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Dokumentenidentifikation DE60127561T2 13.12.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001309604
Titel PHAGEN-ABHÄNGIGE SUPERPRODUKTION BIOLOGISCH AKTIVER PROTEINE UND PEPTIDE
Anmelder Phage Biotechnology Corp., Tustin, Calif., US
Erfinder KORDYUM, Vitaliy A., 254053 Kiev-053, UA;
CHERNYKH, Svitlana I., 252127 Kiev-127, UA;
SLAVCHENKO, Iryna Yu, 253068 Kiev-068, UA;
VOZIANOV, Oleksandr F., 252025 Kiev-025, UA
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 60127561
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 15.08.2001
EP-Aktenzeichen 019640143
WO-Anmeldetag 15.08.2001
PCT-Aktenzeichen PCT/US01/25477
WO-Veröffentlichungsnummer 2002014468
WO-Veröffentlichungsdatum 21.02.2002
EP-Offenlegungsdatum 14.05.2003
EP date of grant 28.03.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 13.12.2007
IPC-Hauptklasse C07H 21/04(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12P 21/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07K 14/50(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/73(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft eine rekombinante DNA-Technologie und genauer ein neues Verfahren zum Verstärken der Produktion von heterologen Proteinen in bakteriellen Wirtszellen. Das offenbarte Verfahren umfasst das Infizieren von Wirtszellen, die ein Plasmid enthalten, das das Gen von Interesse codiert, das funktionell mit dem T7-Promotor verknüpft ist, wobei der Bakteriophage &lgr; die Lyse der bakteriellen Wirtszellen induziert. Die Superproduktion kann in ausgewählten Wirtszellen erzielt werden, entweder wenn das Plasmid alleine mindestens eine Kopie der heterologen DNA trägt, oder wenn sowohl das Plasmid als auch der Phage &lgr; mindestens eine Kopie der heterologen DNA tragen.

Beschreibung des verwandten Stands der Technik

Derzeit erlauben Gentechnik-Verfahren das Bilden von Mikroorganismus-Stämmen, die zum Produzieren von wesentlichen Mengen von verschiedenen biologisch aktiven Substanzen, die wichtige Anwendungen in der Medizin und Industrie haben, in der Lage sind. Typischerweise werden die Plasmidvektoren, in die ein heterologes Gen inseriert worden ist, verwendet, um bakterielle Wirtszellen zu transformieren. Verschiedene Stämme von E. coli werden häufig als Empfängerzellen verwendet. Unter Verwendung von solchen Plasmid-abhängigen Transformierungs-Verfahren sind E. coli-Zellen konstruiert worden, um eine Vielzahl von wertvollen menschlichen Peptiden und Proteinen, einschließlich Insulin, &ggr;-Interferon, eine Reihe von Interleukinen, Superoxiddismutase, Plasminogenaktivator, Tumornekrosefaktor, Erythropoietin, usw., zu produzieren. Diese Substanzen werden entweder schon in der medizinischen Praxis verwendet oder verschiedenen Stadien von klinischen Studien unterzogen.

Das Plasmid-Verfahren hat jedoch schwerwiegende Nachteile. Es ist technologisch kompliziert, da das erwünschte Produkt nach der Biosynthese, die ein mehrstufiger Prozess ist, aus den bakteriellen Zellen extrahiert werden muss. Zum Beispiel involviert die Interferon-Extraktion den Aufschluss von Zellen, Pufferextraktion, Polyethylemenin-Prozessierung, Beleuchtung, Sedimentierung durch Ammoniumsulfat, Dialyse und Zentrifugation (Goeddel, EP 0043980). Die Notwendigkeit von solchen Extraktions- und Reinigungsschritten verkompliziert nicht nur die Produktionstechnologie des rekombinanten Produkts sondern resultiert auch in wesentlichen Verlusten, besonders während der industriellen Massenproduktion.

Ein weiterer komplizierender Faktor ist, dass die hergestellten eukaryontischen Proteine bei relativ hohen Expressionsspiegeln der geclonten Gene dazu tendieren, im Cytoplasma von E. coli als unlösliche Aggregate zu akkumulieren, die oft mit Zellmembranen assoziiert sind. Folglich sollten die oben bereits diskutierten, schwierigen Extraktions- und Reinigungsverfahren mit zusätzlichen technischen Vorgehensweisen ergänzt werden, die mit der Extraktion der unlöslichen Einschlusskörper in Bezug stehen. Normalerweise werden die unlöslichen Proteine unter Verwendung von ionischen Detergenzien wie SDS oder Laurylsarcosin bei erhöhten Temperaturen oder in der Anwesenheit von denaturierenden Mitteln wie 8 M Harnstoff oder 6–8 M Guanidin-HCl gelöst.

Das Endstadium der Reinigung involviert oft die Renaturierung und Re-Oxidation der gelösten Polypeptide, was erforderlich ist, um die funktionelle Aktivität wiederherzustellen. Disulfidbindungen, die für eine korrekte Faltung des Proteins in seiner natürlichen Konformation notwendig sind, sollten wieder gebildet werden. Renaturierungs-Vorgehensweisen wie Disulfid-Austausch können teure und relativ toxische Reagenzien wie Glutathion und oxidiertes 2-Mercaptoethanol oder Dithiothreit verwenden. Weiterhin kann die Endausbeute der biologisch aktiven gentechnisch hergestellten Proteine relativ niedrig sein. Darüber hinaus kann die Anwesenheit sogar von Spuren-Konzentrationen der toxischen Reagenzien, die benötigt werden, um die Sekundär- und Tertiärproteinstruktur zu lösen und dann wiederherzustellen, eine folgende klinische Anwendung der Proteine verhindern. Daher verkompliziert die Herstellung des Zielproteins in der Form von unlöslichen Einschlusskörpern innerhalb der bakteriellen Wirtszellen nicht nur die Produktion von rekombinanten Proteinen und resultiert in einem verminderten Ertrag sondern kann auch das endgültige Protein unbrauchbar für die klinische Verwendung machen (Fisher, B., Sumner, I., Goodenough, P. Biotech. and Bioeng. 41: 3–13, 1993).

Die technologischen Schwierigkeiten, die mit der Extraktion von Proteinen, die durch die Expression von heterologen Genen von Plasmid-transformierten bakteriellen Wirtszellen produziert werden, assoziiert sind, können durch Infizieren der transformierten bakteriellen Wirtszellen mit einem Bakteriophagen bewältigt werden, dessen lytischer Signalweg in der Lyse der Trägerzelle resultiert. So kann das erwünschte Protein einfach in das Kulturmedium freigesetzt werden (Breeze A.S. GB 2 143 238A). Dementsprechend offenbarte Breeze ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags eines Enzyms, das in E. coli durch Infizieren der bakteriellen Zellen mit dem Phagen &lgr;, der eine Temperatur-empfindliche Mutation in cI trägt, produziert wird, um eine kontrollierte Lyse zu liefern. Das cI-Genprodukt ist ein Repressor der frühen Transkription und blockiert folglich die Transkription der späten Region der Phagen-DNA, die für die Kopf-zu-Schwanz-Anordnung und Zell-Lyse erforderlich ist (Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Bakteriophagen, die eine Temperatur-empfindliche Mutation in cI tragen, sind in der Lage, den lysogenen Status zu etablieren und beizubehalten, so lange die Zellen bei einer Temperatur vermehrt werden, die es dem cI-Genprodukt erlaubt, die Transkription von Phagen-Genen zu unterdrücken, die für ein lytisches Wachstum nötig sind. Dementsprechend können die transformierten bakteriellen Wirtszellen bei 30°C kultiviert werden, wobei sich die cI-vermittelte Unterdrückung der Phagen-DNA-Transkription fortsetzt und der Phage im lysogenen Zustand bleibt, bis das Stadium der maximalen Fermentproduktion erreicht ist. Danach kann die Kulturtemperatur für 30 Minuten auf 42°C erhöht werden, um den cI-Repressor zu inaktivieren und dem Phagen zu erlauben, seine lytische Entwicklung zu beginnen. Die Wirtszellen können dann für 2-3 Stunden bei 30°C inkubiert werden, um eine vollständige Lyse und die Freisetzung des Enzyms zu erlauben (Breeze A.S. GB 2 143 238A).

Obwohl Breeze die Freisetzung von Proteinen aus bakteriellen Produzenten-Zellen lehrt, erfordert sie das Kultivieren der Produzenten bei Temperaturen, die 30°C nicht übersteigen, was nicht die optimale Temperatur für das Züchten von E. coli-Zellen ist. Die Synthese bei einer optimalen Temperatur (37°C) ist nicht möglich, da die Zellen bei Temperaturen, die 32°C übersteigen, eine Lyse erleiden, bevor sie aufgrund der Entwicklung des Temperatur-empfindlichen lytischen Pro-Phagen das Stadium der maximalen Fermentakkumulierung erreichen. Darüber hinaus kann die Inkubation der bakteriellen Wirtszellen bei 42°C für 30 min, wie von Breeze offenbart, Proteasen aktivieren, die das Zielprotein zerstören.

Auerbach et al. (U.S.-Patent Nr. 4,637,980) verwendeten ein DNA-Fragment des Phagen &lgr; zum Induzieren der lytischen Freisetzung von rekombinanten Produkten. In jenem Verfahren, wie Breeze, wurde die Temperatur-empfindliche Mutation im &lgr; cI-Genprodukt verwendet, um eine Temperatur-abhängige Lyse der bakteriellen Wirtszellen zu liefern. Das &lgr;-DNA-Fragment in Auerbach behielt die funktionellen Endolysin-codierenden Gene N, Q, R und S zum Produzieren von Lysozym nach der Inaktivierung des cI-Repressors bei 42°C. Die meisten der verbleibenden Phagen-Gene wurden deletiert; Mutationen in den O- und P-Genen verhinderten die Replikation der Phagen-DNA. Folglich war die &lgr;-DNA nicht ein vollständig funktioneller Phage, der zum Modulieren der Expression des Zielgens in der Lage war. Darüber hinaus war die &lgr;-DNA von Auerbach nicht für die Verwendung als ein Vektor zum Tragen von Zielgenen geeignet. Weiterhin kann, wie oben diskutiert, die Inkubation der bakteriellen Wirtszellen bei 42°C bis 44°C für 90-120 min, wie von Auerbach offenbart, Proteasen aktivieren, die das Zielprotein zerstören.

