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Dokumentenidentifikation DE602004006153T2 27.12.2007
EP-Veröffentlichungsnummer 0001685146
Titel KRISTALLINE VERBINDUNG VON 4'-DEMETHYL-4'-PHOSPHAT-2'',3''-BISPENTAFLUORPHENOXYiACETYL-4'',6''-ETHYLIDEN-ß-D-EPIPODOiPHYLLOTOXINiGLUKOSID ENTWEDER IN DER FREIEN FORM ODER SOLVATISIERT MIT ETHANOL
Anmelder Pierre Fabre Médicament, Boulogne, FR
Erfinder GUMINSKI, Yves, F-81090 Lagarrigue, FR;
IMBERT, Thierry, F-81290 Viviers-les-Montagnes, FR;
KRUCZYNSKI, Anna, 31450 Pompertuzat, FR
Vertreter Samson & Partner, Patentanwälte, 80538 München
DE-Aktenzeichen 602004006153
Vertragsstaaten AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HU, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PL, PT, RO, SE, SI, SK, TR
Sprache des Dokument FR
EP-Anmeldetag 16.09.2004
EP-Aktenzeichen 047873898
WO-Anmeldetag 16.09.2004
PCT-Aktenzeichen PCT/FR2004/002349
WO-Veröffentlichungsnummer 2005028492
WO-Veröffentlichungsdatum 31.03.2005
EP-Offenlegungsdatum 02.08.2006
EP date of grant 25.04.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 27.12.2007
IPC-Hauptklasse C07H 17/08(2006.01)A, F, I, 20060704, B, H, EP

Beschreibung[de]

Das 4'-Demethyl-4'-Phosphat-2'',3''-bispentafluorphenoxyacetyl-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosid von Epipodophyllotoxin in Form des Doppelsalzes von N-Methyl-D-glucamin gemäß Formel 1 ist hinsichtlich seiner Struktur, seiner Herstellung und seiner Antikrebswirkung bekannt (WO 96/12727). Ein weiteres Herstellungsverfahren für diese Verbindung ist auch in dem Patent FR 2 791 682 beschrieben.

Formel 1

Diese Verbindung der Formel 1 besitzt eine besonders bedeutende Antikrebswirkung. Ihre antitumorale Wirkung ist in vivo nachgewiesen worden. Insbesondere ermöglicht sie ein längeres Überleben der Maus, welcher das Leukämiemodell P388 (British Journal of Cancer (2000), 83(11), 1516-1524) implantiert worden ist. Darüber hinaus ist bei dieser Verbindung das Vermögen zur Inhibierung der in-vitro-Aktivität der Topoisomerasen 1 und 2 gezeigt worden (Biochem. Pharmacol. (2000), 59, 807).

Diese Verbindung 1 ist unter den üblichen Bedingungen von neutralem und saurem pH und der Temperatur stabil. Wenn man sie aber über eine lange Zeit aufbewahren möchte, ist es erforderlich, sie abgeschirmt von Feuchtigkeit in einem hermetisch verschlossenen Fläschchen und bei –20°C aufzubewahren. Wenn sie im Gegensatz dazu bei 4°C und erst recht bei Umgebungstemperatur aufbewahrt wird, zersetzt sich diese Verbindung im Verlaufe der Zeit. Sie kann demgemäß nicht zufriedenstellend gehandhabt werden, um in einem Antikrebs-Behandlungsprotokoll in Krankenhausumgebung nützlich zu sein. Sie muss deshalb im Augenblick der Verwendung hergestellt werden, was ein ernstes Problem ist.

Die chemische Vorstufe dieser Verbindung ist das freie Phosphat-Derivat der Formel 2: 4'-Demethyl-4'-Phosphat-2'',3''-bispentafluorphenoxyacetyl-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosid von Epipodophyllotoxin.

Formel 2

Diese Verbindung wird nicht isoliert und wird direkt in amorpher Form bei der Herstellung ihres N-Methyl-D-glucamin-Salzes der Formel 1 verwendet (WO 96/12727). Dieses freie Phosphat-Derivat der Formel 2 liegt, wenn es isoliert wird, in amorpher hygroskopischer und wenig stabiler Form vor. Es ist also nötig, das N-Methyl-D-glucamin-Salz unter wasserfreien Bedingungen rasch zu bilden und es in der Kälte aufzubewahren oder es rasch zu verwenden. Dieses Derivat der Formel 2 in amorpher Form kann demgemäß als solches nicht unter guten Bedingungen im industriellen Maßstab gelagert und gehandhabt werden. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass die Verbindung der Formel 2 in amorpher Form nicht die bedeutenden biologischen Eigenschaften der Verbindung der Formel 1 besitzt. Demgemäß bleibt ein Problem zu lösen, nämlich jenes, die Verbindung der Formel 2 in kristalliner Form zu erhalten.

Es ist allgemein bekannt, dass die Kristallisation einer amorphen Verbindung sehr große Schwierigkeiten bereiten kann und der Erhalt der ersten Kristalle immer problematisch ist.

Später wird die Kristallisation durch Impfung leichter erzielt.

Ein Solvat mit zwei Molekülen Ethanol ist im Patent EP 537 555 für die Verbindung Etopofos beschrieben worden, die das Prodrug von Etoposid ist. Es war folgerichtig zu hoffen, eine Kristallisation der Verbindung der Formel 2 zu erhalten, indem man auf ähnliche Weise wie bei dem in diesem Patent beschriebenen Verfahren vorgeht.

