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Dokumentenidentifikation DE102004051830B4 13.12.2007
Titel Multifunktionales Referenzsystem bei Analytbestimmungen durch Fluoreszenz
Anmelder Roche Diagnostics GmbH, 68305 Mannheim, DE
Erfinder Horn, Carina, Dr., 68647 Biblis, DE
Vertreter Weickmann & Weickmann, 81679 München
DE-Anmeldedatum 25.10.2004
DE-Aktenzeichen 102004051830
Offenlegungstag 27.04.2006
Veröffentlichungstag der Patenterteilung 13.12.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 13.12.2007
IPC-Hauptklasse G01N 21/64(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, DE

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein System für den Lumineszenz-Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe, wobei das System einen Träger umfasst, auf dem sich eine Analyt-spezifische Substanz und eine Referenzsubstanz befinden. Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe, wobei das genannte System verwendet wird. Das erfindungsgemäße System eignet sich zusätzlich zum Nachweis eines Analyten dazu, die Probenmenge zu bestimmen, die Menge des Analyten zu bestimmen und/oder die Funktionsbereitschaft des Trägers für einen Nachweis festzustellen.

Das erfindungsgemäße System und Verfahren zum Nachweis eines Analyten beruht auf einem Lumineszenz-Nachweis, insbesondere einem Fluoreszenz-Nachweis. Solche Nachweissysteme sind im Stand der Technik bereits seit langem bekannt. Bei den heutigen Analysemethoden stellt die photometrische Auswertung von analytischen Testelementen eines der gebräuchlichsten Verfahren zum schnellen Nachweis bzw. zur schnellen Bestimmung der Konzentration von Analyten in Proben dar. Allgemein werden photometrische Auswertungen im Bereich der Analytik, der Umweltanalytik und vor allem im Bereich der medizinischen Diagnostik eingesetzt. Insbesondere im Bereich der Blutglucosediagnostik aus Kapillarblut besitzen Testelemente, die photometrisch ausgewertet werden, einen großen Stellenwert.

Bei fluoreszenzspektrometrischen Nachweissystemen hängt die Intensität der Emission der fluoreszierenden Substanzen direkt proportional von der Intensität der Anregung ab. Dabei kann die Intensität der Anregung durch viele Faktoren beeinflusst werden, zum Beispiel durch das Verhalten der Lichtquelle über die Zeit oder Veränderungen der Lichtwege. Gerade in einem Kleingerät, welches nicht feststehend in einem Labor zur Messung benutzt wird, können Veränderungen der Lichtwege unterschiedliche Anregungsintensitäten hervorrufen. Daher ist es sehr schwierig, absolute Fluoreszenzmessungen reproduzierbar durchzuführen.

Aus diesem Grunde verwenden die heute gängigen Fluoreszenz-Testsysteme eine Referenzsubstanz, auf die bezogen werden kann. Es sind verschiedene Arten von Referenzsubstanzen bekannt.

Beispielsweise ist im Stand der Technik bekannt, in Nachweissystemen, die auf einem Fluorophor beruhen, einen zweiten Fluorophor zu verwenden, der bei einer anderen Wellenlänge emittiert als der für den Analyten spezifischen Fluorophor. Dieser zweite Fluorophor kann somit als Referenz benutzt werden. Dabei kann dann durch zwei verschiedene Filter (und zwei Detektoren) zwischen den beiden Fluorophoren unterschieden werden, wobei ein Fluorophor keine chemische Umsetzung erfährt und als Referenz dienen kann. Dieses Nachweissystem ist beispielsweise in der folgenden Literaturstelle beschrieben: Principles of Fluorescence Spectroscopy, J. R. Lakowicz, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, Boston, Dordrecht, London, Moscow 1999, 2. Auflage.

Ein anderer Ansatz besteht in einer zeitaufgelösten und phasenmodulierten Referenzierung, bei der ein sehr langlebiger Fluorophor, der eine längere Lebensdauer als ein für den Analyten spezifischer kurzlebiger Fluorophor hat, als Referenzsubstanz verwendet wird. Während die langlebige Lumineszenz in ihren Parametern vom Analyten nicht beeinflusst wird, verändert sich die Intensität des für den Analyten spezifischen, kurzlebigen Leuchtstoffs in Abhängigkeit von der jeweiligen Analytkonzentration. Dann kann durch zeitaufgelöste Messung zuerst der Analyt-Fluorophor gemessen werden und anschließend das Abklingen der Referenz aufgenommen werden. Das Verhältnis des Abklingsignals zu dem Signal des Analyten plus dem der Referenzsubstanz muss immer gleich sein, unabhängig mit welcher Intensität eingestrahlt wurde.