Zusätzlich zum Bereitstellen der lytischen Freisetzung des intakten Proteins von den bakteriellen Produzenten-Zellen sind Bakteriophagen auch als eine Alternative zu bakteriellen Plasmid-basierenden Vektoren, zum Einbringen von heterologer DNA in bakterielle Wirtszellen verwendet worden. (Murray, N.E. und Murray, K., Nature 251: 476–481, 1974; Moir, A., Brammar, W.J., Molec. gen. Genet. 149: 87–99, 1976). Typischerweise wird die Amplifizierung von Genen und ihren Produkten während des lytischen Wachstums des Phagen erzielt, in dem das Phagen-Genom in die bakterielle Wirts-DNA integriert wird (Panasenko, S.M., Cameron, J.R., Davis, R.V., Lehman, L.R., Science 196: 188–189, 1977; Murray, N.E. und Kelley, W.S., Molec. Gen. Genet. 175: 77–87, 1979; Walter, F., Siegel, M., Malke, H., 1990, DD 276,694; Mory, Y., Revel, M., Chen, L., Sheldon, I.F., Yuti-Chernajovsky, 1983, GB 2,103,222A). Normalerweise werden entweder lysogene Kulturen des rekombinanten Phagen &lgr; zum Infizieren der bakteriellen Wirtszellen verwendet, oder „aufgewärmte" bakterielle Kulturen, die schon den rekombinanten lysogenen Phagen &lgr; beherbergen, werden gezüchtet, um die Expression der heterologen Gene zu amplifizieren.

Obwohl es Beispiele der erfolgreichen Verwendung von &lgr;-Vektoren für die Expression von heterologen Genen gibt, sind &lgr;-Vektoren vorwiegend für das Gen-Clonieren verwendet worden. Sobald sie cloniert sind, werden die Gene für eine wirksamere Expression in Plasmidvektoren transferiert. Zum Beispiel betrug die Menge von Interferon im Zell-Lysat 7–8 × 108 Einheiten/Liter, wenn E. coli durch den Phagen &lgr; Charon 4A C15 infiziert wird, der das menschliche &bgr;-Interferon-Gen enthält. Nachdem das DNA-Fragment, das das Zielgen trägt, vom Phagen zum Plasmid re-cloniert wurde, stieg die &bgr;-Interferon-Ausbeute auf 1 × 108 Einheiten/Liter (Moir, A., Brammar, W.J., Molec. gen. Genet. 149: 87–99; 1976).

Um den Ertrag des heterologen Proteins zu steigern, das in bakteriellen Wirtszellen durch rekombinante &lgr;-Vektoren erzeugt wurde, sind Mutationen im Phagen-Genom eingebracht worden, die bewirken, dass der Phage seine Fähigkeit verliert, die bakterielle Zell-Lyse zu iniziieren. Eine erhöhte Ausbeute wird durch Verlängern des Zeitraums, während dessen das heterologe Gen durch die bakteriellen Wirtszellen exprimiert wird, erzielt. So war zum Beispiel die Ausbeute der DNA-Ligase 1 in lysogenen Kulturen, die den &lgr;-gt4ligS-Prophagen mit einer Amber-Mutation im S-Gen enthielten, fünfmal größer als die Ausbeute von DNA-Ligase 1 in lysogenen Kulturen, die den &lgr;-gt4lig-Prophagen ohne die Amber-Mutation enthielten (Panasenko, S.M., Cameron, J.R., Davis, R.V., Lehman, L.R., Science 196: 188–189, 1977). Das Phage &lgr;-S-Protein ist für die Lyse erforderlich; daher akkumulieren S-Mutanten große Zahlen von intrazellulären Vorläufer-Phagenpartikeln sowie das Zielprotein, ohne die Wirtszellen zu lysieren (Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Ähnliche Anstiege in der Ausbeute der DNA-Polymerase 1 wurden für lysogene Kulturen, die den rekombinanten Phagen &lgr; mit Amber-Mutationen in den S- und Q-Genen enthielten, im Vergleich zum rekombinanten Phagen &lgr; ohne die Amber-Mutationen berichtet (Murray, N.E., und Kelley, W.S., Molec. gen. Genet. 175: 77–87, 1979). Das Phage &lgr;-Q-Protein ist für die Transkription der späten Region der Phagen-DNA erforderlich, die viele Gene einschließt, die in die Kopf- und Schwanz-Anordnung und Zell-Lyse involviert sind (Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Im U.S.-Patent Nr. 4,710,463 offenbart Murray das Lysogenisieren eines nicht-unterdrückenden (Su°) Stamms von E. coli mit dem Phagen &lgr;, der die Temperaturempfindliche Mutation in cI sowie Mutationen in den &lgr;-S- und -E-Genen enthält. Folglich führt die verlängerte Kultivierung der lysogenen E. coli bei 37°C zu hohen Spiegeln der Produktion des rekombinanten Proteins, das innerhalb der Zellen zurückgehalten wird, da diese nicht durch die Phagen-Genprodukte auf dem normalen Weg lysiert werden, und da das rekombinante Phagen-Genom nicht abgekapselt ist, bleibt es für die Transkription verfügbar.

Trotz der erhöhten Ausbeute der heterologen Proteine, die unter Verwendung von &lgr;-Vektoren mit N-, R-, S-, Q- und/oder E-Mutationen möglich ist, können die potenziellen technischen Vorteile von Bakteriophagen-Vektoren, die mit der lytischen Freisetzung von Zielproteinen in Beziehung stehen, mit diesen Mutationen verloren gehen, weil die Zielproteine in der bakteriellen Zelle akkumulieren. Daher sollten, wenn ein Lyse-defekter mutanter &lgr;-Vektor für die Produktion eines heterologen Proteins verwendet wird, die Extraktions- und Reinigungsschritte durchgeführt werden, die vorstehend zusammen mit den resultierenden Verlusten für bakterielle Zellen diskutiert werden, die durch Plasmidvektoren transformiert wurden.

Das T7-Promotor/T7-RNA-Polymerase-System ist nützlich für die Expression in hohen Spiegeln von rekombinanten Proteinen. Die Verwendung des T7-Promotors erfordert die Anwesenheit der T7-RNA-Polymerase. Die T7-RNA-Polymerase kann durch Induktion eines rekombinanten T7-Polymerase-Gens, das auf einem Lysogen im Wirtsstamm enthalten ist, oder durch Transformierung mit einem Plasmid für die Expression des T7-Polymerase-Gens bereitgestellt werden. Die T7-RNA-Polymerase ist sehr spezifisch für ihren eigenen Promotor. Transkriptionsreaktionen des T7-Promotors sind sehr wirksam, und viele Kopien der Volllängen-RNA können von jeder Matrize produziert werden.

Zusammenfassung der Erfindung

In einer Ausführungsform wird ein Verfahren zum Produzieren eines biologisch aktiven Proteins offenbart, umfassend die Schritte von:

Transformieren eines Stamms von E. coli mit einem Plasmid, das mindestens eine Kopie eines exprimierbaren Gens, das ein biologisch aktives Protein codiert, funktionell verknüpft mit einem T7-Polymerase-Promotor aufweist, wobei der E. coli-Stamm zum Exprimieren des Gens für die T7-RNA-Polymerase in der Lage ist;

Infizieren der transformierten bakteriellen Wirtszelle mit einem Bakteriophagen, der zum Vermitteln einer verzögerten Lyse in der Lage ist; und

Kultivieren der E. coli-Wirtszelle unter einer Kulturbedingung, die das lytische Wachstum der Zelle ohne Lyse induziert, bis ein erwünschter Spiegel der Produktion des Proteins erreicht ist, wobei das Protein als ein lösliches, biologisch aktives Protein produziert wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform hat der Bakteriophage eine Temperatur-empfindliche Mutation. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform ist die Temperatur-empfindliche Mutation cI857.

Vorzugsweise werden die E. coli-Wirtszellen bei einer Temperatur gezüchtet, die das lytische Wachstum des Bakteriophagen vor dem Kultivierungsschritt verhindert.

In einer bevorzugten Ausführungsform hat der Bakteriophage eine Mutation in mindestens einem Gen, das zum Vermitteln einer verzögerten Lyse in der Lage ist. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform wird das mindestens eine Gen, das zum Vermitteln einer verzögerten Lyse in der Lage ist, aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus N, Q und R.

In einer bevorzugten Ausführungsform produziert der Stamm von E. coli einen Suppressor für die Reparatur von Amber-Mutationen.

In einer alternativen Ausführungsform fehlt dem Stamm von E. coli ein Suppressor für die Reparatur von Amber-Mutationen.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird der infizierende Bakteriophage in einer Multiplizität der Infektion im Bereich von etwa 1 bis etwa 100 geliefert. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform wird der infizierende Bakteriophage in einer Multiplizität der Infektion im Bereich von etwa 10 bis etwa 25 geliefert.

Vorzugsweise ist die Bakteriophagen-vermittelte verzögerte Lyse des Stamms von E. coli bei höheren Multiplizitäten der Infektion im Vergleich zu niedrigeren Multiplizitäten der Infektion verzögert.

In einer Ausführungsform codiert das exprimierbare Gen einen menschlichen sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktor. In einer alternativen Ausführungsform enthält der menschliche saure Fibroblasten-Wachstumsfaktor 134 Aminosäuren. In einer anderen alternativen Ausführungsform enthält der menschliche saure Fibroblasten-Wachstumsfaktor 140 Aminosäuren. In einer anderen alternativen Ausführungsform enthält der menschliche saure Fibroblasten-Wachstumsfaktor 146 Aminosäuren. In einer anderen alternativen Ausführungsform enthält der menschliche saure Fibroblasten-Wachstumsfaktor 155 Aminosäuren. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform hat der menschliche saure Fibroblasten-Wachstumsfaktor die Sequenz, wie in SEQ ID NO:1 dargestellt.

