP vorbehandelt, um die Reaktion zu blockieren, mit unmarkierten nicht enzephalitogenen MOG-Peptiden (aa 101-120) vor dem Auftragen der Goldkonjugate zur Reaktion gebracht oder mit goldmarkierten irrelevanten Antigenen (Histone oder MSA) oder irrelevantem IgG (anti-Ziege) behandelt. Die Spezifität des Markierens mit den Goldkonjugaten enzephalitogener MOG-Peptide wurde ebenfalls in Westernblots bewertet, wobei das MOG-Protein zuerst mit immunem Weißbüscheläffchenserum zur Reaktion gebracht wurde. Vollständige Details der Versuchs- und Kontrollreagenzien, die verwendet werden, um die Spezifität der Immunreaktivität zu bestimmen, können in Genain et al., Nature Med. 5: 170-175 (1999) gefunden werden.

Teilabschnitte aus der Lumbalregion des Rückenmarks der Tiere wurden eingeholt. Die positive Reaktivität (braune Färbung) von blasigem Myelin um Axone (Pfeile) zeigten die Gegenwart von IgG an. Nicht demyelinisierende Axone wurden nicht gefärbt. Positive Reaktivität für IgG wurde spezifisch über den blasigen Netzen von zerstörtem Myelin, das die Axone umgab, gefunden.

Im Anschluss daran identifizierten wir die Zielantigene, die von diesen Immunoglobulinen gebunden wurden, durch das Auftragen von immunogoldmarkierten Konjugaten ausgewählter Peptide von MOG und Myelinbasisprotein (MBP). Diese Myelinantigene wurden direkt mit den Goldpartikeln auf ihren primären NH2-Resten markiert und wurden verwendet, um antigenspezifische Autoantikörper in situ nachzuweisen. Mit dieser Technik wurden drei separate goldkonjugierte Peptide von MOG über die Netze von integrierenden Myelinscheiden in einem Muster ähnlich dem, dass für goldkonjugiertes Anti-IgG beobachtet wurde, co-lokalisiert.

Diese Peptide enthielten die Aminosäuresequenzen von MOG, die von demyelinisierenden Antikörpern, die sich in dem Serum von MOG-immunisierten Weißbüscheläffchen (aa 1-20, aa 21-40 und aa 61-80) entwickeln, erkannt werden. Das verwendete goldkonjugierte MOG-Peptid (aa 21-40) weist eine Sequenz auf, die artübergreifend konserviert ist. MOG-reaktive Tröpfchen wurden ebenfalls in umgebenden Makrophagen gesehen, wobei sie die Gegenwart von internalisierten nekrotischen Myelin-Zelltrümmern anzeigen, an die der Anti-MOG-Antikörper gebunden wurde. Positive Reaktivität mit dem markierten Antigen zeigte die Gegenwart des MOG-spezifischen Antikörpers in situ auf vesikulärem Myelin um Axone und auf nekrotischen Myelin-Zelltrümmern innerhalb des extrazellulären Raumes und der Makrophagen an. Normales Myelin (um die Mehrheit der Fasern) wurde nicht gefärbt.

Im Gegensatz dazu haben goldmarkierte Konjugate eines Peptids, das ein immundominantes Epitop von menschlichem MBP (aa 82-101, bei Primaten artenübergreifend konserviert), und eines Kontrollpeptids eines Serumalbumins der Maus (MSA, aa 560-574) enthält, Myelinmambranen oder Makrophagen nicht markiert. Somit sind die blasigen Myelinnetze weder durch das goldkonjugierte Peptid von MBP noch durch das goldkonjugierte Peptid von MSA gefärbt (Pfeile).

Diese Beobachtungen demonstrieren bei diesem Modell von EAE eines nicht menschlichen Primaten, dass Antikörper, die spezifisch für MOG sind, in direktem Kontakt mit den sich zersetzenden Myelinmembranen stehen, und zeigen an, dass die Bildung der blasigen membranösen Netze von einem lytischen Angriff durch diese Autoantikörper herrührt.