Das Verfahren zum Erhalt des Solvats, nämlich des Diethanolats, das in diesem Patent empfohlen wird (Behandlung mit Alkohol mit einem Cosolvens oder Wasser) ist in unserem Fall nicht erfolgreich.

Es gibt einen sehr bedeutenden Löslichkeitsunterschied zwischen Etopofos und der Verbindung der Formel 2.

Etopofos ist in Wasser löslich (100 mg/ml), während die amorphe Verbindung der Formel 2 dies nicht ist. Die Letztgenannte ist in Ethanol löslich und die Zugabe von Wasser, die für den Erhalt des Solvats von Etopofos empfohlen wird, ergibt in unserem Fall einen nicht kristallisierbaren Gummi.

Es sind im Labor zahlreiche Tests vorgenommen worden, um die Verbindung der Formel 2 zu kristallisieren. Alkohole wie Methanol, Ethanol, Isopropylalkohol, Butanol sind ohne Erfolg verwendet worden, ebenso wie andere Lösungsmittelarten, wie Ethylacetat, Aceton, Methylethylketon, Dioxan. Lediglich die Verwendung von Ethern, wie Diethylether oder Diisopropylether, oder von Alkanen, wie Pentan, Heptan oder Petrolether, lieferte ein festes pulverförmiges Produkt, aber in amorpher Form.

Es ist also überraschend gefunden worden, dass das freie Phosphat der Formel 2 die Eigenschaft besitzt, unter speziellen Bedingungen ein Solvat mit 1/2 Ethan-Molekül zu bilden, was zu seinem kristallisierten und stabilen Hemiethanol-Derivat der Formel 3 führt, wobei dieses Derivat nach dem Trocknen das Derivat der Formel 2 in kristalliner Form ergibt. Darüber hinaus ist es durch Impfen ausgehend von der kristallinen Verbindung der Formel 2 oder 3 möglich gewesen, andere kristalline Solvate mit Ethanol, wie das Hemiethanolat-Solvat von 4'-Demethyl-4'-phosphat-2'',3''-bispentafluorphenoxyacetyl-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosid von Epipodophyllotoxin, zu erhalten.

Die vorliegende Erfindung betrifft deshalb die kristalline Verbindung des 4'-Demethyl-4'-phosphat-2'',3''-bispentafluorphenoxyacetyl-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosids von Epipodophyllotoxin in freier Form der folgenden Formel 2:

oder in Form des Solvats mit Ethanol. Vorteilhaft ist das Solvat mit Ethanol ein Hemiethanolat-Solvat der folgenden Formel 3:

Vorteilhaft entspricht das Röntgendiagramm der kristallinen Verbindung in freier Form der Formel 2 ungefähr jenem der 2 und entspricht jenes der kristallinen Verbindung in Form des Hemiethanol-Solvats der Formel 3 ungefähr jenem der 3. Vorteilhaft entspricht das Röntgendiagramm einer kristallinen Verbindung des 4'-Demethyl-4'-phosphat-2'',3''-bispentafluorphenoxyacetyl-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosids von Epipodophyllotoxin in Form eines vom Hemiethanol-Solvat verschiedenen Solvats mit Ethanol der Formel 3 ungefähr jenem der 4.

Andere Ziele und Vorteile der Erfindung werden dem Fachmann aus der nachstehenden detaillierten Beschreibung und durch Bezugnahme auf die folgenden veranschaulichenden Zeichnungen offenkundig.

1 stellt das Röntgendiagramm der Verbindung der Formel 2 in amorpher Form dar.

Die 2 und 6 stellen das Röntgendiagramm der Verbindung der Formel 2 in kristalliner Form dar.

3 stellt das Röntgendiagramm der Verbindung der Formel 3 in kristalliner Form dar.

Die 4 und 5 stellen das Röntgendiagramm der kristallinen Verbindung des 4'-Demethyl-4'-phosphat-2'',3''-bispentafluorphenoxyacetyl-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosids von Epipodophyllotoxin in Form des vom Hemiethanol-Solvat der Formel 3 verschiedenen Solvats mit Ethanol dar.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der kristallinen Verbindung in Form des Hemiethanolat-Solvats der Formel 3, welches den Schritt des Lösens der Verbindung der Formel 2 in amorpher Form in wasserfreiem Ethanol in Anwesenheit von Ultraschall umfasst.

Vorteilhaft wird der Ultraschall über mindestens 20 Minuten angewendet.

Sie betrifft darüber hinaus das Verfahren zur Herstellung der kristallinen Verbindung in freier Form der Formel 2, welches den Schritt des Trocknens der kristallinen Verbindung in Form des Hemiethanolat-Solvats der Formel 3, vorteilhaft unter Vakuum, umfasst.

In der Tat begünstigt die Behandlung des freien Phosphats der Formel 2, gelöst in wasserfreiem Ethanol und in Anwesenheit von Ultraschall, vorteilhaft über 20 min, das Auftreten der kristallinen Form. Es bildet sich ein Solvat mit 1/2 Ethanol-Kristallisationsmolekül. Dieses Phänomen tritt nicht allgemein auf, da Vergleichsversuche mit Methanol vorgenommen wurden. Dort ist keinerlei Kristallisation aufgetreten. Auf gleiche Weise sind äquivalente Bedingungen auf verschiedene Verbindungen der Familie des Produkts der Formel 2, zum Beispiel auf Produkte, die eine Phenoxyacetat-, 4-Trifluormethoxyphenoxyacetat-, 4-Methylphenoxyacetat-Kette anstelle der Pentafluorphenoxyacetat-Kette besitzen, Verbindungen, die in der Patentanmeldung WO 96/12727 erwähnt sind, angewendet wurden. Es kam keinerlei Kristallisation bei diesen ähnlichen Strukturen zustande. Nur die Verbindung der Formel 2, welche die Pentafluorphenoxyacetat-Kette besitzt, weist die Besonderheit auf, durch die oben erwähnte Behandlung Kristalle zu bilden.