In einer Ausführungsform codiert das exprimierbare Gen ein menschliches Wachstumshormon. In einer alternativen Ausführungsform codiert das exprimierbare Gen ein menschliches Interferon. In noch einer anderen Ausführungsform codiert das exprimierbare Gen eine E. coli-Methionin-Aminopeptidase.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Gen für die T7-RNA-Polymerase unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform ist der induzierbare Promotor ein IacUV5-Promotor.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Produzieren eines biologisch aktiven Proteins geliefert, das die Schritte umfasst von:

  • a) Züchten eines ersten Stamms von E. coli-Zellen, die einen Stamm des Bakteriophagen &lgr; beherbergen, wobei der Bakteriophage &lgr; eine Temperaturempfindliche Mutation aufweist,
  • b) Anpassen der Temperatur, um die Lyse des ersten Stamms von E. coli-Zellen und die Freisetzung des Bakteriophagen &lgr; zu liefern,
  • c) Bereitstellen eines zweiten Stamms von E. coli-Zellen, die mit einem Plasmid transformiert worden sind, das mindestens eine Kopie eines exprimierbaren Gens aufweist, das das biologisch aktive Protein codiert, wobei das exprimierbare Gen funktionell mit einem T7-Polymerase-Promotor unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors verknüpft ist, wobei der zweite Stamm der E. coli-Zellen induziert werden kann, das Gen für die T7-RNA-Polymerase durch Zugabe eines Induzierers zu exprimieren;
  • d) Infizieren des zweiten Stamms von E. coli-Zellen mit dem Bakteriophagen &lgr;, der vom ersten Stamm von E. coli-Zellen freigesetzt wurde; und
  • e) Inkubieren des infizierten zweiten Stamms von E. coli-Zellen in einem Kulturmedium, das den Induzierer enthält, sodass das Protein produziert und bei der Lyse des zweiten Stamms von E. coli-Zellen in das Kulturmedium freigesetzt wird, wobei das Protein als ein lösliches, biologisch aktives Protein in einer Konzentration von mehr als 100 Mikrogramm/ml produziert wird.

In der derzeit offenbarten Erfindung ist auch eine chemisch synthetisierte Nucleinsäure enthalten, die im Wesentlichen aus der Sequenz besteht, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist.

Zu Zwecken des Zusammenfassens der Erfindung und der Vorteile, die über den Stand der Technik erreicht worden sind, sind bestimmte Themen und Vorteile der Erfindung oben beschrieben worden. Natürlich muss verstanden werden, dass nicht notwendigerweise alle solchen Themen oder Vorteile gemäß irgendeiner bestimmten Ausführungsform der Erfindung erzielt werden können. Daher werden zum Beispiel Fachleute anerkennen, dass die Erfindung auf eine Weise eingeschlossen oder ausgeführt werden kann, die einen Vorteil oder eine Gruppe von Vorteilen erzielt oder optimiert, wie es hierin gelehrt wird, ohne notwendigerweise andere Themen oder Vorteile zu erzielen, wie es hierin gelehrt oder nahegelegt werden kann.

Weitere Aspekte, Eigenschaften und Vorteile dieser Erfindung werden aus der detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen, die folgen, offensichtlich werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Diese und andere Eigenschaften der Erfindung werden jetzt mit Bezugnahme auf die Zeichnungen der bevorzugten Ausführungsformen beschrieben werden, die die Erfindung illustrieren und nicht einschränken sollen.

1 zeigt die chemisch synthetisierte Nucleotidsequenz für den menschlichen sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktor (155 Aminosäuren) (SEQ ID NO: 1), der durch Substitution der natürlich vorkommenden Codons mit Codons, die in hoch exprimierten E. coli-Proteinen gefunden werden, modifiziert worden ist, und die translatierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2).

2 zeigt die Modifizierungen, die in den chemisch synthetisierten haFGF 155-Codons gemacht wurden. FGF fr HUMECGFB ist die Sequenz, die von GenBank (bei NCBI) erhalten wurde (SEQ ID NO: 3). HaFGF 155 ist die chemisch synthetisierte Sequenz gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung (SEQ ID NO: 1).

3 zeigt das pET24-155@rev-Konstrukt, das das chemisch synthetisierte haFGF 155-Gen enthält (SEQ ID NO: 1).

4 zeigt HPLC-gereinigten haFGF 155. Im Elektrophorese-Diagramm: Spur 1,10 l des konditionierten Mediums, das den rekombinanten haFGF 155 enthält; Spur 2,7 l Heparin-Sepharose-gereinigter rekombinanter haFGF 155 (0,45 g/l); Spur 3,14 l von 80 l des HPLC-gereinigten haFGF 155. Die nicht markierte Spur ganz links enthält Molekulargewichts-Standards.

5 zeigt das pET24-134 @rev-Konstrukt, das das chemisch synthetisierte haFGF 134-Gen enthält (SEQ ID NO: 4).

6 zeigt die chemisch synthetisierte Nucleotidsequenz für den menschlichen sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktor (134 Aminosäuren) (SEQ ID NO: 4), der durch Substitution der natürlich vorkommenden Codons mit Codons, die in hoch exprimierten in E. coli-Proteinen gefunden werden, modifiziert worden ist, und die translatierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 5).

7 zeigt das pET24-140 @rev-Konstrukt, das das chemisch synthetisierte haFGF 140-Gen enthält (SEQ ID NO: 6).

8 zeigt die chemisch synthetisierte Nucleotidsequenz für den menschlichen sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktor (140 Aminosäuren) (SEQ ID NO: 6), der durch Substitution der natürlich vorkommenden Codons mit Codons, die in hoch exprimierten in E. coli-Proteinen gefunden werden, modifiziert worden ist, und die translatierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 7).

9 zeigt das pET24ap-inf@rev-Konstrukt, das das chemisch synthetisierte Interferon-2b-Gen enthält (SEQ ID NO: 10).

10 zeigt die chemisch synthetisierte Nucleotidsequenz für das menschliche Interferon-2b (SEQ ID NO: 10), die durch Substitution der natürlich vorkommenden Codons mit Codons, die in hoch exprimierten in E. coli-Proteinen gefunden werden, modifiziert worden ist, und die translatierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 11).

11 zeigt ein 12,5% SDS-Polyacrylamid-Gel, enthaltend Proteine, die durch das hierin beschriebene Phagen-abhängige Verfahren produziert wurden: Spur 1, Molekulargewichts-Standards, 2 g von jedem Standard; Spur 2,40 l Kulturmedium, enthaltend das rekombinante FGF 134-Protein; Spur 3,40 l Kulturmedium, enthaltend das rekombinante FGF 140-Protein, Spur 4,40 l Kulturmedium, enthaltend das rekombinante Interferon-2B; Spur 5,40 l Kulturmedium, enthaltend das rekombinante FGF 155-Protein; Spur 6,40 l Kulturmedium, enthaltend das rekombinante menschliche Wachstumshormon, Spur 7,40 l Kulturmedium, enthaltend die rekombinante Methionin-Aminopeptidase, Spur 8,40 l Kulturmedium, enthaltend -Galactosidase von E. coli.

12 zeigt ein 12,5% SDS-Polyacrylamid-Gel, enthaltend rekombinante Proteine, die gemäß der derzeit beanspruchten Erfindung gereinigt wurden: Spur 1, Molekulargewichts-Standards; Spur 2,5 g gereinigtes FGF 134-Protein; Spur 3,5 g gereinigtes FGF 140-Protein, Spur 4,5 g gereinigtes FGF 146-Protein, Spur 5,5 g gereinigtes Interferon 2B-Protein, Spur 6,5 g gereinigtes FGF 155-Protein; Spur 7,5 g gereinigtes Methionin-Aminopeptidase-Protein, Spur 8, Molekulargewichts-Standards.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Während die beschriebene Ausführungsform die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, ist es selbstverständlich, dass Modifikationen für Fachleute auftreten werden, ohne den Sinn der Erfindung zu verlassen. Der Schutzbereich der Erfindung soll daher nur durch die angefügten Ansprüche festgelegt werden.

Der Bakteriophage &lgr; ist als ein Vektor nützlich, weil mehr als 40% des viralen Genoms nicht für das lytische Wachstum wesentlich sind. Dieses Gebiet des &lgr;-Genoms, das in der zentralen Region der &lgr;-DNA zwischen den Genen J und N gelegen ist, kann durch heterologe DNA, die ein erwünschtes Produkt codiert, ersetzt werden. Diese Region wird früh während der Infektion transkribiert.

Um die Expression eines Zielgens, dessen Syntheseinformation in dem Gebiet der frühen Gene des Phagen aufgezeichnet ist, zu maximieren, sollten besondere Bedingungen für die Entwicklung des Phagen bereitgestellt werden, um eine korrekte Replikation sicherzustellen. Weiterhin sollte die Transkription des frühen Gebiets, das das Zielgen enthält, gefördert werden, während die Transkription der späteren Gene, die in die Zell-Lyse involviert sind, verlangsamt werden sollte. Dies verlangsamt die Reifung der &lgr;-Partikel und die folgende Zell-Lyse. Folglich werden die frühen Phagen-Produkte, einschließlich des Zielgen-Produkts, in den bakteriellen Zellen akkumulieren. Das Verlangsamen der späten Transkription, wodurch die Expression des Zielgens ausgedehnt wird, kann erreicht werden durch: (1) Mutationen des Phagen-Genoms, die die Expression der späteren Gene blockieren, (2) erhöhte Multiplizität der Infektion und/oder (3) Kultivierung der infizierten bakteriellen Zellen bei einer reduzierten Temperatur.

Der Vorteil des Infizierens von Produzenten-Zellen mit einem Bakteriophagen ist, dass der Phage eine tiefgreifende Neuordnung der ganzen makromolekularen Synthese in den bakteriellen Wirtszellen bewirkt. Durch das Abschalten der bakteriellen Gene können die Phagen das Kopieren des Zielgens erhöhen und folglich den Ertrag des erwünschten Produkts erhöhen.