WO 99/06821 A1 offenbart ein solches System. Hierbei werden zumindest zwei verschiedene Leuchtstoffe co-immobilisiert auf einem Träger verwendet, deren erster zumindest in der Lumineszenzintensität auf den zu bestimmenden Parameter des Analyten anspricht, und deren zweiter zumindest in der Lumineszenzintensität und der Abklingzeit auf den zu messenden Parameter nicht anspricht. Die Leuchtstoffe weisen unterschiedliche Abklingzeiten auf. Das Zeit- oder Phasenverhalten der sich ergebenden Lumineszenzantwort kann somit zur Bildung einer Referenzgröße für die Bestimmung des zu messenden Parameters des Analyten verwendet werden.

WO 02/056023 A1 offenbart einen optischen Sensor zur Bestimmung zumindest eines Parameters in einer Probe, wobei auch hier ein auf den Parameter ansprechendes Indikatormaterial mit kurzer Ablingzeit und ein auf den Parameter nicht ansprechendes Referenzmaterial mit langer Abklingzeit verwendet werden. Hierbei sind das Indikatormaterial und das Referenzmaterial auf einem gemeinsamen Träger immobilisert und auf der Probenseite mit einer lichtundurchlässigen Schicht abgedeckt.

Die Referenzierung über einen zweiten Fluorophor, der bei einer anderen Wellenlänge gemessen wird, benötigt allerdings einen höheren apparativen Aufwand. So werden zum Beispiel zwei Filter anstelle nur eines einzigen Filters benötigt, um das Anregungslicht abblocken zu können, und es werden in der Regel auch zwei Detektoren benötigt. Hinzu kommt, dass durch die Trennung der optischen Wege nach der Anregung in unterschiedliche Detektoren einer der beiden Wege fehlerhaft sein kann, was dann zu einer falschen Referenzierung führen würde.

Bei der zeit- oder phasenaufgelösten Referenzierung besteht der Nachteil, dass die Messungen der Analyten immer vor einem leuchtenden Hintergrund durchgeführt werden müssen. Das bedeutet, dass immer ein gewisser Offset oder Signaluntergrund besteht, der den Messbereich begrenzt. Dieses Prinzip ist beispielsweise in 1 dargestellt.

In 1 sieht man den Messbereich des Analytsignals mit und ohne Referenz. Ohne den Referenzfluorophor kann der Messbereich optimal auf den zu umspannenden Dynamikbereich angepasst werden. Mit Referenzfluorophor wird ein Teil des Messbereichs von der Referenz beansprucht.

Die Referenzsubstanzen bzw. Referenzleuchtstoffe, die in den oben genannten Verfahren des Standes der Technik eingesetzt werden, können nur als Referenzsubstanz für den Vergleich mit dem Analyten verwendet werden, sie können jedoch keine weiteren Funktionen erfüllen.

Ein wichtiges Thema bei der Bestimmung von Analyten im Diagnostik-Bereich ist jedoch auch die Benetzungserkennung und/oder eine Füllkontrolle des Testfeldes.

Auch in diesem Bereich gibt es im Stand der Technik Ansätze, die bestehenden Verfahren zu verbessern. WO 83/00931 A1 offenbart eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Nachweis einer flüssigen Probe, wobei bestimmt wird, ob eine ausreichende Menge an Probenflüssigkeit aufgetragen wurde. Dies wird erreicht, indem von einem Tropfendetektor, der eine Lichtquelle umfasst, Strahlung auf die Probe abgegeben wird, die innerhalb der Absorptionsbande von Wasser liegt. Es wird zunächst der Probenträger im trockenen und dann im benetzten Zustand bestrahlt und somit die Feuchtigkeit gemessen. Aufgrund des Unterschieds der detektierten Signale wird dann der Feuchtigkeitsgehalt der Probe berechnet.