Nach mehreren Umkristallisationen ergab diese Verbindung immer dieselbe Stöchiometrie von Ethanol, das heißt 1/2 Mol Lösungsmittel pro Mol Verbindung, selbst nach Trocknen unter Vakuum bei Umgebungstemperatur. Man erhält in diesem Stadium ein Solvat, nämlich das Hemiethanolat der Formel 3.

Darüber hinaus ergab sich, dass ein schärferes Trocknen im Vakuum bei 40°C über 10 Tage es schließt ermöglicht, das Ethanol auf schwierige Weise, aber vollständig zu eliminieren. Es ist so erforderlich, durch eine kristallisierte Form in Form des Solvats zu treten, bevor man eine kristallisierte Form ohne Lösungsmittel erhält. Diese Verbindung kann nicht direkt erhalten werden.

Natürlich besteht die Hauptschwierigkeit der Kristallisation darin, den ersten Kristall zu erhalten; durch Impfen mit den bereits gebildeten Kristallen können andere Kristallisationstechniken verwendet werden und zu einer Kristallisation von zukünftigen Fraktionen führen. Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung weiter ein Verfahren zur Herstellung der kristallinen Verbindung des 4'-Demethyl-4'-phosphat-2'',3''-bispentafluorphenoxyacetyl-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosids von Epipodophyllotoxin in Form des Solvats mit Ethanol, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte umfasst:

  • a) Zugabe von Ethanol zu Verbindung 2 in amorpher Form,
  • b) Konzentrieren der Lösung,
  • c) Kristallisation des 4'-Demethyl-4'-phosphat-2'',3''-bispentafluorphenoxyacetyl-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosids von Epipodophyllotoxin in Form des Solvats mit Ethanol durch Kühlen der konzentrierten Lösung auf 10°C für 1,5 h und Zugabe eines Impfkristalls, der aus einem Kristall der Verbindung der Formel 2 in freier Form oder der Verbindung der Formel 3 in Form des Hemiethanolat-Solvats besteht,
  • d) Filtrieren bei 10°C und Waschen mit Ethanol,
  • e) Trocknen des erhaltenen Produkts.

Der Schritt (a) des Konzentrierens der Lösung wird vorteilhaft unter Verdampfen von etwa 50 % der Lösung durchgeführt.

Vorteilhaft wird, wenn das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene kristallisierte Produkt nicht angemessen ist, eine zweite Umkristallisation mittels erneuten Lösens in Aceton, Vorkonzentrierens der Lösung durchgeführt, vorteilhaft indem man 75 % der Lösung verdampft, dann die Schritte (1) bis (e) erneut durchführt.

Vorteilhaft wird der Schritt (e) der Trocknung des Produkts in einem Ofen unter Vakuum bei 40°C durchgeführt.

Es zeigte sich darüber hinaus, dass eine verschärfte Trocknung unter Vakuum (vorteilhaft bei 40°C über 10 Tage) es ermöglicht, auf schwierige Weise, aber vollständig das Ethanol zu eliminieren. Man erhält so eine kristalline Form ohne Lösungsmittel, das heißt die kristalline Verbindung der Formel 2 in freier Form.

Die vorliegende Anmeldung betrifft auch ein Medikament, das eine kristalline Verbindung gemäß der vorliegenden Anmeldung (vorteilhaft der Formel 2 oder 3) umfasst.

Vorteilhaft ist dieses Medikament zur Antikrebsbehandlung, vorteilhaft von Flüssigkeitstumoren oder festen Tumoren, bestimmt, insbesondere von kleinzelligem Lungenkrebs, Embryonaltumoren, Neuroblastomen, Nierenkrebs, pädiatrischen Tumoren, Hodgkin- und non-Hodgkin-Lymphomen, akuten Leukämien, Plazenta-Choriokarzinomen, Mamma-Adenokarzinomen.

Insbesondere ist dieses Medikament dazu bestimmt, die therapeutische Wirksamkeit von Inhibitor-Verbindungen der Topoisomerasen 1 oder 2 bei der Behandlung von Tumoren, die gegen die üblichen Therapien refraktär sind, wie kolorektalen Krebse, Melanome, Gliome, Krebs der Prostata und der Brust, zu erhöhen.

In einer vorteilhaften Ausführungsform ist das vorliegende Medikament ein Antitumormittel, das dazu bestimmt ist, jede Art von Tumor zu behandeln, seien es Flüssigkeitstumoren oder feste Tumoren.

Vorteilhaft liegt das Medikament gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Form vor, die für die orale Verabreichung, vorteilhaft in Form von Gelatinekapseln, Kapseln, Tabletten, oder für die parenterale Verabreichung bestimmt ist, vorteilhaft mit einer Dosierung von 5 bis 400 mg/m2 für 24 h beim oralen Weg und von 2 bis 200 mg/m2 beim injizierbaren Weg.

Das erfindungsgemäße Medikament kann Patienten anfänglich oder nach einer oder mehreren Behandlungen mittels Chirurgie, Radiotherapie oder Chemotherapie verabreicht werden. Es kann allein oder in Kombination mit anderen Chemotherapien verabreicht werden. Dieses Medikament kann demgemäß darüber hinaus ein weiteres Antikrebsmittel umfassen.