In einer Ausführungsform des vorliegenden Superproduktionssystems wird der Phage &lgr; mit Amber-Mutationen, die die bakterielle Lyse verzögern (z.B. Q- und R-Mutationen), in einem Stamm von E. coli, bezeichnet als Su°, bereitgestellt, dem der Suppressor fehlt, der für das Korrigieren von Amber-Mutationen im Phagen &lgr; verantwortlich ist. Um einen nicht-unterdrückenden (Su°) Stamm von E. coli zu erhalten, werden Su°-Clone aus der Wildtyp-Su+-Population selektiert. Vorzugsweise wird ein Selektionsmarker, z.B. Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenz, in die Phagen-DNA inseriert.

Die Selektion von nicht-unterdrückenden (Su°) Stämmen von E. coli, zum Beispiel E. coli K 802, wurde mit dem Phagen &lgr; cI857Nam7Nam53 bla tet (hierin nachstehend &lgr; bla N') durchgeführt. Der Stamm E. coli C600 (&lgr; bla N') diente als Quelle des Phagen. Dieser Phage wurde durch Insertion des Plasmids pCV 11 (bla tet) an der EcoRI-Stelle in einen Einzelstellen (EcoRI)-Vektor erhalten, der eine ts-Mutation im Repressor-Gen (cI857) trägt. Dann wurden zwei Amber-Mutationen durch Rekombination in vivo in das Phagen-N-Gen eingebracht.

Die Clone wurden mit dem Phagen &lgr; klar auf nicht-Lysogenität getestet. Zusätzlich zum Phagen &lgr; bla N' wurde der Phage &lgr; cI857Qam117Ram54 verwendet, um auf den Suppressor zu überprüfen.

Wie bekannt ist, ist die Phage &lgr;-N'-Mutante nicht in der Lage, die Wirtszellen zu lysieren, und ist in Zellen in der Form von äußerst instabilen Plasmiden vorhanden. Wenn die Wirtszellen einen Suppressor enthalten, wird die Amber-Mutation phänotypisch korrigiert, das N-Protein wird synthetisiert, und der Phage kann sich lytisch entwickeln. Dieser Unterschied in der Lebensfähigkeit von Su+- und Su°-Zellen, die durch &lgr; N' infiziert wurden, wird als eine Basis für die Selektion von spontan auftretenden Su°-Revertanten von der E. coli-Su+-Zellpopulation verwendet. Der Phage &lgr; mit einem inserierten Plasmid, das die Ampicillin- oder Tetracyclin-Resistenzmarker in Zellen einbrachte, wurde verwendet, um zu verhindern, dass die nicht-lysierenden Su°-Zellen die Suche nach Mutanten maskieren. Der Phage enthält auch eine ts-Mutation im Repressor-Gen, die eine lytische Entwicklung eines solchen Phagen erlaubt, was in Zell-Lyse resultiert.

Wenn das Medium, das mit Ampicillin und Tetracyclin ergänzt ist, nach seiner Infektion mit dem Phagen &lgr; bla N' mit einer Su+-Kultur beimpft wird, sollten sich beim folgenden Züchten bei 43°C einzelne Suppressor-freie Zellen, die den Phagen &lgr; bla N' in der Form von Plasmiden enthalten, auf den Platten entwickeln. Durch Entfernen des Phagen aus den Zellen sollten wir Su°-Derivate der Elternkulturen erhalten. Das Verfahren kann in einige Stadien unterteilt werden.

1. Infektion der Kultur mit dem Phagen &lgr; bla N'

Die Kultur E. coli Su+ wurde auf dem M9-Medium mit Maltose bei 37°C unter intensiver Bewegung zu einer Dichte von 1–2 × 108 Zellen/ml gezüchtet. Die Zellen wurden mit dem Phagen &lgr; bla N' bei einer Multiplizität von 5–10 Partikeln pro Zelle infiziert und für 20 min bei 20° C inkubiert. Unter den Bedingungen ist die Infektionswirksamkeit etwa 100%, zusätzlich zu der Masse von Su+-Zellen infiziert der Phage auch einzelne Su°-Zellen.

2. Selektion von Suppressor-freien Zellen, die den Marker-Phagen enthalten

Nach der Infektion wurden die Zellen auf Agar-Medium, ergänzt mit 12 &ggr;/ml Tetracyclin und 20 &ggr;/ml Ampicillin, ausplattiert und bei 43° C gezüchtet. In 24 h entwickelten sich einzelne Kolonien, die auf Agar-Medium mit Antibiotika re-plattiert und bei 37° C gezüchtet wurden.

3. Entfernen des Phagen &lgr; bla N' aus den selektierten Clonen

Da der Phage &lgr; N' in den E. coli-Su°-Zellen in der Form von äußerst instabilen Plasmiden vorliegt, wurden die selektierten Clone auf selektivem Agar-Medium ohne Antibiotika plattierten und bei 37° C gezüchtet, um den Phagen zu entfernen. Die Zahl der Zellen, die den Phagen in der ersten Passage auf dem Medium ohne Antibiotika verloren hatten, belief sich auf 12–35%. Die Selektion von solchen Zellen wurde durch Überwachen des Verlustes der Antibiotika-Resistenz und die Aneignung einer Empfindlichkeit gegen den Phagen &lgr; klar ausgeführt.

4. Testen von Zellen auf einen Repressor

Die Fähigkeit des Phagen &lgr; mit Amber-Mutationen, Plaques auf Rasen von befreiten Clonen zu bilden, wurde überprüft. Isogene Suppressor-freie Derivate der Eltern-E. coli-Su+-Stämme sind Clone, auf denen der Phage &lgr; bla N' keine Plaques bildete, der Phage &lgr; cI857Qam117Ram54 produzierte 1–3 × 105 PFU/ml, und der Phage &lgr; cI857 ohne Mutationen in den Genen Q und R produzierte 1 × 1010 PFU/ml.

Unter Verwendung dieses Verfahrens erhielten wir Su°-Revertanten von E. coli K 802 Su+. Basierend auf der Zellzahl zum Zeitpunkt der Infektion und der Zahl an Su°-Revertanten unter ihnen war die Häufigkeit des Auftretens von Suppressorfreien Zellen 3 × 10–7.

In einer bevorzugen Ausführungsform wird das Gen von Interesse in pET-24a(+) unter der Kontrolle des T7-Promotors cloniert. Jedes Gen von Interesse kann in der Anwendung der beanspruchten Erfindung verwendet werden. Bestimmte Beispiele schließen das menschliche Wachstumshormon, Interferon, die Methionin-Aminopeptidase, die 134-Aminosäure-Form des menschlichen aFGF, die 140-Aminosäure-Form des menschlichen aFGF, die 146-Aminosäure-Form des menschlichen aFGF und die aFGF 155-Form des menschlichen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. In einer alternativen Ausführungsform kann das Gen von Interesse in sowohl ein bakterielles Plasmid als auch den Phagen unter der Kontrolle von geeigneten Promotoren cloniert werden. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform wird das chemisch synthetisierte haFGF 155-Gen (SEQ ID NO: 1) in pET-24a(+) unter der Kontrolle des T7-Promotors cloniert. Der T7-Promotor wird nur durch die T7-RNA-Polymerase erkannt und wird nicht durch die RNA-Polymerase von E. coli erkannt. Das erhaltene Plasmid mit dem haFGF 155-Gen (phaFGF 155) wurde in E. coli BL21 (DE3) transformiert. Dieser Stamm enthält das T7-RNA-Polymerase-Gen. Das T7-RNA-Polymerase-Gen ist unter der Kontrolle des induzierbaren IacUV5-Pormotors, um die T7-RNA-Polymerase-Synthese nur zu induzieren, wenn es nötig ist, da dieses Protein für die E. coli-Zelle toxisch ist. Die Induktion des lac-Promotors wird durch Zugeben von IPTG zu dem Nährmedium ausgeführt. Um das haFGF 155-Protein zu erhalten, wird der Produzenten-Stamm, der das rekombinante Plasmid mit dem haFGF155-Gen enthält, unter den Bedingungen einer intensiven Belüftung zu einer Zelldichte von 5 × 107–5 × 109 Zellen in 1 ml bei einer Temperatur von 20–40°C kultiviert. Dann wird er durch den Lambda-Phagen mit dem ts-Mutation-cI-Repressor-Gen mit einer Multiplizität von 0,1 bis 100 Phagenkörpern pro Zelle infiziert, und die Inkubation wird bei 20–37°C für 2–14 Stunden fortgesetzt. Gleichzeitig mit dem Phagen wird IPTG in einer Konzentration von 1 mM eingebracht.

Das haFGF155-Gen codiert ein Protein, das 155 Aminosäurereste enthält. Es ist jedoch nur möglich gewesen, zwei kürzere aFGF-Formen aus Gewebeproben zu isolieren. Die zwei isolierten Formen enthalten 140 und 134 Aminosäurereste. Die aFGF-Form, die 140 Aminosäuren enthält, wird als komplett angesehen, während die aFGF-Form, die 134 Aminosäuren enthält, als verkürzt angesehen wird. Es ist nicht möglich gewesen, die aFGF-Form, die 155 Aminosäuren enthält, aus Gewebeproben zu extrahieren. Es ist nicht bekannt, ob die kürzeren Isoformen als eine normale Funktion der Zellprozessierung oder als ein Artefakt, der während des Isolierungsvorgangs durch spezifische Proteasen im Prozess der aFGF-Extraktion produziert wird, auftreten. Die Western Blot-Analyse des Proteins, das von den isolierten rekombinanten DNA-Molekülen für die drei aFGF-Formen produziert wurde, zeigte eine hohe Expression der 140- und 134-Formen und einen niedrigen Expressionsspiegel der 155-Form.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung codiert das Gen für den menschlichen sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktor die 155-Aminosäuren-Form des aFGF-Proteins und wird chemisch synthetisiert (SEQ ID NO: 1). Die Nucleotidsequenz des haFGF 155-Gens ist auf der Basis der früher beschriebenen haFGF 155-Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) abgeleitet worden. Die Aminosäuresequenz des synthetisierten haFGF155-Gens unterscheidet sich nicht von jenen, die früher beschrieben wurden, wie die translatierte Sequenz der FGF-Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 3. Die bevorzugte Nucleotidsequenz des haFGF-Gens unterscheidet sich jedoch von jenen früher beschriebenen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das haFGF 155-Gen chemisch unter Verwendung der Codons, die am häufigsten durch E. coli für intensiv synthetisierte bakterielle Proteine verwendet werden, synthetisiert worden. Codon-Verwendungstabellen für E. coli sind wohlbekannt und verfügbar. Siehe zum Beispiel http://psyche.uthct.edu/shaun/Sblack/codonuse.html. Die chemische Synthese der menschlichen aFGF-Gene wurde durch wohlbekannte Verfahren ausgeführt (Edge et al. (1983) Nucleic Acids Research 11 (18): 6419–6435).