US 5,114,350 A offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer Körperflüssigkeitsprobe. Der Grad der Benetzung des Reaktionsträgers wird dadurch gemessen, dass die Menge an reflektiertem Licht gemessen wird, die mit zunehmender Benetzung abnimmt.

DE 102 48 555 A1 offenbart ein Verfahren zur Erkennung und Kompensation der Unterdosierung von Teststreifen. In dieser Druckschrift wird ein Testelement beschrieben, welches ein Analyt-spezifisches Reagenz umfasst, das mit einem Analyten in einer Probe wechselwirkt, sowie eine Kontrollsubstanz, die mit einer Probenmatrix der Probe wechselwirkt. Das Analyt-spezifische Reagenz wechselwirkt mit dem Analyten in Abhängigkeit von der Analytkonzentration in einem Detektionswellenlängenbereich. Die Kontrollsequenz wechselwirkt bei Bestrahlung des Testfeldes mit der Probenmatrix in Abhängigkeit von der auf das Testfeld aufgegebenen Probenmenge. Die Kontrollsubstanz kann dabei auch mit dem in der Probenmatrix enthaltenen Wasser reagieren. Ein Beispiel, das in DE 102 48 555 A1 genannt ist, verwendet Chlorphenolrot als Analyt-unabhängigen Farbbildner zur Bestimmung der Probenmenge und 2,18-Phosphormolybdänsäure als Analyt-spezifisches Reagenz zur Bestimmung der Glucosekonzentration in einer Probe, z. B. einer Blutprobe. In dem genannten Beispiel dieses Dokuments müssen somit zwei Wellenlängenbereiche detektiert werden, was dieses Testsystem apparativ aufwändig macht.

Shamsipur et al. (Analytica Chinica Acta 2004, 501:55-60) betrifft eine Optodenmembran, welche den Farbstoff TTBB enthält, dessen Fluoreszenz nach Komplexierung mit Ni2+-Ionen gequencht wird.

DE 695 13 683 T2 betrifft einen Ionensensor zur Detektion von pH-Änderungen, welcher den Fluoreszenzfarbstoff APTSC verwendet.

DE 696 30 531 T2 offenbart ein Fluoreszenzverfahren mit gleichzeitiger Doppelanregung/Einfachemission zur Messung von pH und pCO2. Das Verfahren setzt eine Indikatorspezies frei, die ein Absorptions- oder Anregungsspektrum mit einem ersten Bereich und einem zweiten Bereich hat, wobei der erste und der zweite Bereich nicht wesentlich überlappen und ein Emissionspektrum besitzen, das von dem Absorptions- oder Anregungsspektrum verschieden ist.

EP 1 394 219 A1 betrifft pH-sensitive Cyaninfarbstoffe als reaktive Fluoreszenzreganzien, insbesondere LysoSensor Blue DND-167.

US 4,255,053 A offenbart ein Verfahren zum Einsatz von zwei Indikatorsubstanzen (Analytindikator, Referenzindikator) zur Konzentrationsbestimmung eines Analyten. Gemäß US 4,255,053 A ist es besonders vorteilhaft, den Referenzindikator so zu wählen, dass die Emissionsspektren des Analytindikators und des Referenzindikators nicht überlappen. Dies macht den Einsatz von zwei Wellenlängebereichen mit dem entsprechenden apparativen Aufwand notwendig.

Die der Erfindung zugrunde liegenden Aufgabe bestand darin, ein System und ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe bereitzustellen, welches mit einer Referenzsubstanz und einer analyt-spezifischen Substanz durchgeführt werden kann, ohne dabei den im Stand der Technik beschriebenen hohen apparativen Aufwand in Kauf nehmen zu müssen.

Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch ein System für den Lumineszenz-Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe, umfassend einen Träger, umfassend eine Analyt-spezifische Substanz, die in der Lage ist, bei Kontakt mit dem Analyten ein erstes Lumineszenzsignal abzugeben, und eine Referenzsubstanz, die in der Lage ist, ein zweites Lumineszenzsignal abzugeben welches durch Kontakt mit der flüssigen Probe gequencht wird, wobei ein einziger Detektor zum Messen der Lumineszenzsignale der Analyt-spezifischen Substanz und der Referenzsubstanz verwendet wird.