Die folgenden Beispiele sind erläuternd, nicht beschränkend.

HERSTELLUNGSVERFAHREN Beispiel 1: Herstellung von 1/2 Ethanolat des 4'-Demethyl-4'-phosphat-2'',3''-bispentafluorphenoxyacetyl-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosids von Epipodophyllotoxin aus dem 4'-Demethyl-4'-dibenzylphosphat-2'',3''-bispentafluorphenoxyacetyl-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosid von Epipodophyllotoxin in amorpher Form.

Das freie Phosphat der Formel 2 in amorpher Form wird entweder durch das in der Patentanmeldung WO 96/12727 in Beispiel 22 beschriebene Verfahren oder gemäß dem in Beispiel 8 des Patents FR 2 791 682 beschriebenen erhalten.

Zum Beispiel: 15 g (11,6 mMol) 4'-Demethyl-4'-dibenzylphosphat-2'',3''-bispentafluorphenoxyacetyl-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosid von Epipodophyllotoxin werden unter Rühren zur Hydrierung für 30 min in 200 ml einer Mischung von Ethylacetat-Ethanol (1/3) mit 1,2 g 10 % Palladium auf Kohle unter Wasserstoffatmosphäre bei normalem Druck gegeben. Das Reaktionsmedium wird filtriert, das Filtrat wird eingedampft und in Diisopropylether digeriert, um ein amorphes Pulver der Formel 2 zu erhalten.

Schmelzpunkt (9300-Kapillare, elektrothermisch): ~ 138°C (Erweichung). Analytische Reinheit, HPLC: 99,5 %. DSC: Rf 0,5, Lösungsmittel: Dichlormethan – Methanol – Essigsäure 90/10/5.

Röntgendiagramm: Fig. 1 Herstellung des 1/2 Ethanolats:

10 g der vorstehend erhaltenen amorphen Form werden in 500 ml Ethanol gelöst. Diese Lösung wird für 20 min in einen Ultraschallbehälter (Bioblock-Scientific, Typ T 700, Frequenz 35 kHz) bei 30°C gegeben. Ein dicker Niederschlag erscheint, der anschließend abfiltriert und unter Vakuum getrocknet wird. Man erhält 7 g Kristalle.

Schmelzpunkt: 161°C. Das NMR-Spektrum zeigt die Anwesenheit von 1/2 Mol Ethanol. Diese Kristalle werden ein zweites Mal, dann ein drittes Mal in 130 ml Ethanol unter Rückfluss, dann mit langsamem Abkühlenlassen über 12 h umkristallisiert. Man erhält nach Filtration und Trocknen im Vakuum Kristalle.

Schmelzpunkt 165-166°C. Das NMR-Spektrum zeigt erneut die Anwesenheit von 1/2 Mol Ethanol.

Röntgendiagramm: Fig. 3 Beispiel 2: Herstellung des 4'-Demethyl-4'-phosphat-2'',3''-bispentafluorphenoxyacetyl-4'',6''-ethyliden&bgr;-D-glucosids von Epipodophyllotoxin in kristalliner Form aus dem 1/2 Ethanolat des 4'-Demethyl-4'-phosphat-2'',3''-bispentafluorphenoxyacetyl-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosids von Epipodophyllotoxin in kristalliner Form

Ein Aliquot der vorstehend erhaltenen Kristalle wird in feiner Schicht 10 Tage lang in einen geheizten Exsikkator bei 40°C gegeben. Das NMR-Spektrum zeigt den Verlust von Ethanol.

Schmelzpunkt 169°C. Röntgendiagramm: Fig. 2 Beispiel 3: Herstellung eines kristallinen Solvats mit Ethanol des 4'-Demethyl-4'-phosphat-2'',3''-bispentafluorphenoxyacetyl-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosids von Epipodophyllotoxin, das vom Hemiethanol verschieden ist

Das Phosphat der Formel 2 in amorpher Form wird entweder durch das in der Patentanmeldung WO 96/12727 im Beispiel 22 beschriebene Verfahren oder das im Beispiel 8 des Patents FR 2 791 682 beschriebene erhalten.

Die Kristallisationsschritte sind anschließend die folgenden:

  • – Zugabe von EtOH: ungefähr ein Volumen bezüglich des anfänglichen Volumens vor der Konzentration,
  • – Konzentration der Lösung: Verdampfen von etwa 50 % der Lösung,
  • – Abkühlen der Lösung auf 10°C und Halten dieser Lösung bei 10°C über 1,5 Stunden, indem man gleichzeitig mit einem Kristall der gemäß Beispiel 1 oder 2 erhaltenen Verbindung impft,
  • – Filtration bei 10°C und Waschen des erhaltenen kristallisierten Produkts mit Ethanol (wenn das Produkt nicht adäquat ist, wird eine zweite Umkristallisation durchgeführt, indem man wieder in Aceton löst und vorkonzentriert, dann die oben angegebenen Schritte wiederholt),
  • – Trocknen des Produkts im Ofen: unter Vakuum bei 40°C.

Man erhält ein kristallines Solvat mit Ethanol.

Röntgendiagramm: Fig. 4 und Fig. 5

  • HPLC-Reinheit: 99,1 %
  • Alkoholgehalt: 1,4 %
  • Wassergehalt: unterhalb von 1 %.

Beispiel 4: Herstellung des 4'-Demethyl-4'-phosphat-2'',3''-bispentafluorphenoxyacetyl-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosids von Epipodophyllotoxin in kristalliner Form aus dem Solvat mit Ethanol des 4'-Demethyl-4'-phosphat-2'',3''-bispentafluorphenoxyacetyl-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosids von Epipodophyllotoxin in kristalliner Form (Beispiel 3).