Alternativ kann jedes Gen von Interesse in der Anwendung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt, auf isolierte DNA von Tiergeweben, die andere Formen des haFGF-Proteins codieren, die Fachleuten bekannt sind, einschließlich die 146-, die 140- und die 134-Isoformen und alle Varianten, Derivate, Analoge und Fragmente davon. Hierin sind auch Gene beispielhaft dargestellt, die das menschliche Wachstumshormon, das menschliche Interferon und die E. coli-Methionin-Aminopeptidase codieren.

1 zeigt die vollständige Nucleotidsequenz des haFGF 155-Gens, wie es durch die vorliegenden Erfinder synthetisiert wurde (SEQ ID NO: 1), und auch eine Sequenz für den menschlichen sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktor von GenBank (SEQ ID NO: 3). Diese zwei Sequenzen werden in 2 verglichen. Es gibt Unterschiede in 80 Codons.

Expressions- und Clonierungsvektoren enthalten typischerweise einen Promotor, der durch den Wirtsorganismus erkannt wird und mit dem Gen von Interesse funktionell verknüpft ist. Promotoren sind nicht-translatierte Sequenzen, die stromaufwärts (5') des Startcodons eines Strukturgens (im Allgemeinen innerhalb von 100–1000 Basenpaaren) gelegen sind, die die Transkription und Translation von bestimmten Nucleinsäuresequenzen kontrollieren, mit denen sie funktionell verknüpft sind. Solche Promotoren fallen typischerweise in zwei Klassen, induzierbare und konstitutive. Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die erhöhte Spiegel der Transkription von DNA unter ihrer Kontrolle als Antwort auf eine gewisse Änderung in den Kulturbedingungen, z.B. der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Nährstoffs oder einer Änderung in der Temperatur, iniziieren. Derzeit ist eine große Zahl von Promotoren bekannt, die durch prokaryontische Wirtszellen erkannt werden. Ein Fachmann würde wissen, wie man sie an ein Gen von Interesse unter Verwendung von geeigneten Linkern oder Adaptern ligiert, um geeignete Restriktionsstellen bereitzustellen.

Ein bevorzugtes Promotorsystem ist das E. coli-Bakteriophage-T7-Promotorsystem. Der E. coli-Bakteriophage-T7-Promotor ist sehr spezifisch und benötigt die Anwesenheit der T7-RNA-Polymerase. Die T7-RNA-Polymerase kann durch Transformierung mit einem Plasmid, das das Gen für die T7-RNA-Polymerase exprimiert, bereitgestellt werden oder kann durch Induktion eines T7-Polymerase-Gens, das auf einem Lysogen in einem Wirtsstamm enthalten ist, bereitgestellt werden. Der T7-Promotor und die T7-RNA-Polymerase sind kommerziell erhältlich.

Transformierung bedeutet Einbringen von DNA in einen Organismus, sodass die DNA entweder als ein extrachromosomales Element oder durch Integration in das Chromosom zur Replikation in der Lage ist. Die Transformierung von prokaryontischen Zellen wird unter Verwendung von Techniken durchgeführt, die Fachleuten wohlbekannt sind, wie Behandlung mit CaCl2 oder Elektroporation.

Eine Superproduktion der rekombinanten Proteine wurde durch Kultivieren des Produzenten-Stamms unter Bedingungen erzielt, die die lytische Entwicklung des Lambda-Phagen verlangsamen. Solche Bedingungen schließen erniedrigte Temperatur der Kultivierung und Verwendung einer Amber-Mutation in späten Lambda-Phagen-Genen wie den Q- und R-Genen ein.

Die rekombinanten Proteine werden im Kulturmedium als ein lösliches Protein als ein Ergebnis der Produzenten-Stamm-Zell-Lyse durch den Lambda-Phagen angereichert. Der Ertrag des rekombinanten Proteins konstituiert im Allgemeinen 20% der löslichen Proteine, die im Kulturmedium angereichert sind. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation vom Kulturmedium entfernt. Die rekombinanten Proteine können dann von kontaminierenden löslichen Proteinen und Polypeptiden mit Reinigungsvorgehensweisen gereinigt werden, die Fachleuten wohlbekannt sind. Solche Vorgehensweisen schließen die Fraktionierung auf einer Ionenaustausch-Säule, die Ethanol-Präzipitation, die Umkehrphasen-HPLC, Immunaffinität, SDS-PAGE, Ammoniumsulfat-Präzipitation und Gelfiltration ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Im Fall der haFGF-Proteine wurde das haFGF-Protein auf Heparin-Sepharose aufgetragen, um gereinigten haFGF zu erhalten.

Eine detailliertere Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird nachstehend geliefert. Während die beschriebene Ausführungsform die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, ist es selbstverständlich, dass Modifikationen für Fachleute erfolgen werden, ohne vom Sinn der Erfindung abzuweichen. Der Schutzbereich der Erfindung soll daher nur durch die angehängten Ansprüche festgelegt werden.

BEISPIEL 1 Produktion des menschlichen aFGF 155 durch ein Phagen-abhängiges Verfahren

Kulturen von Escherichia coli BL21(DE3) (NOVAGEN) wurden durch das Plasmid pET24-155@rev (3) transformiert, das eine Kopie des haFGF 155-Gens enthält, das den menschlichen sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktor (155 Aminosäuren) codiert. Kulturen von BL21(DE3) enthalten eine einzelne Kopie des Gens für die T7-RNA-Polymerase unter der Kontrolle des induzierbaren IacUV5-Promotors im bakteriellen Genom (Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113–130). In das Plasmid pET-24a(+) (NOVAGEN) wurde das chemisch synthetisierte haFGF 155-Gen (SEQ ID NO: 1) unter der Kontrolle des T7-Promotors inseriert, um das Plasmid pET24-155 @rev zu produzieren. Die Expression des haFGF 155-Gens beginnt erst nach dem Auftreten der T7-Polymerase in den Zellen, das durch die Induktion des IacUV5-Promotors durch IPTG vermittelt wird.

Kulturen von E. coli BL21(DE3) mit pET24-155 @rev wurden unter Schütteln bei 37°C in LB-Medium, enthaltend 50 g/ml Kanamycin, zu einer Dichte von 2 × 108 Zellen/ml gezüchtet. Dann wurden die Zellen mit dem Phagen cI857 Qam117 Ram54 bei einer Multiplizität von etwa 10 Phagenkörpern pro 1 bakterielle Zelle infiziert und unter Schütteln bei 21 °C für etwa 14 Stunden kultiviert. Gleichzeitig mit dem Phagen wurde 1 mM IPTG in das Medium eingebracht.

Der Phage cI857 Qam117 Ram54 wurde aus lysogenen Kulturen von E. coli RLMI hergestellt, die in LB-Medium bei 30°C mit intensiver Belüftung zu einer Dichte von ungefähr 1 × 108 Zellen/ml gezüchtet wurden. Die lysogene Kultur wurde auf 43°C erwärmt und für 20 Minuten inkubiert, um den cI-Repressor zu inaktivieren. Die Temperatur wurde dann auf 37°C abgesenkt, und nach 60–70 Minuten wurden die bakteriellen Zellen lysiert, wobei die Phagen zu 1–2 × 1010 PFU/ml gebildet wurden.

Nach der Inkubation mit den Phagen-infizierten Zellen für 14 Stunden wurden die Zelltrümmer aus dem Kulturmedium durch Zentrifugation entfernt. Das Kulturmedium, das das haFGF 155-Protein enthielt, wurde auf eine Heparin-Sepharose-Säule aufgetragen, um reinen haFGF 155 zu erhalten.

Das Kulturmedium, das den haFGF 155 enthält, wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen analysiert und mit Coomassie-Blau gefärbt. Ein Elektrophorese-Diagramm des Kulturmediums, das das haFGF 155-Protein enthält, wird mit dem gereinigten haFGF-Protein in 4 verglichen. Spur 1 zeigt 10 l des Kulturmediums. Spur 2 zeigt 7 l des Heparin-Sepharose-gereinigten haFGF 155-Proteins (0,45 g/l). Spur 3 zeigt 14 l von 80 l des HPLC-gereinigten ha FGF-155. Die unmarkierte Spur ganz links enthält Molekulargewichts-Standards (Amersham Pharmacia Biotech). Die Produktion des haFGF 155-Proteins in Phagen-infizierten Kulturen war etwa 20% der zellulären Gesamtproteine. Das Molekulargewicht von haFGF 155 war 17 908 Dalton, bestimmt durch den Densitometer Image Master VDS (Daten nicht gezeigt).

Der menschliche haFGF 155, der durch das vorstehend offenbarte Verfahren produziert wurde, hatte basierend auf dem Hühnermembran-Test (Beispiel 6) biologische Aktivität. Zusätzlich zeigte der gereinigte menschliche aFGF 155 Bioaktivität in einem Zell-basierenden Proliferationstest, der BALB/c-3T3-Fibroblasten verwendet (Linemeyer, U.S.-Patent Nr. 5401832). Die halb-maximale Stimulierung der Zellproliferation erfolgte bei einer Konzentration von 32 pg/ml aFGF155. Ungereinigter menschlicher aFGF155, der im bakteriellen Kulturmedium enthalten ist, zeigte auch biologische Aktivität im 3T3-Fibroblastentest, die äquivalent zu gereinigtem aFGF155 war, was darauf hinweist, dass aFGF155 anfänglich in den Bakterien als ein lösliches, biologisch aktives Protein synthetisiert wurde.