Überraschendeweise lassen sich aus dem Stand der Technik bekannte Nachweisverfahren dadurch erfindungsgemäß vereinfachen, dass eine Referenzsubstanz verwendet wird, welche in Abwesenheit der Probe ein Lumineszenzsignal abgibt, welches als Referenzsignal verwendet werden kann. Bei Zugabe der Probe wird dieses Lumineszenzsignal schlagartig im wesentlichen gequencht, d.h. es liefert im wesentlichen kein Signal mehr, oder zumindest ein sehr stark verringertes Signal.

Besonders vorteilhaft für die vorliegende Erfindung ist es, wenn Anregung und Emission bei etwa den gleichen Wellenlängen liegen wie für die analytspezifische Substanz. Dies bedeutet, dass dann für die Detektion der Lumineszenzsignale ein einziger Detektor verwendet werden kann.

Durch die Eigenschaft der Referenzsubstanz, in Abwesenheit der Probe ein Lumineszenzsignal abzugeben, was dann bei Inkontaktbringen mit der Probe gequencht wird, kann die Referenzsubstanz nicht nur zum Nachweis des Analyten verwendet werden, sondern auch zum Bestimmen der Probenmenge, zum Bestimmen der Menge des Analyten und/oder der Funktionsbereitschaft des Trägers. Die Referenzsubstanz kann beispielsweise so gewählt werden, dass ihr Lumineszenzsignal bei Benetzung gequencht wird. Dann kann die Funktionsbereitschaft des Testsystems sichtbar gemacht werden. Falls also der Träger, der das Testsystem umfasst, in etwa bei der Lagerung feucht geworden ist oder dgl., oder andere Substanzen mit ihm in Kontakt gekommen sind, wird dieses Lumineszenzsignal der Referenzsubstanz gequencht sein, und es ist erkennbar, dass dieses Testsystem nicht funktionsbereit ist.

Vorzugsweise ist das Quenchen reversibel, d.h. wird die Probe oder insbesondere die Benetzung entfernt bzw. rückgängig gemacht, so kann auch das Lumineszenzsignal wieder hergestellt werden.

Damit kann neben der Referenzierung eine Benetzungserkennung und/oder eine Füllkontrolle mit dem erfindungsgemäßen System erreicht werden. Wird z.B. auf dem Träger ein Testfeld vorgesehen und dieses nicht vollständig von der Probe benetzt, bleibt ein Restlumineszenzsignal bestehen. Es ist dann möglich, rechnerisch eine Korrektur im Bezug auf das Analytsignal über diese Restlumineszenz zu machen.

Wenn die Lumineszenzeigenschaften im Bezug auf die Umgebungsfeuchte reversibel sind, kann eine solche Referenzsubstanz auch als Feuchteindikator verwendet werden. Der Feuchteindikator gibt dann über die Lagerbedingungen des Testsystems und seine Funktionsbereitschaft Auskunft. Man kann somit die Referenzsubstanz auch als Indikator für ein zu wählendes Verfallsdatum des Testsystems verwenden.

Lumineszenzsubstanzen, insbesondere Fluorophore, die solche Eigenschaften aufweisen, sind im Stand der Technik kaum bekannt. Die meisten Fluorophore erfahren in feuchter Umgebung eine Fluoreszenzerhöhung und kein Quenchen.

Als Referenzsubstanz kommen prinzipiell alle Substanzen infrage, welche in der Lage sind, ein Lumineszenzsignal abzugeben, welches durch Kontakt mit der Probe gequencht wird. Hierbei können alle Arten von Substanzen verwendet werden, die durch Kontakt mit irgendeinem Bestandteil der Probe in ihrem Lumineszenzsignal gequencht werden. Bestandteile in zu untersuchenden Proben, welche das Quenchen auslösen können, sind z.B. Wasser, Calcium, Magnesium oder andere Metalle oder deren Ionen, der pH-Wert sowie weitere Faktoren.

Wenn Wasser der für das Quenchen auslösende Faktor ist, ist die Referenzsubstanz vorzugsweise ausgewählt aus der Klasse der Chalcone der Formel I.

Chalcone sind im Stand der Technik bekannt (B.M. Krasovitskii, D.G. Pereyaslova, ZH. Vsesoyuznogo Obscchestva im. D.I. Mendeleeva, 10 (6), 704 (1965); G.E. Dobretsov, V.A. Petrov, Yu.A. Vladimirov, Studia Biophysica Berlin, 71 (3), 181-187 (1978)).