12 g der vorstehend erhaltenen Kristalle (Beispiel 3) werden in eine große Kristallisierschale im Inneren einer Vakuumglocke mit Heizplatte gegeben. Man legt Vakuum an und stellt die Temperatur bei 40°C ein.

Die Kristalle werden 10 Tage lang getrocknet. Am Ende dieser 10 Tage ist das Ethanol vollständig verdampft.

Ein Röntgen-Diffraktogramm wurde erstellt, welches die perfekte Kristallinität zeigt (6).

Beispiel 5: Kristallisationsversuche mit dem 4'-Demethyl-4'-phosphat-2'',3''-bisphenoxyacetyl-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosid von Epipodophyllotoxin, 4'-Demethyl-4'-phosphat-2'',3''-bis(4-trifluormethoxyphenoxyacetyl)-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosid von Epipodophyllotoxin und 4'-Demethyl-4'-phosphat-2'',3''-bis(4-methylphenoxyacetyl)-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosid von Epipodophyllotoxin.

4'-Demethyl-4'-phosphat-2'',3''-bisphenoxyacetyl-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosid von Epipodophyllotoxin, 4'-Demethyl-4'-phosphat-2'',3''-bis(4-trifluormethoxyphenoxyacetyl)-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosid von Epipodophyllotoxin und 4'-Demethyl-4'-phosphat-2'',3''-bis(4-methylphenoxyacetyl)-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosid von Epipodophyllotoxin in amorpher Form werden gemäß dem in der Patentanmeldung WO 96/12727 beschriebenen Verfahren erhalten.

100 mg dieser Verbindungen werden in 5 ml Ethanol bei Umgebungstemperatur gelöst. Diese verschiedenen Lösungen werden 20 min lang in den Ultraschallbehälter gegeben. Keinerlei Kristlalisation trat auf, selbst nach Reiben der Wände oder nach mehrtägigem Ruhenlassen gemäß den üblichen Verfahren, um die Kristallisation zu initiieren.

UNTERSUCHUNG DER KRISTALLINEN FORM

Röntgenbeugungsuntersuchungen an den verschiedenen vorstehend erhaltenen Formen (Formel 2 in amorpher Form, in kristalliner Form, Formel 3 in kristalliner Form und eine weitere kristalline Verbindung in Form des Solvats mit Ethanol) sowie Thermomikroskopie wurden an mehreren Proben für den Nachweis des Vorliegens der kristallinen Form durchgeführt.

Röntgenbeugungen:

Die Verbindung der Formel 2 in amorpher Form und in kristalliner Form, die Hemiethanolat-Verbindung der Formel 3 und ein kristallines Solvat mit Ethanol der Verbindung 4'-Demethyl-4'-phosphat-2'',3''-bispentafluorphenoxyacetyl-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosid von Epipodophyllotoxin, das vom Hemiethanolat verschieden ist und oben erhalten wurde, wurden durch Röntgenbeugungsanalyse am Pulver untersucht.

Die Apparatur ist ein Philips PN 1730, das mit einem Goniometer vom CGR-Typ C, horizontale Kupfer-Antikathode (&lgr; = 1,54051 Angström, 1 = 20 mA und V = 40 kV) (1 bis 4), ausgestattet war.

Die Proben werden der Analyse unter den folgenden Betriebsbedingungen unterzogen:

  • – Untersuchter Bereichswinkel 3 bis 25 Grad &thgr;
  • – Erfassungszeitpunkt 500 ms
  • – 5 Erfassungen (1 bis 4).

Bei der 5 ist die Apparatur ein Philips X'Pert PW 3040, das mit einem Goniometer mit Kupfer-Antikathode (K&agr;-Linie) ausgestattet ist.

Der untersuchte Bereichswinkel ist 2 bis 50° 2&thgr;.

Die Zählung ist 2 oder 2,4 s pro Schritt, wobei der Schritt einen Wert von 0,02° 2&thgr; aufweist.

Die Probe wird ohne spezielle Behandlung außer der Anwendung eines leichten Drucks zum Erhalt einer ebenen Oberfläche gemessen. Ein Blatt aus Kapton wurde auf die Probe gegeben, um die Verunreinigung der Kammer durch die zytostatische Probe zu vermeiden. Die verwendete Atmosphäre ist Umgebungsluft.

Bei der 6 wird das Diagramm mit einer Apparatur Philips X'Pert MPD aufgezeichnet, welche mit einem Xcelerator und einer Kupfer-Antikathode ausgestattet war (K&agr;-Linie, Intensität: 20 mA, Spannung 40 kV, Wellenlänge &lgr;: 1,5418367 Angström) ohne Monochromator und mit Nickel-Filter.

Die Aufzeichnung wird im kontinuierlichen Modus durchgeführt. Die Scans sind &OHgr; = 2&thgr;.

Die Zählung ist 100 s pro Schritt, wobei der Wert des Schritts 0,02° 2&thgr; war.

Die Intensität mit 100 % wird der Linie zugeordnet, deren Wert der Zahl der Zählereignisse am größten ist. Die Zahl der Zählereignisse ist proportional zur absoluten Intensität jeder Linie.

Ergebnisse:

Das Beugungsdiagramm zeigt, dass die Kristallinität (verbunden mit der Zahl der Zählereignisse der Linie bei 100 %) im Fall der Probe der Formel 2 (2 und 6) und auch in dem der Solvat-Probe der Formel 3 (3) und im anderen Solvat (4 und 5) eindeutig sehr ausgeprägt ist. Die amorphe Probe der Formel 2 weist keine derartigen Linien auf (1).