BEISPIEL 2 Produktion der menschlichen aFGF 134-Aminosäuren-Form durch ein Phagenabhängiges Verfahren

Kulturen von Escherichia coli BL21(DE3) (NOVAGEN) wurden durch das Plasmid pET24-134@rev (5) transformiert, das eine Kopie des chemisch synthetisierten Gens, das den menschlichen aFGF (134 Aminosäuren) (6; SEQ ID NO: 4) codiert, enthält. Die translatierte Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 5 gezeigt. Kulturen von BL21(DE3) enthalten eine einzelne Kopie des Gens für die T7-RNA-Polymerase unter der Kontrolle des induzierbaren IacUV5-Promotors im bakteriellen Genom (Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113–130). In das Plasmid pET-24a(+) (NOVAGEN) wurde das Gen der 134 Aminosäuren-Form des menschlichen aFGF unter der Kontrolle des T7-Promotors inseriert. Die Expression des Gens der 134 Aminosäuren-Form des menschlichen aFGF beginnt erst nach dem Auftreten der T7-Polymerase in den Zellen, das durch die Induktion des IacUV5-Promotors durch IPTG vermittelt wird.

Kulturen von E. coli BL21(DE3) mit dem Plasmid pET24-134@rev wurden unter Schütteln bei 37°C in LB-Medium, enthaltend 50 g/ml Kanamycin, zu einer Dichte von 2 × 108 Zellen/ml gezüchtet. Dann wurden die Zellen mit dem Phagen cI857 Qam117 Ram54 bei einer Multiplizität von etwa 10 Phagenkörpern pro 1 bakterielle Zelle infiziert und unter Schütteln bei 21 °C für etwa 14 Stunden kultiviert. Gleichzeitig mit dem Phagen wurde 1 mM IPTG in das Medium eingebracht.

Der Phage cI857 Qam117 Ram54 wurde aus lysogenen Kulturen von E. coli RLMI hergestellt, die in LB-Medium bei 30°C mit intensiver Belüftung zu einer Dichte von ungefähr 1 × 108 Zellen/ml gezüchtet wurden. Die lysogene Kultur wurde auf 43°C erwärmt und für 20 Minuten inkubiert, um den cI-Repressor zu inaktivieren. Die Temperatur wurde dann auf 37°C abgesenkt, und nach 60–70 Minuten wurden die bakteriellen Zellen lysiert, wobei die Phagen zu 1–2 × 1010 PFU/ml gebildet wurden.

Nach der Inkubation mit den Phagen-infizierten Zellen für 14 Stunden wurden die Zelltrümmer aus dem Kulturmedium durch Zentrifugation entfernt. Das Kulturmedium, das das haFGF 134-Protein enthält, wurde auf eine Heparin-Sepharose-Säule aufgetragen, um reines haFGF 134-Protein zu erhalten.

BEISPIEL 3 Produktion der 140-Aminosäuren-Form des menschlichen aFGF durch ein Phagenabhängiges Verfahren

Kulturen von Escherichia coli BL21(DE3) (NOVAGEN) wurden durch das Plasmid pET24-140@rev (7) transformiert, das eine Kopie des chemisch synthetisierten Gens, das den menschlichen aFGF (8; 140 Aminosäuren) (SEQ ID NO: 6) codiert, enthält. Das entsprechende Protein ist als SEQ ID NO: 7 gezeigt. Kulturen von BL21(DE3) enthalten eine einzelne Kopie des Gens für die T7-RNA-Polymerase unter der Kontrolle des induzierbaren IacUV5-Promotors im bakteriellen Genom (Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113–130). In das Plasmid pET-24a(+) (NOVAGEN) wurde das Gen der 140 Aminosäuren-Form des menschlichen aFGF unter der Kontrolle des T7-Promotors inseriert. Die Expression des Gens der 140 Aminosäuren-Form des menschlichen aFGF beginnt erst nach dem Auftreten der T7-Polymerase in den Zellen, das durch die Induktion des IacUV5-Promotors durch IPTG vermittelt wird.

Kulturen von E. coli BL21(DE3) mit pET24-140@rev wurden unter Schütteln bei 37°C in LB-Medium, enthaltend 50 g/ml Kanamycin, zu einer Dichte von 2 × 108 Zellen/ml gezüchtet. Dann wurden die Zellen mit dem Phagen cI857 Qam117 Ram54 bei einer Multiplizität von etwa 10 Phagenkörpern pro 1 bakterielle Zelle infiziert und unter Schütteln bei 21 °C für etwa 14 Stunden kultiviert. Gleichzeitig mit dem Phagen wurde 1 mM IPTG in das Medium eingebracht.

Der Phage cI857 Qam117 Ram54 wurde aus lysogenen Kulturen von E. coli RLMI hergestellt, die in LB-Medium bei 30°C mit intensiver Belüftung zu einer Dichte von ungefähr 1 × 108 Zellen/ml gezüchtet wurden. Die lysogene Kultur wurde auf 43°C erwärmt und für 20 Minuten inkubiert, um den cI-Repressor zu inaktivieren. Die Temperatur wurde dann auf 37°C abgesenkt, und nach 60–70 Minuten wurden die bakteriellen Zellen lysiert, wobei die Phagen zu 1–2 × 1010 PFU/ml gebildet wurden.

Nach der Inkubation mit den Phagen-infizierten Zellen für 14 Stunden wurden die Zelltrümmer aus dem Kulturmedium durch Zentrifugation entfernt. Das Kulturmedium, das die 140 Aminosäuren-Form des haFGF enthält, wurde auf eine Heparin-Sepharose-Säule aufgetragen, um reinen menschlichen aFGF 140 zu erhalten.

Der menschliche aFGF 140, der durch das vorstehend offenbarte Verfahren produziert wurde, hatte basierend auf dem Hühnermembran-Test eine biologische Aktivität (Beispiel 6).

BEISPIEL 4 Produktion der 146 Aminosäuren-Form des menschlichen aFGF durch ein Phagenabhängiges Verfahren

Kulturen von Escherichia coli BL21(DE3) (NOVAGEN) wurden durch das Plasmid pET24-146@rev transformiert, das eine Kopie des chemisch synthetisierten Gens, das den menschlichen aFGF (146 Aminosäuren) codiert (nicht gezeigt), enthält. Kulturen von BL21(DE3) enthalten eine einzelne Kopie des Gens für die T7-RNA-Polymerase unter der Kontrolle des induzierbaren IacUV5-Promotors im bakteriellen Genom (Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113–130). In das Plasmid pET-24a(+) (NOVAGEN) wurde das Gen der 146 Aminosäuren-Form des menschlichen aFGF unter der Kontrolle des T7-Promotors inseriert. Die Expression des Gens der 146 Aminosäuren-Form des menschlichen aFGF beginnt erst nach dem Auftreten der T7-Polymerase in den Zellen, das durch die Induktion des IacUV5-Promotors durch IPTG vermittelt wird.

Kulturen von E. coli BL21(DE3) mit pET24-146@rev wurden unter Schütteln bei 37°C in LB-Medium, enthaltend 50 g/ml Kanamycin, zu einer Dichte von 2 × 108 Zellen/ml gezüchtet. Dann wurden die Zellen mit dem Phagen cI857 Qam117 Ram54 bei einer Multiplizität von etwa 10 Phagenkörpern pro 1 bakterielle Zelle infiziert und unter Schütteln bei 21 °C für etwa 14 Stunden kultiviert. Gleichzeitig mit dem Phagen wurde 1 mM IPTG in das Medium eingebracht.

Der Phage cI857 Qam117 Ram54 wurde aus lysogenen Kulturen von E. coli RLMI hergestellt, die in LB-Medium bei 30°C mit intensiver Belüftung zu einer Dichte von ungefähr 1 × 108 Zellen/ml gezüchtet wurden. Die lysogene Kultur wurde auf 43°C erwärmt und für 20 Minuten inkubiert, um den cI-Repressor zu inaktivieren. Die Temperatur wurde dann auf 37°C abgesenkt, und nach 60–70 Minuten wurden die bakteriellen Zellen lysiert, wobei die Phagen zu 1–2 × 1010 PFU/ml gebildet wurden.

Nach der Inkubation mit den Phagen-infizierten Zellen für 14 Stunden wurden die Zelltrümmer aus dem Kulturmedium durch Zentrifugation entfernt. Das Kulturmedium, das das haFGF 146-Protein enthält, wurde auf eine Heparin-Sepharose-Säule aufgetragen, um reinen haFGF 146 zu erhalten.

Der menschliche aFGF 146, der durch das oben offenbarte Verfahren produziert wurde, hatte basierend auf dem Hühnermembran-Test eine biologische Aktivität (Beispiel 6).

BEISPIEL 5 Reinigung der rekombinanten haFGF-Proteine

Das Kulturmedium, das ein haFGF-Protein enthält, wird mit einem Volumen von 0,04 M KH2PO4-Puffer, pH 7,0, verdünnt und auf eine Heparin-Sepharose-Säule aufgetragen, die mit 0,02 M KH2PO4, pH 7,0, äquilibriert wurde. Die Durchflussrate wird auf 80 ml/Stunde eingestellt. Nach dem Aufbringen des Kulturmediums, das das haFGF-Protein enthielt, wird die Säule mit 0,02 M KH2PO4-Puffer, pH 7,0, gewaschen. Als Nächstes wird die Säule mit 0,02 M KH2PO4-Puffer, enthaltend 0,6 M NaCl, pH 7,3, gewaschen. Die Elution wird unter Verwendung von 0,02 M KH2PO4-Puffer mit 1,5 M NaCl, pH 7,5, ausgeführt. Alle Schritte werden bei 4°C ausgeführt.