MOG-spezifische Autoantikörper sind mit Myelin-Vesikulation bei Läsionen von akuter MS bei Menschen verbunden. Im Anschluss daran erforschten wir mit ähnlichem Immunogoldmarkieren die Gegenwart von MOG- und MBP-spezifischen Autoantikörpern im ZNS-Gewebe, das bei einer Biopsie oder Autopsie von Patienten mit MS erhalten wurde. Wie bei der Weißbüscheläffchen-EAE markierte goldkonjugiertes Anti-IgG die mambranösen Myelinnetze um einzelne demyelinisierende Axone, zusammen mit Tröpfchen nekrotischer Myelin-Zelltrümmer, die durch das Paremchym verstreut sind. IgG ist entlang der zersetzten Myelinscheide eines Axons (Pfeil), das im Längsschnitt geschnitten ist, lokalisiert; (as), Zytoplasma eines hypertrophierten Astrozyten, (ol), tangentialen Teilabschnitt eines Oligodendrozyten. Dicht gefärbte, IgG-beschichtete nekrotische Myelin-Zelltrümmer sind in dem Parenchym und in 3 Makrophagen (wahrscheinlich amöboide Mikroglia) sichtbar. Zusätzlich dazu zeigten gelegentliche Plasmazellen positives Färben durch Anti-IgG. Mit den immunogoldmarkierten Myelinantigen-Konjugaten wurden blasige Myelinnetze intensiv durch goldkonjugierte MOG-Peptide im mit geringeren Ausmaß durch goldkonjugierte MBP, aber nicht durch MSA gefärbt.

IgG-Myelin-Komplexe, die mit Goldkonjugaten von MOG und MBP markiert wurden, waren ebenfalls in Makrophagen, aber nicht in Astrozyten oder Oligodendrozyten gegenwärtig. Es wurden keine MOG- oder MBP-markierten Plasmazellen angetroffen. Eine Reaktivität bei Goldkonjugaten wurde nicht bei normal erscheinender weißer MS-Hirn- und Rückenmarkssubstanz oder um perivaskuläre entzündliche Manschetten beobachtet. Bei Weißbüscheläffchen, die gegen Gesamtmyelin immunisiert wurden, wurde ein ähnliches Muster von sowohl Anti-MOG- als auch Anti-MBP-Ig-Ablagerung beobachtet. ZNS-Gewebe von amyotrophischer Lateralsklerose, einer anderen neurologischen Erkrankung, die mit Schäden an der weißen Hirn- und Rückenmarkssubstanz und Makrophagenaktivität verbunden ist, zeigte keine myelinantigenspezifische Immunogoldreaktivität. Diese Erkenntnisse identifizieren direkt MOG-spezifische Antikörper in aktiv demyelinisierenden Läsionen von MS bei Menschen, wobei sie anzeigen, dass, wie bei MOG-induzierter EAE, diese Autoantikörper bei der Bildung kleiner Vesikel in den zersetzten Myelinscheiden eine kausale Rolle spielen. Das lösliche Ig und das Ig der B-Zell-Oberfläche mit Anti-MBP-Spezifität wurden in MS-Gehirngewebe beschrieben, und in der aktuellen Studie wurde MBP-spezifisches Ig innerhalb der blasigen Myelinnetze in MS-Läsionen lokalisiert. Obwohl experimentell nicht gezeigt wurde, dass Anti-MBP-Antikörper die demyelinisierende Symptomatik einleiten, können diese Autoantikörper separate pathogene Mechanismen wie etwa rezeptorvermittelte Phagozytose durch Makrophagen und/oder die Präsentation von Myelinautoantigenen zu spezifischen T-Zellen vermitteln.

Es ist bemerkenswert, dass Autoantikörper ausschließlich an die kleinen Vesikel, die das Stadium vollständiger Zersetzung der Myelinmembranen kennzeichnen, und an die nekrotischen Myelin-Zelltrümmer, die in dem extrazellulären Raum oder in phagozytischen Zellen gegenwärtig sind, gebunden zu sein scheinen. Interessanterweise wurde in früheren Studien über EAE bei Nagetieren eine ähnliche, aber weniger umfangreiche Vesikulation von Myelin festgestellt, wobei dies dort als ein vorrübergehendes frühes Phänomen perzipiert wurde. Bei dem Weißbüscheläffchen, bei dem Läsionsformation langwierig ist und sich stets ausdehnt, wurde das zerstörte Myelin jedoch immer wieder gefunden. Die Vakuolisierung von Myelin in großem Maßstab an dem Läsionsrand unter normal myelinisierten Fasern trat in der Abwesenheit signifikanter lokaler zellulärer Infiltration oder IgG-Ablagerung auf und wurde ebenfalls an der Grenzlinie aktiver MS-Läsionen festgestellt. Diese Änderung der Myelinstruktur könnte von löslichen Faktoren, die von dem Zentrum der demyelinisierenden Plaque oder von aktivierten Gliazellen an der Grenzlinie der Läsion diffundieren, vermittelt werden. Morphologische Änderungen, die diesen großen Vakuolen ähnlich sind, wurden in myelinisierten ZNS-Kulturen festgestellt, die TNF-Alpha ausgesetzt wurden, und einem geringeren Grad in Kulturen, die Serum von Tieren mit EAE und von Testpersonen mit MS ausgesetzt wurden.