Thermomikroskopie:

Eine physikalisch-chemische Thermomikroskopie-Untersuchung wurde vorgenommen, welche beim Hemiethanolat der Formel 3 durch einen Temperaturanstieg einen kristallinen Zustand zeigte.

Die verwendete Apparatur ist das System FP52, das mit einer Programmiereinrichtung FP5 (Mettler) verbunden war. Die Proben werden zwischen Klinge und Lamelle angeordnet und gemäß einer programmierten Geschwindigkeit zwischen 30 und 150°C erwärmt.

Die Probe der Formel 2 in amorpher Form bleibt amorph und kristallisiert nicht beim Temperaturanstieg.

Die Hemiethanolat-Probe der Formel 3 ist kristallin. Sie zeigt einen Lösungsmittelverlust bis zur Temperatur von 150°C, das Schmelzen findet in der Gegend von 165°C unter Zersetzung statt.

STABILITÄTSUNTERSUCHUNG Nachweis der Pulver-Stabilität.

Untersuchungen der Pulver-Stabilität wurden an der Verbindung der Formel 2 in amorpher Form und an der oben erhaltenen Verbindung der Formel 3 in kristalliner Form unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:

Bei 40°C im geschlossenen Fläschchen über 1 Monat.

Bei 30°C bei 75 % relativer Luftfeuchtigkeit im offenen Fläschchen über 1 Monat.

Für die Stabilitätsuntersuchungen im geschlossenen Fläschchen werden die Proben hermetisch in bernsteinfarbene Kolben eingeschlossen (Alltech, Bezugsglasfläschchen 98037, Bezugsstopfen 6687).

Die Stabilitätsuntersuchungen im offenen Fläschchen werden durch Aufbewahrung des Pulvers in einem Exsikkator durchgeführt, welcher eine gesättigte NaCl-Salzlösung enthält (75 % relative Feuchtigkeit/30°C).

Der Gehalt an freier Phosphat-Verbindung der Formel 2 wird durch interne Normierung mit dem folgenden HPLC-Chromatographiesystem ausgewertet:

  • Säule: Symmetrie C8, 5 &mgr;, 250 × 4,6 mm (Waters)
  • Eluent: CH3CN/H2O/KH2PO4600/400/3,4 (ml/ml/g), mit 10 %-iger H3PO4 auf pH 4 eingestellt
  • Durchsatz: 1 ml/min
  • Detektion: 220 nm

Die Analysen werden auf der Lachrom-Merck-Hitachi HPLC-Kette bewirkt, welche mit einer L-7100-Pumpe, einem L-7200-Probenwechsler, einem L-7450 Dioden-Stabdetektor und einer HSM D-7000-Verarbeitungssoftware ausgestattet war.

Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefasst:

Tabelle 1: % Zersetzungsprodukte der Verbindung der Formel 2 in amorpher Form und der Verbindung der Formel 3 in kristalliner Form gemäß den Aufbewahrungsbedingungen

Die Untersuchungen der Pulver-Stabilität zeigen, dass die Verbindung der Formel 2 in amorpher Form weniger stabil ist als die Hemiethanolat-Verbindung der Formel 3 in kristalliner Form, unabhängig davon, wie die Stabilitätsbedingungen sind:

Bei 40°C nach 1 Monat im hermetisch verschlossenen Fläschchen sind 11,9 % Zersetzungsprodukte bei der Verbindung der Formel 2 in amorpher Form aufgetreten, gegenüber 1,5 % bei der Hemiethanolat-Verbindung der Formel 3 in kristalliner Form.

Bei 30°C nach 1 Monat in Gegenwart von relativer Feuchtigkeit sind 50 % Zersetzungsprodukte bei der Verbindung der Formel 2 in amorpher Form aufgetreten, gegenüber 1,8 % bei der Hemiethanolat-Verbindung der Formel 3 in kristalliner Form.

Ein Merkmal der Erfindung ist demgemäß der Vorteil mit Bezug auf die Stabilität der kristallinen Hemiethanolat-Form der Formel 3 im Vergleich zu ihrer freien amorphen Form (Formel 2).

PHARMAKOLOGISCHE STUDIE

Die Verwendung der als Salz von N-Methyl-D-glucamin vorliegenden Phosphat-Form der Formel 1 kann nicht unter guten Bedingungen im Stadium von klinischen Studien vorgenommen werden; die Studie der freien amorphen Phosphat-Form der Formel 2 wurde angestrebt. Es erwies sich im Lauf der pharmakologischen Studie, dass die Verbindung in ihrer freien amorphen Phosphat-Form nicht die in-vivo-Aktivität besitzt, die mit ihrem N-Methyl-D-glucamin-Salz nachgewiesen wurde, wie dies im British Journal of Cancer (2000), 83(11), 1516-1524 veröffentlicht worden ist. Im Gegensatz dazu zeigt die kristalline Form, die entweder in Form des Hemiethanolats der Formel 3 oder in freier Form der Formel 2 erhalten worden ist, die erforderliche pharmakologische Aktivität.

Material und Methoden Lösen der Verbindungen für die Bewertung in vivo

Die verschiedenen amorphen und kristallinen Formen der Verbindungen der Formel 2 und 3 werden in einer Mischung, die 5 % Tween 80 und 95 % 5 %-ige Serumglucose enthält, gelöst oder suspendiert.

Experimentelles Tumormodell.