Bevorzugt sind Substanzen der allgemeinen Formel I,

wobei einer der Reste R2, R3 und R5 ausgewählt ist aus NR11R12 und SO3Na. Die übrigen Substituenten R1, R4, R6, R6, R8, R9 und R10 können beliebige Substituenten sein, vorzugsweise Wasserstoff oder Halogen, insbesondere F, Cl, Br und I.

R11 und R12 sind ausgewählt aus Wasserstoff, C1-C4-Alkyl, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl, und CH2CH2-SO3Na.

Besonders bevorzugte Substanzen, die als erfindungsgemäße Referenzsubstanz geeignet sind, sind Aminochalcone und Chlorchalcone, insbesondere gemäß den allgemeinen Formeln II, III und IV.

Chlorchalcon wurde gemäß einem Verfahren von Krasovitskii hergestellt (B.M. Krasovitskii, D.G. Pereyaslova, ZH. Vsesoyuznogo Obscchestva im. D.I. Mendeleeva, 10 (6), 704 (1965)).

Aminochalcon, bei dem R11 und R12 Methyl sind, ist gewerblich erhältlich und wurde für orientierende Untersuchungen eingesetzt.

Das Aminochalcon der allgemeinen Formel V, bei der R11 und R12 beide CH2CH2-SO3Na sind, wurde über eine mehrstufige Synthese hergestellt.

Eine weitere bevorzugte Substanz ist somit die der Formel V.

Die Quenchreaktion kann auch durch Metallionen hervorgerufen werden. Es sind somit auch solche Verbindungen als Referenzsubstanzen erfindungsgemäß geeignet, deren Lumineszenzsignal bei Kontakt mit Metallionen gequencht wird.

Insbesondere ist es möglich, Referenzsubstanzen auszuwählen, bei denen das Lumineszenzsignal durch den Kontakt mit Calcium- bzw. Magnesiumionen gequencht wird. Hierfür kommen z.B. Fluoreszenzfarbstoffe infrage, die bei einer Komplexbildung mit Ca2+ und/oder Mg2+ aufhören zu fluoreszieren bzw. sehr reduziert fluoreszieren.

Ein Beispiel für einen solchen Fluoreszenzfarbstoff ist FuraRED, welcher von der Firma Molprobes erhältlich ist. FuraRED hat die folgende Struktur:

Eine dritte erfindungsgemäß geeignete Referenzsubstanz ist eine, welche auf eine pH-Änderung anspricht. Es handelt sich hierbei um Substanzen, deren Lumineszenzsignal bei einer pH-Wert-Änderung gequencht wird.

Dies ist besonders vorteilhaft für Proben, wie z.B. Blut. Blut hat eine sehr hohe Pufferkraft und ist daher in der Lage, einen vorher im Testsystem eingestellten pH-Wert zu überspielen. Ist das Testsystem beispielsweise auf einen niedrigeren pH-Wert eingestellt (beispielsweise pH 5), wird bei Auftrag einer Blutprobe das Testsystem umgepuffert auf pH 7.

Ein Beispiel für eine solche Referenzsubstanz ist LysoSensor Blue DND-167 von Molprobes (Katalog Nr. L7533, ABS/EM' (nm): 373/425, PKA: 5,1, geeigneter pH-Bereich: 4,5-6,0).

LysoSensor Blue DND-167

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe durch Lumineszenz, umfassend

  • (i) Bereitstellen eines Trägers, umfassend eine Analyt-spezifische Substanz, die in der Lage ist, bei Kontakt mit dem Analyten ein erstes Lumineszenzsignal abzugeben, und umfassend eine Referenzsubstanz, die in der Lage ist, ein zweites Lumineszenzsignal abzugeben, welches durch Kontakt mit der flüssigen Probe gequencht wird,
  • (ii) Inkontaktbringen des Trägers mit einer flüssigen Probe, die einen nachzuweisenden Analyten umfasst, und
  • (iii) Messen der Lumineszenzsignale und Nachweisen des Analyten durch Vergleichen der Lumineszenzsignale, wobei ein einziger Detektor zum Messen der Lumineszenzsignale der Analyt-spezifischen Substanz und der Referenzsubstanz verwendet wird.