BEISPIEL 6 Ein Verfahren zum Untersuchen des FGF-Einflusses auf die Bildung von neuen Blutgefäßen in der Hühnerembryo-Chorioallantoismembran (CAM).

Das Verfahren zum Untersuchen der Angiogenese am Modell von Hühnerembryonen (Thomas et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 6409-6413) wurde adaptiert, um die Wirkungen der rekombinanten haFGF 155-, 146- und 140-Proteine auf die Angiogenese im Vergleich zum reinen Gehirn-abstammenden sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktor zu bestimmen. Der reine Gehirnabstammende saure Fibroblasten-Wachstumsfaktor ist ein starkes angiogenetisches, vaskuläres, endotheliales Zellmitogen mit einer Sequenzhomologie zu Interleukin.

Die Schalen von drei Tage alten Hühnerembryonen wurden mit Ethylalkohol sterilisiert. Die Schale und die Hülle unter der Schale wurden von der Luftkammer unter Verwendung einer Pinzette entfernt, und die Eier wurden durch den Boden einer 35 mm Plastik-Petrischale bedeckt. Die Embryonen wurden bei 37°C für 5–6 Tage inkubiert. Am Ende dieser Periode wurden die Embryonen untersucht, und die Eier mit gut entwickelten Blutgefäßen der CAM wurden für die Experimente ausgewählt.

Filterpapierscheiben mit aufgebrachtem Gel, enthaltend FGF, wurden auf die CAM der Eier mit dem Gel in Richtung der Blutgefäße gelegt und in einem Brutschrank bei 37°C für weitere 3 Tage inkubiert. Das Gel wurde auf die folgende Weise hergestellt: die getestete Menge von FGF wurde in 30 l Eagle-Medium (Lösung 1) gelöst; dann wurden 10 g Heparin in 30 l Eagle-Medium gelöst, und 2% Agarose wurde zugefügt (Lösung 2). Dann wurden gleiche Volumina von Lösung 1 und 2 gemischt, und das erhaltene Gemisch wurde in Aliquots von 60 l auf Filterpapierscheiben mit 12 mm Durchmesser aufgebracht.

Am 4. Tag wurden die Filterpapierscheiben entfernt. Angereicherte Kuhmilch (10% Milchfett) wurde unter die CAM in einer Menge von etwa 1 ml oder weniger injiziert. Das Ergebnis war ein weißer Hintergrund, gegen den die CAM-Gefäße leicht beobachtet wurden.

Die Ergebnisse des Experiments wurden mit einer Videokamera in Verbindung mit einem Computer aufgezeichnet. Die Bildung eines neuen CAM-Gefäßes unter dem Einfluss von FGF wurde durch die folgenden Parameter bewertet: das Wesen und die Richtung des Gefäßwachstums, ihre Menge und Qualität (groß, mittel, klein), die Anwesenheit oder Abwesenheit von Anastomosen, usw. Diese Daten wurden mit den Kontrollproben verglichen, die keinem FGF ausgesetzt worden waren. Hühnerembryo-Blutgefäße am 14. Tag der Entwicklung wurden mit FGF155 behandelt, der durch das hierin beschriebene rekombinante Phagen-abhängige Verfahren produziert und auf Heparin-Sepharose, wie beschrieben, gereinigt wurde.

Die Anwendung des rekombinanten FGF155-Proteins zeigte die Bildung von neuen Blutgefäßen. Am vierten Tag nach der Anwendung von 1 g FGF155 waren die Gefäße vorwiegend klein und zeigten ein strahlenförmiges Wachstum. Das Erhöhen der Menge von FGF155 auf 3 g zeigte einen entsprechenden Anstieg in der Größe der Blutgefäße. Mittlere Gefäße mit strahlenförmigem Wachstum wurden beobachtet. Eine weitere Erhöhung auf 4 g angewendeten FGF155 zeigte die Entwicklung von großen, mittleren und kleinen Blutgefäßen 4 Tage nach der Anwendung im Vergleich zu der Kontrolle.

BEISPIEL 7 Produktion von menschlichem Wachstumshormon durch ein Phagen-abhängiges Verfahren

Kulturen von Escherichia coli BL21(DE3) (NOVAGEN) wurden mit einem Plasmid transformiert, das eine Kopie eines chemisch synthetisierten Gens, das das menschliche Wachstumshormon (SEQ ID NO: 8) codiert, enthält. Die translatierte Aminosäuresequenz ist als SEQ ID NO: 9 gezeigt. Kulturen von BL21(DE3) enthalten eine einzelne Kopie des Gens für die T7-RNA-Polymerase unter der Kontrolle des induzierbaren IacUV5-Promotors im bakteriellen Genom (Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113–130). In das Plasmid pET-24a(+) (NOVAGEN) wurde das menschliche Wachstumshormon-Gen unter der Kontrolle des T7-Promotors inseriert. Die Expression des menschlichen Wachstumshormon-Gens beginnt erst nach dem Auftreten der T7-Polymerase in den Zellen, das durch die Induktion des IacUV5-Promotors durch IPTG vermittelt wird.

Die transformierten Kulturen von E. coli BL21(DE3) wurden unter Schütteln bei 37°C in LB-Medium, enthaltend 50 g/ml Kanamycin, zu einer Dichte von 2 × 108 Zellen/ml gezüchtet. Dann wurden die Zellen mit dem Phagen cI857 Qam117 Ram54 bei einer Multiplizität von etwa 10 Phagenkörpern pro 1 bakterielle Zelle infiziert und unter Schütteln bei 21 °C für etwa 14 Stunden kultiviert. Gleichzeitig mit dem Phagen wurde 1 mM IPTG in das Medium eingebracht.

Der Phage cI857 Qam117 Ram54 wurde aus lysogenen Kulturen von E. coli RLMI hergestellt, die in LB-Medium bei 30°C mit intensiver Belüftung zu einer Dichte von ungefähr 1 × 108 Zellen/ml gezüchtet wurden. Die lysogene Kultur wurde auf 43°C erwärmt und für 20 Minuten inkubiert, um den cI-Repressor zu inaktivieren. Die Temperatur wurde dann auf 37°C abgesenkt, und nach 60–70 Minuten wurden die bakteriellen Zellen lysiert, wobei die Phagen zu 1–2 × 1010 PFU/ml gebildet wurden.

Nach der Inkubation mit den Phagen-infizierten Zellen für 14 Stunden wurden die Zelltrümmer aus dem Kulturmedium durch Zentrifugation entfernt. Das menschliche Wachstumshormon-Protein wurde durch Säulenchromatographie durch Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, gereinigt, um reines menschliches Wachstumshormon zu erhalten. Das gereinigte menschliche Wachstumshormon war biologisch aktiv, wenn es in einem Zell-basierenden Biotest, der Nb2-Lymphomzellen verwendet (Gout PW, Cancer Research 40: 2433–2436, 1980), getestet wurde. Die Konzentration des menschlichen Wachstumshormons, die eine halb-maximale Stimulierung der Nb2-Zellproliferation ergab, war 125 pg/ml.

BEISPIEL 8 Produktion von menschlichem Interferon-2b durch ein Phagen-abhängiges Verfahren

Kulturen von Escherichia coli BL21(DE3) (NOVAGEN) wurden durch das Plasmid pET24ap-inf@rev (9) transformiert, das eine Kopie eines chemisch synthetisierten Gens, das das menschliche Interferon-2 (10; SEQ ID NO: 10) codiert, enthält. Die translatierte Aminosäuresequenz ist als SEQ ID NO: 11 gezeigt. Kulturen von BL21(DE3) enthalten eine einzelne Kopie des Gens für die T7-RNA-Polymerase unter der Kontrolle des induzierbaren IacUV5-Promotors im bakteriellen Genom (Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113–130). In das Plasmid pET-24a(+) (NOVAGEN) wurde das Interferon-Gen unter der Kontrolle des T7-Promotors inseriert. Die Expression des Interferon-Gens beginnt erst nach dem Auftreten der T7-Polymerase in den Zellen, das durch die Induktion des IacUV5-Promotors durch IPTG vermittelt wird.

Kulturen von E. coli BL21(DE3) mit dem Plasmid pET24ap-inf@rev wurden unter Schütteln bei 37°C in LB-Medium, enthaltend 50 g/ml Kanamycin, zu einer Dichte von 2 × 108 Zellen/ml gezüchtet. Dann wurden die Zellen mit dem Phagen cI857 Qam117 Ram54 bei einer Multiplizität von etwa 10 Phagenkörpern pro 1 bakterielle Zelle infiziert und unter Schütteln bei 21 °C für etwa 14 Stunden kultiviert. Gleichzeitig mit dem Phagen wurde 1 mM IPTG in das Medium eingebracht.

Der Phage cI857 Qam117 Ram54 wurde aus lysogenen Kulturen von E. coli RLMI hergestellt, die in LB-Medium bei 30°C mit intensiver Belüftung zu einer Dichte von ungefähr 1 × 108 Zellen/ml gezüchtet wurden. Die lysogene Kultur wurde auf 43°C erwärmt und für 20 Minuten inkubiert, um den CI-Repressor zu inaktivieren. Die Temperatur wurde dann auf 37°C abgesenkt, und nach 60–70 Minuten wurden die bakteriellen Zellen lysiert, wobei die Phagen zu 1–2 × 1010 PFU/ml gebildet wurden.

Nach der Inkubation mit den Phagen-infizierten Zellen für 14 Stunden wurden die Zelltrümmer aus dem Kulturmedium durch Zentrifugation entfernt. Interferon wurde durch Säulenchromatographie durch Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, gereinigt, um reines Interferon zu erhalten.

Interferon, das durch das offenbarte Verfahren produziert wurde, hatte basierend auf dem antiviralen Interferon-Test, der in mit vesikulärem Stomatitis-Virus infizierten bovinen Nierenzellen durchgeführt wurde (Aebersold, P, Methods in Enzymology 119: 579–592, 1986), eine biologische Aktivität. Interferon alpha-2b hatte in diesem Test eine biologische Potenz von 1,81 × 108 Internationalen Einheiten (IE) pro mg Protein. Interferon alpha-2b, das vor der Reinigung im bakteriellen Kulturmedium enthalten war, hatte in diesem antiviralen Test eine äquivalente Potenz wie das gereinigte Interferon, ein Hinweis, dass Interferon alpha-2b in den Bakterien anfänglich als ein lösliches, biologisch aktives Protein synthetisiert wird.