Das verwendete Modell ist die Leukämie P388 (Dykes, D.J. und Waud, W.R.: Murine L1210 and P388 Leukemias. In Tumor Models in Cancer Research, Teisher, B.A. Hsg., Humana Press Inc., Totowa, NJ, S. 23-40, 2002), welche durch aufeinanderfolgende intraperitoneale Transplantationen bei der DBA/2-Maus (DBA/2JIco, Charles River) aufrechterhalten wird, wie es früher beschrieben wurde (Kruczynski, A. und Hill, B.T.: Classic in vivo cancer models: Three examples of mouse models used in experimental therapeutics. Current Protocols in Pharmacology Unit 5.24: 5.24.1-5.24.16, 2001).

Experimentelle Chemotherapie

Die Tiere werden gemäß der Richtlinie zur Pflege und Verwendung von Labortieren (National Research Council, 1996) und der europäischen Richtlinie EEC/86/609 unter der Leitung von Forschern, die autorisiert sind, Labortiere zu betreuen, untergebracht, versorgt und gehandhabt. Darüber hinaus werden alle Experimente gemäß der französischen Gesetzgebung und den Regeln des Comité d'Ethique du Centre de Recherche Pierre Fabre durchgeführt, die auf den Richtlinien des UKCCCR (United Kingdom Coordinating Committee on Cancer Research) für die Pflege von Tieren in der experimentellen Onkologie beruhen (Workman, P., Twentyman, P., Balkwill, F., Balmain, A., Chaplin, D., Double, J., Embleton, J., Newell, D., Raymond, R., Stables, J., Stephens, T. und Wallace, J.: United Kingdom coordinating committee on cancer research (UKCCR) guidelines for the welfare of animals in experimental neoplasia. Br. J. Cancer 77: 1-10, 1998). Das Experiment wird gemäß einem bereits früher beschriebenen Protokoll durchgeführt (Kruczynski, A., Colpaert, F., Tarayre, J.P., Mouillard, P., Fahy, J. und Hill, B.T.: Preclinical in vivo antitumor activity of vinflumine, a novel fluorinated Vinca alkaloid. Cancer Chemother. Pharmacol. 41: 437-447, 1998). Dieses besteht darin, C2DF1-Hybridmäusen (CD2F1/CrIBR, Charles River, St Aubin-les-Elbeuf, Frankreich) am Tag null 106 Leukämie-P388-Zellen pro Maus auf intravenösem Weg zu implantieren. Nach Randomisierung der Tiere in die Behandlungskäfige und Kontrolle werden die zu bewertenden Verbindungen in einer einzigen Injektion auf intraperitonealem Weg am nächsten Tag nach der Tumorpfropfung, am Tag 1, verabreicht. Die Tiere werden anschließend jeden Tag überwacht, zweimal pro Woche gewogen und jede klinische Reaktion wird aufgezeichnet.

Bewertung der antitumoralen Wirkung

Das Überleben ist der Bewertungsparameter der antitumoralen Wirkung. Die Steigerung des Überlebens ist durch das Verhältnis B/K (%) definiert, welches entspricht: (Median des Überlebens der behandelten Gruppe/Median des Überlebens der Kontrollgruppe) × 100.

Ergebnisse Bewertung der antitumoralen Wirkung von verschiedenen Formen der Verbindungen der Formel 2 und 3 am in-vivo-Modell der P388-Leukämie.

Drei Formen der Verbindungen sind in vivo bewertet worden, das heißt: die Verbindung der Formel 2 in amorpher Form (Formel 2, amorph), die Verbindung der Formel 2 in kristalliner Form, die getrocknet wurde, um jede Spur des Lösungsmittels Ethanol zu eliminieren, (Formel 2, kristallin) und die Verbindung der Formel 3 in kristalliner Form, die an halbes Mol Ethanol enthält (Formel 3, kristallin). Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengefasst:

Tabelle 2: Wert von B/K (in %) für die Verbindungen der Formel 2 oder 3 in amorpher oder kristalliner Form als Funktion der injizierten Dosis der Verbindung

Die Ergebnisse zeigen, dass die zwei Verbindungen der Formel 2 und 3 eine signifikante Steigerung des Überlebens der Tiere bereits ab einer Dosis von 40 mg/kg induzieren, welche durch einen Wert des Verhältnisses B/K von 143 % widergespiegelt wird, was anzeigt, dass die Behandlung der Tiere durch die eine oder die andere der beiden Verbindungen in kristalliner Form es ermöglicht hat, das Überleben der Tiere um 43 % zu verlängern. In der Tat wird gemäß den Kriterien des NCl (National Cancer Institute) ein Wert von B/K als signifikant angesehen, wenn er mindestens oberhalb von 120 liegt, und er wird als äußerst signifikant oder als eine antitumorale Wirkung von hohem Niveau widerspiegelnd angesehen, wenn er über 175 % liegt (Venditti, J.M.: Preclinical drug development: Rationale and methods. Semin. Oncol. 8: 349-361, 1981). Die antitumorale Wirkung, die durch die Verbindungen der Formel 2 oder 3 in kristalliner Form induziert wird, nimmt mit der Dosis der Verbindung zu, um einen optimalen Wert bei einer Dosis von 160 mg/kg zu erreichen, was durch die Werte von B/K von 329 % bei der Verbindung der Formel 3 in kristalliner Form und von 300 % bei der Verbindung der Formel 2 in kristalliner Form widergespiegelt wird. Diese Werte zeigen an, dass die Behandlung der die Leukämie P388 tragenden Tiere durch die Verbindungen der Formel 2 oder 3 in kristalliner Form es ermöglicht hat, das Überleben der Tiere um 200 % bzw. 229 % zu verlängern.