Bei diesem Verfahren ist es ebenfalls, wie oben bereits erwähnt, bevorzugt, eine Referenzsubstanz und eine Analyt-spezifische Substanz zu verwenden, die im Wesentlichen im gleichen Wellenlängenbereich angeregt werden und emittieren. Vorzugsweise wird zunächst das Lumineszenzsignal der Referenzsubstanz in Abwesenheit der Probe gemessen, anschließend wird die flüssige Probe aufgebracht, und es wird das Lumineszenzsignal gemessen, welches von der Probe hervorgerufen wird. Dies geschieht durch Verwendung eines einzigen Detektors.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Substanz, die in der Lage ist, ein Lumineszenzsignal abzugeben, welches bei Kontakt mit einer Flüssigkeit gequencht wird, als Referenzsubstanz in einem Verfahren zum Nachweis eines Analyten, wobei ein einziger Detektor zum Nachweis des Analyten und zum Messen der Referenzsubstanz verwendet wird.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Substanz, die in der Lage ist, ein Lumineszenzsignal abzugeben, welches bei Kontakt mit einer Flüssigkeit gequencht wird, als Referenzsubstanz zur Bestimmung der Probenmenge, wobei ein einziger Detektor zum Messen einer Analyt-spezifischen Substanz und der Referenzsubstanz verwendet wird.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer Substanz, die in der Lage ist, ein Lumineszenzsignal abzugeben, welches bei Kontakt mit einer Flüssigkeit gequencht wird, als Referenzsubstanz zur Feststellung der Funktionsbereitschaft eines Systems zum Nachweis eines Analyten.

Beschreibung der Figuren

1 zeigt den Messbereich für die Messung für das Lumineszenzsignal eines Analyten mit oder ohne Referenzsubstanz gemäß Verfahren des Standes der Technik.

2 zeigt die Kinetik des Quenchens von Dimethylaminochalcon bei Benetzung.

3 zeigt ein Testsystem unter Verwendung eines Chalcons mit 0,05 Feststoffgehalt. Als Proben wurden 4 Lösungen, jeweils enthaltend 0 mg/dl, 100 mg/dl, 300 mg/dl und 700 mg/dl Glucose verwendet. Es wurde die Intensität der Lumineszenz gemessen und mit dem gequenchten Signal, das von der Kontrollprobe mit 0 mg/dl Glucose stammte, verglichen. Die Differenz-Counts sind maximal, wenn ausreichend Probe aufgetragen wurde. Sie werden immer kleiner, je weniger Probe aufgetragen wird.

4 zeigt die Anzahl der Counts pro Volumen im selben Testformat wie in 3 beschrieben. Ab ca. 1 &mgr;l wird ein Plateau erreicht, unterhalb dessen keine zuverlässige Messung möglich ist.

5 zeigt das Absorptions- und Emissionsspektrum von FuraRED.

6 zeigt die Fluoreszenzemission von LysoSensor Blue DND-167 in Abhängigkeit des pH-Werts.

Beispiele Beispiel 1

In einer einfachen Rezeptur wurde die Funktion des Dimethylaminochalcons überprüft. Da dieses Chalcon nicht wasserlöslich ist, wurde Methanol als Wasserersatz verwendet.

Dabei war schon visuell erkennbar, dass das unter UV-Licht in trockenem Zustand stark fluoreszierende Chalcon schlagartig keine Fluoreszenz mehr zeigt, wenn ein Tropfen MeOH aufgbracht wird.

Testrezeptur I:

Das Chalcon wurde in MeOH gelöst und mit dem Transpafill versetzt. Zu dieser Mischung wurde Propiofan gegeben und die Aufschlemmung homogonisiert. Anschließend wurde die Mischung auf eine Pokalonfolie aufgerakelt und bei 50°C für 5 Minuten getrocknet.

Die in 2 dargestellte Messung zeigt die Kinetik des Quenchens, wenn ein Tropfen Methanol auf die grünlich leuchtende Schicht, die auf die Pokalonfolie aufgerakelt wurde, aufgebracht wird. Hier sieht man ganz deutlich, dass ein schlagartiges Quenchen bei Aufbringen von Methanol erreicht wird, was jedoch reversibel ist, sobald das Methanol wieder von der Chalconschicht verdunstet d.h. trocknet.