BEISPIEL 9 Produktion der E. coli-Methionin-Aminopeptidase durch ein Phagen-abhängiges Verfahren

Kulturen von Escherichia coli BL21(DE3) (NOVAGEN) wurden durch ein Plasmid transformiert, das eine Kopie eines chemisch synthetisierten Gens enthielt, das die E. coli-Methionin-Aminopeptidase codiert. Kulturen von BL21(DE3) enthalten eine einzelne Kopie des Gens für die T7-RNA-Polymerase unter der Kontrolle des induzierbaren IacUV5-Promotors im bakteriellen Genom (Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113–130). In das Plasmid pET-24a(+) (NOVAGEN) wurde das E. coli-Methionin-Aminopeptidase-Gen unter der Kontrolle des T7-Promotors inseriert. Die Expression des E. coli-Methionin-Aminopeptidase-Gens beginnt erst nach dem Auftreten der T7-Polymerase in den Zellen, das durch die Induktion des IacUV5-Promotors durch IPTG vermittelt wird.

Die transformierten Kulturen von E. coli BL21(DE3) wurden unter Schütteln bei 37°C in LB-Medium, enthaltend 50 g/ml Kanamycin, zu einer Dichte von 2 × 108 Zellen/ml gezüchtet. Dann wurden die Zellen mit dem Phagen cI857 Qam117 Ram54 bei einer Multiplizität von etwa 10 Phagenkörpern pro 1 bakterielle Zelle infiziert und unter Schütteln bei 21 °C für etwa 14 Stunden kultiviert. Gleichzeitig mit dem Phagen wurde 1 mM IPTG in das Medium eingebracht.

Der Phage cI857 Qam117 Ram54 wurde aus lysogenen Kulturen von E. coli RLMI hergestellt, die in LB-Medium bei 30°C mit intensiver Belüftung zu einer Dichte von ungefähr 1 × 108 Zellen/ml gezüchtet wurden. Die lysogene Kultur wurde auf 43°C erwärmt und für 20 Minuten inkubiert, um den CI-Repressor zu inaktivieren. Die Temperatur wurde dann auf 37°C abgesenkt, und nach 60–70 Minuten wurden die bakteriellen Zellen lysiert, wobei die Phagen zu 1–2 × 1010 PFU/ml gebildet wurden.

Nach der Inkubation mit den Phagen-infizierten Zellen für 14 Stunden wurden die Zelltrümmer aus dem Kulturmedium durch Zentrifugation entfernt. E. coli-Methionin-Aminopeptidase wurde durch Säulenchromatographie durch Verfahren gereinigt, die Fachleuten bekannt sind, um reine E. coli-Methionin-Aminopeptidase zu erhalten.

BEISPIEL 10 Gel-Analyse der rekombinanten Proteine, die durch das Phagen-abhänpige Verfahren produziert wurden.

Kulturmedien, die die 134-Aminosäuren-Form des menschlichen aFGF, die 140 Aminosäuren-Form des menschlichen aFGF, die 155 Aminosäuren-Form des menschlichen aFGF, das menschliche Wachstumshormon, Interferon und die Methionin-Aminopeptidase enthalten, wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen analysiert und mit Coomassie-Blau gefärbt. Ein Elektrophorese-Diagramm der Kulturmedien, die die 134-Aminosäuren-Form des menschlichen aFGF, die 140 Aminosäuren-Form des menschlichen aFGF, die 146 Aminosäuren-Form des menschlichen aFGF, das menschliche Wachstumshormon und Interferon-Proteine enthalten, wird mit den Molekulargewichts-Standards in 11 verglichen. Spur 2 zeigt 30 l des Kulturmediums, enthaltend die 134-Aminosäuren-Form des menschlichen aFGF.

Spur 3 zeigt 30 l Kulturmedien, enthaltend das rekombinante FGF 140-Protein. Spur 4 zeigt 30 l Kulturmedien, enthaltend rekombinantes Interferon. Spur 5 zeigt 30 l Kulturmedien, enthaltend das rekombinante FGF 155-Protein. Spur 6 zeigt 30 l Kulturmedien, enthaltend das rekombinante menschliche Wachstumshormon. Spur 7 zeigt 30 l Kulturmedien, enthaltend die rekombinante Methionin-Aminopeptidase. Spur 1 zeigt 2 g von jedem Molekulargewichts-Standard (Amersham Pharmacia Biotech). Von oben sind die Molekulargewichts-Standards: 94000; 67000; 43000; 30000; 20100; und 14400.

Die Quantifizierung der Mengen der 134-Aminosäuren-Form des menschlichen aFGF, der 140 Aminosäuren-Form des menschlichen aFGF, der 155 Aminosäuren-Form des menschlichen aFGF, des menschlichen Wachstumshormons, des Interferons und der Methionin-Aminopeptidase in einem Gemisch wurde durch Scannen der gefärbten Proteinbanden auf einem Polyacrylamid-Gel mit dem Densitometer Image Master VDS (Pharmacia Biotech) erreicht. Die Produktion der rekombinanten Proteine in Phagen-infizierten Kulturen war etwa 20% der zellulären Gesamtproteine.

Ein Elektrophorese-Diagramm, das das gereinigte rekombinante menschliche aFGF 134-, haFGF 140-, haFGF 146-, Interferon-, haFGF 155- und das Methionin-Aminopeptidase-Protein enthält, wurde mit Molekulargewichts-Standards verglichen (12). Spur 2 zeigt 5 g des gereinigten aFGF 134-Proteins. Spur 3 zeigt 5 g des gereinigten menschlichen aFGF 140. Spur 4 zeigt 5 g der 146 Aminosäuren-Form des gereinigten menschlichen aFGF. Die Produktion der 146 Aminosäuren-Form des menschlichen aFGF in Phagen-infizierten Kulturen war etwa 20% des zellulären Gesamtproteins. Spur 5 zeigt 5 g gereinigtes Interferon. Spur 6 zeigt 5 g des haFGF 155-Proteins. Spur 7 zeigt 5 g der gereinigten E. coli-Methionin-Aminopeptidase. Die Spuren 1 und 8 zeigen 2 g von jedem Molekulargewichts-Standard (Amersham Pharmacia Biotech).

SEQUENZPROTOKOLL ALS TEIL DER BESCHREIBUNG


Anspruch[de]
Verfahren zum Herstellen eines biologisch aktiven Proteins, umfassend:

a) das Züchten eines E. coli-Stammes, der in der Lage ist, das Gen für T7-RNA-Polymerase zu exprimieren, durch Hinzufügen eines induzierenden Agens,

b) das Transformieren des in Schritt a) erhaltenen Stammes mit einem Plasmid, das zumindest eine Kopie eines exprimierbaren Gens hat, das ein biologisch aktives Protein codiert und mit einem T7-Polymerasepromotor funktionell verbunden ist;

c) das Infizieren des Stammes, der in Schritt b) erhalten wurde, mit einem Bakteriophagen, der eine verspätete Lyse vermittelt, der eine Temperatur-empfindliche cI857-Mutation und eine Mutation in zumindest einem Gen ausgewählt aus N, Q und R hat, und das Inkubieren des infizierten Stammes von E. coli-Zellen in einem Kulturmedium, das das induzierende Agens enthält, um das Gen für T7-Polymerase zu exprimieren, und,

d) das Züchten des in Schritt c) erhaltenen Stammes unter einer Kulturbedingung, die lytisches Wachstum der Zelle induziert, wobei bis zum Erreichen eines gewünschten Niveaus der Herstellung des Proteins keine Lyse stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Bakteriophage cI857Qam117Ram54 ist. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der in Schritt c) eingebrachte Bakteriophage mit folgenden Schritten hergestellt wird:

a) Züchten eines ersten Stammes von E. coli-Zellen, die den Bakteriophagen beherbergen,

b) Einstellen der Temperatur, um Lyse des in Schritt a) erhaltenen Stammes und Freisetzung des Bakteriophagen zu erreichen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Protein als lösliches biologisch aktives Protein in einer Konzentration von über 100 Mikrogramm/ml hergestellt wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der E. coli-Stamm einen Suppressor für die Reparatur von Amber-Mutationen herstellt. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei in dem E. coli-Stamm ein Suppressor für die Reparatur von Amber-Mutationen fehlt. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der infizierende Bakteriophage in einer Multiplizität der Infektion bereit gestellt wird, die in einem Bereich von etwa 1 bis etwa 100 liegt. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der infizierende Bakteriophage in einer Multiplizität der Infektion bereit gestellt wird, die in einem Bereich von etwa 10 bis etwa 25 liegt. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Bakteriophagen-vermittelte verspätete Lyse des E. coli-Stammes bei höheren Multiziplitäten der Infektion verspätet ist im Vergleich zu niedrigeren Multiziplitäten der Infektion. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das exprimierbare Gen einen menschlichen sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktor codiert. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der menschliche saure Fibroblasten-Wachstumsfaktor 134 Aminosäuren enthält. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der menschliche saure Fibroblasten-Wachstumsfaktor 140 Aminosäuren enthält. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der menschliche saure Fibroblasten-Wachstumsfaktor 146 Aminosäuren enthält. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der menschliche saure Fibroblasten-Wachstumsfaktor 155 Aminosäuren enthält. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der menschliche saure Fibroblasten-Wachstumsfaktor eine Sequenz wie in SEQ ID NO:1 dargestellt hat. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das exprimierbare Gen ein menschliches Wachstumshormon codiert. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das exprimierbare Gen ein menschliches Interferon codiert. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das exprimierbare Gen eine E. coli-Methionin-Aminopeptidase codiert. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei der induzierbare Promotor ein IacUV5-Promotor ist.






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