Viele der therapeutischen Ansätze, die auf pathogene T-Zell-Reaktionen bei EAE-Modellen abzielen, sind noch nicht in eine erfolgreiche Behandlung von MS bei Menschen umgesetzt worden, wobei vermutlich angeregt wird, dass andere Komponenten des Immunsystems berücksichtigt werden müssen. B-Zell-Reaktionen scheinen ein Schlüsselfaktor für die Schwere einer klinischen Krankheit und Symptomatik bei C. jacchus-EAE zu sein. Die aktuellen Ergebnisse unterstreichen die Rolle von Autoantikörpern bei der weit verbreiteten Zerstörung von Myelin bei MS und heben hervor, dass bei Krankheiten, die durch T-Zell-Reaktionen eingeleitet wurden, Antikörper gegen kritische Antigene des Zielorgans für die Entwicklung von unabänderlichen Gewebeschäden essentiell sind.

In vivo-Verabreichung von MOG-spezifischen F(ab')2-Fragmenten. Weißbüscheläffchen wurde am 0. Tag 1 mg MBP in CFA, das B. Pertussis enthielt, verabreicht, wobei nicht demyelinisierende EAE induziert wurde. Am 21. Tag wurden den Tieren intravenös 0,17 mmol/kg des F(ab')2 aus entweder 8.18.C5, einem monoklonalen Maus-Anti-MOG-Antikörper, oder einem Anti-Influenza-A-(Kontroll-)Antikörper verabreicht, dann wurden ihnen 0,17 mmol/kg 8.18.C5-Antikörper verabreicht, gefolgt von einer zweiten intravenösen Verabreichung des ensprechenden F(ab')2 für zwei Stunden. Die Tiere wurden am 35. Tag eingeschläfert. Gewebeproben wurden zubereitet wie in Beispiel 3 beschrieben. Unter Verwendung einer hochauflösenden Mikroskopie und von immunogoldmarkierten Peptiden von Myelinantigenen, die fähig sind, antigenspezifische Antikörper in situ nachzuweisen, haben wir Autoantikörper identifiziert, die für Myelin/Oligodendrozyt-Glykoprotein (MOG) um individuelle demyelinisierende Axone in akuten Läsionen von sowohl MS bei Menschen als auch EAE bei Weißbüscheläffchen spezifisch sind, wobei sie für die Zersetzung von Myelinscheiden direkt verantwortlich zu sein scheinen. Tiere, die mit Kontroll-F(ab')2-Fragmenten behandelt wurden, d. h. gegen das Influenza-Antigen gerichtet, deckten große demyelinisierende Plaques in dem zervikalen Rückenmark auf, und mit MOG-spezifischen F(ab')2-Fragmenten behandelte Tiere zeigten, dass die demyelinisierende Aktivität von Anti-MOG-Antikörpern bei Weißbüscheläffchen abhängig von intakter Frangmentfunktion ist, da sie durch Verabreichung von MOG-spezifischen F(ab')2-Fragmenten in vivo kompetitiv blockiert werden kann. Diese Erkenntnisse unterstreichen die Rolle von myelinspezifischen Autoantikörpern bei der weit verbreiteten Zerstörung von Myelin bei MS und stellen eine Basis für eine schützende Therapie bei ZNS-demyelinisierenden Erkrankungen bereit.