Anspruch[de]
System für den Lumineszenz-Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe, umfassend einen Träger, umfassend

eine Analyt-spezifische Substanz, die in der Lage ist, bei Kontakt mit dem Analyten ein erstes Lumineszenzsignal abzugeben, und

eine Referenzsubstanz, die in der Lage ist, ein zweites Lumineszenzsignal abzugeben, welches durch Kontakt mit der flüssigen Probe gequencht wird, wobei ein einziger Detektor zum Messen der Lumineszenzsignale der Analyt-spezifischen Substanz und der Referenzsubstanz verwendet wird.
System nach Anspruch 1, weiterhin umfassend eine Auswertungseinheit zum Bestimmen der Probenmenge, der Menge des Analyten und/oder der Funktionsbereitschaft des Trägers. System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Analyt-spezifische Substanz und die Referenz Fluorophoren sind. System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Referenzsubstanz ausgewählt ist aus Substanzen, deren Lumineszenzsignal bei Kontakt mit Wasser gequencht wird. System nach Anspruch 4, wobei die Referenzsubstanz eine Verbindung der Formel I ist,
wobei einer der Reste R2, R3 und R5 ausgewählt ist aus NR11R12 und SO3Na, und die übrigen Substituenten R1, R4, R6, R7, R8, R9 und R10 beliebige Substituenten sein können und R11 und R12 ausgewählt sind aus Wasserstoff, C1-C4-Alkyl und CH2CH2-SO3Na.
System nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Referenzsubstanz ausgewählt ist aus Substanzen, deren Lumineszenzsignal bei Kontakt mit Metallionen gequencht wird. System nach Anspruch 6, wobei die Referenzsubstanz FuraRed ist. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Referenzsubstanz ausgewählt ist aus Substanzen, deren Lumineszenzsignal bei einer pH-Wert-Änderung gequencht wird. System nach Anspruch 8, wobei die Referenzsubstanz LysoSensor Blue DND-167 ist. System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Analyt-spezifische Substanz und die Referenzsubstanz in einem im wesentlichen gleichen Wellenlängenbereich angeregt werden und emittieren. Verwendung einer Substanz, die in der Lage ist, ein Lumineszenzsignal abzugeben, welches bei Kontakt mit einer Flüssigkeit gequencht wird, als Referenzsubstanz in einem Verfahren zum Nachweis eines Analyten, wobei ein einziger Detektor zum Nachweis des Analyten und zum Messen der Referenzsubstanz verwendet wird. Verwendung einer Substanz, die in der Lage ist, ein Lumineszenzsignal abzugeben, welches bei Kontakt mit einer Flüssigkeit gequencht wird, als Referenzsubstanz zur Bestimmung der Probenmenge, wobei ein einziger Detektor zum Messen einer Analyt-spezifischen Substanz und der Referenzsubstanz verwendet wird. Verwendung einer Substanz, die in der Lage ist, ein Lumineszenzsignal abzugeben, welches bei Kontakt mit einer Flüssigkeit gequencht wird, als Referenzsubstanz zur Feststellung der Funktionsbereitschaft eines Systems zum Nachweis eines Analyten. Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer flüssigen Probe durch Lumineszenz, umfassend

(i) Bereitstellen eines Trägers, umfassend eine Analyt-spezifische Substanz, die in der Lage ist, bei Kontakt mit dem Analyten ein erstes Lumineszenzsignal abzugeben, und umfassend eine Referenzsubstanz, die in der Lage ist, ein zweites Lumineszenzsignal abzugeben, welches durch Kontakt mit der flüssigen Probe gequencht wird,

(ii) Inkontaktbringen des Trägers mit einer flüssigen Probe, die einen nachzuweisenden Analyten umfasst, und

(iii) Messen der Lumineszenzsignale und Nachweisen des Analyten durch Vergleichen der Lumineszenzsignale, wobei ein einziger Detektor zum Messen der Lumineszenzsignale der Analyt-spezifischen Substanz und der Referenzsubstanz verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Lumineszenzsignal der Referenzsubstanz vor dem in Kontaktbringen des Trägers mit der flüssigen Probe gemessen wird.






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