Im Gegensatz zu den kristallinen Formen induziert die Verbindung der Formel 2 in amorpher Form keine signifikante Antitumor-Wirkung bei Dosen von 40 bis 80 mg/kg, was durch die Werte von B/K unterhalb von 120 %, d.h. 100 % bzw. 114 %, widergespiegelt wird. Die Verbindung der Formel 2 in amorpher Form induziert eine Antitumor-Wirkung erst bei einer Dosis von 160 mg/kg, was aber dennoch der Wirkung sehr unterlegen ist, die mit den Verbindungen der Formel 2 oder 3 in kristalliner Form bei derselben Dosis erhalten wird. In der Tat beträgt der Wert von B/K, der bei der Dosis von 160 mg/kg für die Verbindung der Formel 2 in amorpher Form erhalten wird, 157 %, während er 329 % bzw. 300 % bei den Verbindungen der Formeln 3 und 2 in kristalliner Form beträgt.

Es ist anzumerken, dass diese Wirkungen keinerlei signifikanten Gewichtsverlust der Tiere induzieren, was nahelegt, dass die Verbindungen vom Tier gut vertragen werden.

Zusammenfassend induzieren die Verbindungen der Formeln 2 oder 3 in kristalliner Form beim Modell der Leukämie P388 eine Antitumor-Wirkung auf hohem Niveau, die klar der Wirkung der Verbindung der Formel 2 in amorpher Form überlegen ist.

Diese Verbindungen haben demgemäß eine große Bedeutung im therapeutischen Antikrebs-Arsenal. Durch parenterale Verabreichung mittels Infusion oder auf oralem Weg erlauben sie es, alle Arten von Krebs zu behandeln, seien es Flüssigkeitstumoren oder feste Tumoren. Sie können den Patienten als Anfangsbehandlung oder nach einer oder mehreren Behandlungen durch Chirurgie, Radiotherapie oder Chemotherapie verabreicht werden. Diese Verbindungen können allein oder in Kombination mit anderen Chemotherapien verabreicht werden.


Anspruch[de]
Die kristalline Verbindung 4'-Demethyl-4'-phosphat-2'',3''-bispentafluorphenoxyacetyl-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosid von Epipodophyllotoxin in freier Form der folgenden Formel 2:
oder in Form eines Solvats mit Ethanol.
Kristalline Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Solvat mit Ethanol ein Hemiethanolat-Solvat der folgenden Formel 3 ist:
Kristalline Verbindung nach Anspruch 1 in freier Form der Formel 2, dadurch gekennzeichnet, dass ihr Röntgendiagramm ungefähr jenem der 2 oder 6 entspricht. Kristalline Verbindung nach den Ansprüchen 1 oder 2 in Form des Hemiethanolat-Solvats der Formel 3, dadurch gekennzeichnet, dass ihr Röntgendiagramm ungefähr jenem der 3 entspricht. Verfahren zur Herstellung der kristallinen Verbindung nach den Ansprüchen 1, 2 oder 4 in Form des Hemiethanolat-Solvats, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der Formel 2 in amorpher Form in wasserfreiem Ethanol in Anwesenheit von Ultraschall gelöst wird. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Ultraschall während mindestens 20 Minuten angewendet wird. Verfahren zur Herstellung der kristallinen Verbindung nach den Ansprüchen 1 oder 3 in freier Form, dadurch gekennzeichnet, dass die kristalline Verbindung in Form des Hemiethanolat-Solvats der Formel 3 getrocknet wird, vorteilhaft unter Vakuum. Verfahren zur Herstellung der kristallinen Verbindung nach den Ansprüchen 1, 2 oder 4 in Form eines Solvats mit Ethanol, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte umfasst:

a) Zugabe von Ethanol zur Verbindung der Formel 2 in amorpher Form,

b) Konzentrieren der Lösung,

c) Kristallisation des 4'-Demethyl-4'-phosphat-2'',3''-bispentafluorphenoxyacetyl-4'',6''-ethyliden-&bgr;-D-glucosids von Epipodophyllotoxin in Form eines Solvats mit Ethanol durch Kühlen der konzentrierten Lösung auf 10°C während 1,5 h und durch Zugabe eines Keimkristalls, der aus einem Kristall der Verbindung der Formel 2 in freier Form oder der Verbindung der Formel 3 in Form des Hemiethanolat-Solvats besteht,

d) Filtration bei 10°C und Spülen mit Ethanol,

e) Trocknen des erhaltenen Produkts.
Medikament, umfassend eine kristalline Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4. Medikament nach Anspruch 9, das bestimmt ist zur Antikrebs-Behandlung von Flüssigkeitstumoren oder festen Tumoren, insbesondere von kleinzelligem Lungenkrebs, embryonalen Tumoren, Neuroblastomen, Nierenkrebs, pädiatrischen Tumoren, Hodgkin-Lymphom und non-Hodgkin-Lymphom, akuten Leukämien, Plazenta-Chorioblastomen, Mama-Adenokarzinomen. Medikament nach Anspruch 9, das zur Steigerung der therapeutischen Wirksamkeit von Inhibitor-Verbindungen der Topoisomerasen 1 und 2 und für die Behandlung von Tumoren bestimmt ist, die gegenüber üblichen Therapien refraktär sind, wie kolorektalen Krebsen, Melanomen, Gliomen, Prostata- und Brustkrebs. Medikament nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es in einer Form vorliegt, die für eine orale oder parenterale Verabreichung bestimmt ist. Medikament nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es darüber hinaus ein weiteres Antikrebsmittel umfasst.






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