Enzephalitogene Epitopbestimmung (MOG) bei MS-ähnlicher Weißbüscheläffchen-EAE. Bei C. jacchus-Pinseläffchen mit demyelinisierender EAE, die mit rekombinantem Ratten-MOG (rMOG: extrazelluläre Domäne aa 1-125) induziert wurde, wurden die genauen Spezifitäten von T-Zell-Reaktivität (proliferative Reaktionen bei PBMC) und B-Zell-Reaktivität (Serumantikörper) auf MOG unter Verwendung sich überlappender 15-mer PIN-Peptide (Verschiebungen von 1 und 3), die den Aminosäuresequenzen von sowohl Ratten- als auch menschlichem MOG entsprechen (Chiron Mimotopes, San Diego, Kalifornien), serienmäßig geprüft. Ergebnisse: Alle geprüften Tiere (n = 6) wiesen eine herausragende und anhaltende T-Zell-Reaktion auf, die auf aa 27-36 beschränkt ist, einer Sequenz, die artübergreifend vollständig konserviert ist. Ein einzelnes Weißbüscheläffchen reagierte auf ein zweites T-Zell-Epitop, das innerhalb von aa 62-72 lokalisiert ist. Serumantikörper-Reaktionen (n = 10), die in 4 unterschiedlichen Regionen von MOG, einschließlich 2 Hauptepitopen, aa 13-21 und aa 62-74 (100 % bzw. 60 von Tieren) und zusätzlichen Epitopen, abgebildet sind, wurden bei einigen Tieren (aa 28-36 und 40-45) identifiziert. Weder für T-Zellen noch für Antikörper bei Tieren mit rezidivierender EAE, die für bis zu 93 Tage überwacht wurden, wurde eine Epitopausbreitung beobachtet. Schlussfolgerungen: Enzephalitogene Reaktionen auf MOG bei MS-ähnlicher Weißbüscheläffchen-EAE scheinen auf eine begrenzte Anzahl an B-Zell- und T-Zell-Epitopen beschränkt zu sein. Diese Erkenntnisse demonstrieren die Umsetzbarkeit von spezifischer Immuntherapie für MS bei Menschen.

Nachweisen von B-Zellen mit oberflächengebundenen Antikörpern. Frühzeitig bei der Immunreaktion weisen B-Zellen auf ihrer Oberfläche Immunoglobuline auf, die spezifisch mit Antigenen reagieren können. Das B-Zell-Immunoglobulin, das mit einem Selbstantigen reagiert, kann der erste Schritt in einer Autoimmunkrankheit sein. Somit kann einen frühzeitigen Nachweis von Autoantikörpern auf der Oberfläche von B-Lymphozyten das Mittel zum Entwerfen einer Methode einer Behandlung vor dem Ausbruch von Symptomen bereitstellen.

B-Zellen konstituieren ungefähr 3-5 % von Lymphozyten und wurden positiv aus frisch isolierten peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC), die unter Verwendung Anti-CD-19-beschichteter Körner von C. jacchus-Pinseläffchen mit MOG-induzierter EAE, von Menschen mit MS und von gesunden Kontrollen erhalten wurden, ausgewählt. Antikörper für jeden anderen geeigneten B-Zell-Marker können verwendet werden. Objektträger, die 2 × 105 B-Zellen (> 98 Reinheit) enthalten, wurden mit 1 % Glutaraldehyd fixiert und gewaschen. Alternativ dazu können nicht fixierte Zellen verwendet werden. Die isolierten B-Zellen wurden dann mit markierten Immunogoldkonjugaten einer Mischung von elf überlappenden 20mer-Peptiden, die der Sequenz des NH2-Terminus von menschlichem MOG (1-120) entsprechen, inkubiert; identische B-Zell-Präparate wurden mit Kontroll-Polypeptiden, die der Sequenz von Histon- oder MBP-Peptiden entsprechen, markiert. Objektträger wurden mit Silber verstärkt, und markierte B-Zellen wurden von zwei unterschiedlichen neutralen Beobachtern gezählt.

B-Zellen, die MOG-spezifische Oberflächenimmunoglobuline exprimieren, wurden mit goldkonjugierten MOG-Peptiden in PBMC von MOG-immunisierten Weißbüscheläffchen (n = 8) leicht nachgewiesen. Bei diesen Tieren, die dafür bekannt sind, dass sie Anti-MOG-Serumantikörper entwickeln, traten zirkulierende MOG-spezifische B-Zellen mit einer Häufigkeit von ungefähr 1:500 bis zu ungefähr 1:2 000, erhöht von 0-1:10 000 bei gesunden, nicht immunisierten Weißbüscheläffchen (n = 8) auf. Nicht markierte MOG-Peptide, die im Übermaß hinzugegeben wurden, inhibierten das Markieren vollständig, und das goldkonjugierte Kontrollprotein markierte keine B-Zelle. Bei Menschen konnten zirkulierende MOG-spezifische B-Zellen bei 8 von 17 MS-Patienten (47 %) und bei 9 von 18 gesunden Kontrollen (50 %) nachgewiesen werden. Die Häufigkeit dieser autoreaktiven B-Zellen reichte von ungefähr 1:11 000 bis ungefähr 1:200 000 B-Zellen, wobei die höchsten Häufigkeiten bei zwei Patienten mit rezidivierender-remittierender MS (1:16 000 bzw. 1:11 000) beobachtet wurden.

Dieser Immunogold-Assay weist empfindlich MOG-spezifische B-Zellen in peripherem Blut nach. Dieser Assay weist eine Empfindlichkeit von ungefähr 1:500, vorzugsweise von ungefähr 1:2 000, besser von ungefähr 1:10 000, noch besser von ungefähr 1:15 000 und am besten von ungefähr 1:200 000 auf. Bei Menschen können autoreaktive B-Zellen bei etwa 50 % der Individuen nachgewiesen werden und sind ebenso gegenwärtig bei MS-Patienten und Kontrollen. Dies legt nahe, dass die Gegenwart von Anti-MOG-Antikörpern in dem Nervensystem von Individuen mit MS nicht mit einer wesentlichen Ausdehnung von MOG-reaktiven B-Zellen in dem peripheren Blut in Verbindung steht. Die hohe Häufigkeit von MOG-reaktiven B-Zellen, die bei PBMC beobachtet wurde, stellt neue Unterstützung für die Hypothese bereit, dass MOG ein wichtiges Autoantigen bei Menschen ist.

Bei dem obigen Beispiel wurden MOG-spezifische Antikörper ausschließlich in Bereichen, in denen die Transformation von kompaktem Myelin in kleine Vesikel um einzelne demyelinisierende Axone auftrat, und in nekrotischen Myelin-Zelltrümmern, die entweder in dem ZNS-Parenchym schweben oder von phagozytischen Zellen (Makrophagen und Mikroglia) internalisiert sind, lokalisiert. Somit können diese Antikörper zusätzlich zu einem direkten lytischen Angriff auf Myelin und Oligodendrozyte ebenfalls für rezeptorvermittelte Phagozytose durch Makrophagen oder antikörperabhängige zelluläre Zytotoxität verantwortlich sein, die schon lange als möglicher Effektormechanismus von Myelinschäden erkannt wurden. Unter Verwendung passiver Übertragung von Antikörpern in das C. jacchus-System haben unsere Experimente gezeigt, dass es möglich ist, pathogene Effekte des monoklonalen Anti-MOG-Antikörpers 8.18.C5 durch In vivo-Verabreichung von gereinigten 8.18.C5-F(ab')2-Fragmenten kompetitiv zu blockieren, wobei angezeigt wurde, dass intakte Fc-Fragmente und nicht die MOG-spezifische CDR3-Sequenz selbst Myelin Schäden zufügten. Basierend auf diesen Erkenntnissen stellen Analoge oder kompetitive Inhibitoren einer Antikörperbindung, die ohne toxische Wirkungen auf Myelin sind, einen rationalen Ansatz für eine Therapie bei EAE und zugehörigen demyelinisierenden Erkrankungen bereit. Somit benutzt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen von Autoantigenepitopen, Anti-Autoantigen-Antikörperfragmenten oder Kombinationen daraus, um eine Behandlung von demyelinisierenden Autoimmunkrankheiten zu erzielen.


Anspruch[de]
Eine Verwendung eines Myelin-Oligodendrozyt-Glykoprotein(MOG)-Polypeptid-spezifischen Antikörperfragments, das keinen funktionellen Fc-Abschnitt aufweist, für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung einer Demyelinisierung, welche mit der Bindung eines Autoantikörpers an ein MOG-Polypeptid verbunden ist, durch das Verabreichen des Antikörperfragments an einen Wirt, der für eine pathogene Bindung zwischen MOG-Polypeptid und Autoantikörper anfällig ist. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Fragment aus Fv, F(ab')2, F(ab), F(ab)2 und Fragmenten davon ausgewählt wird. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Medikament ferner ein MOG-tolerogenes T-Zell-Epitop beinhaltet.






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