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Dokumentenidentifikation DE102006050259A1 03.01.2008
Titel Vereinfachtes Verfahren zur lichtmikroskopischen Relokalisation von Objekten mit Hilfe eines fluoreszierenden Koordinatensystems unter Verwendung eines photolitographischen Strukturierungsprozesses
Anmelder Cremer, Christoph, Prof. Dr.Dr., 69126 Heidelberg, DE;
Amberger, Roman, Dipl.-Phys., 68766 Hockenheim, DE
Erfinder Cremer, Christoph, Prof. Dr.Dr., 69126 Heidelberg, DE;
Amberger, Roman, Dipl.-Phys., 68766 Hockenheim, DE
DE-Anmeldedatum 23.10.2006
DE-Aktenzeichen 102006050259
Offenlegungstag 03.01.2008
Veröffentlichungstag im Patentblatt 03.01.2008
IPC-Hauptklasse G02B 21/34(2006.01)A, F, I, 20061023, B, H, DE
IPC-Nebenklasse G01N 21/64(2006.01)A, L, I, 20061023, B, H, DE   G01N 33/48(2006.01)A, L, I, 20061023, B, H, DE   G01N 33/483(2006.01)A, L, I, 20061023, B, H, DE   G01N 21/01(2006.01)A, L, I, 20061023, B, H, DE   
Zusammenfassung Gegenstand der Erfindung ist ein vereinfachtes Verfahren zur lichtmikroskopischen Relokalisation von Objekten mit Hilfe eines fluoreszierenden Koordinatensystems unter Verwendung eines photolithographischen Strukturierungsprozesses. Mit diesem Prozess wird ein breitbandig anregbares, fluoreszierendes Koordinatensystem auf kommerzielle Mikroskopie-Deckgläser und/oder Mikroskopie-Objektträger aufgebracht und kann in der Licht- und Fluoreszenzmikroskopie zur mikrometergenauen Relokalisation mikroskopsicher Objekte verwendet werden.

Beschreibung[de]
I. Problemstellung

Lichtmikroskopische Verfahren sind von größter Bedeutung für die Analyse von biologischen Mikrosystemen. Beispiele hierfür sind Gewebeschnitte, einzelne Zellen, sowie Untereinheiten einzelner Zellen, wie Membranen, Cytoplasmatische Strukturen, oder Strukturen des Zellkerns. In Verbindung mit geeigneten Markierungsverfahren, insbesondere Fluoreszenzmarkierungsverfahren, sind vielfache diagnostische Analysen möglich. Zum Beispiel sind umfangreiche pathologisch relevante Analysen der Zellkernstruktur oder der genetischen Konstitution auf dem Einzelzellniveau möglich. Eine weitere Anwendung lichtmikroskopischer Verfahren ergibt sich bei der Analyse einzelner isolierter Zellbestandteile. Je nach Problemstellung sind dabei verschiedene lichtmikroskopische Verfahren zu verwenden. Für viele Analysen genügen beispielsweise epifluoreszenzmikroskopische Verfahren unter Verwendung inkohärenter Lichtquellen. Solche Epifluoreszenzverfahren haben in der Objektebene eine optimale laterale optische Auflösung von etwa 200 nm, während die axiale optische Auflösung in Richtung der Optischen Achse um ein Vielfaches schlechter ist. Zur genaueren Analyse der dreidimensionalen Struktur biologischer Objekte werden daher vielfach Verfahren der konfokalen Laserscanning Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt. Konventionelle Verfahren der konfokalen Laserscanning Fluoreszenzmikroskopie haben eine laterale optische Auflösung von ca. 200 nm und eine axiale optische Auflösung von ca. 600 nm. Noch wesentlich verbesserte Analysemöglichkeiten ergeben sich bei Verwendung neuer Fluoreszenzmikroskopietechniken auf der Basis des Point Spread Function Engineering unter Verwendung fokussierten Laserlichts oder von Strukturierter Beleuchtung.

Mit diesen letztgenannten Methoden wird derzeit eine stark verbesserte optische Auflösung bzw. Größenauflösung bis zu ca. 20 nm erreicht, entsprechend etwa 1/20 bis 1/40 der zur Anregung verwendeten Lichtwellenlänge. Diese Verfahren sind jedoch technisch außerordentlich aufwendig. Daher ist es wirtschaftlich sinnvoll, sie nur dort zu verwenden, wo die optische Analyse mit Hilfe jeweils einfacherer lichtmikroskopischer Verfahren nicht ausreichend ist.

Einer der entscheidenden Vorteile mikroskopischer Verfahren im Gegensatz zu biochemischen oder molekularbiologischen Techniken ist die Möglichkeit der Analyse einzelner biologischer Mikrostrukturen. Daraus ergibt sich, dass es außerordentlich wünschenswert ist, solche einzelnen biologischen Objekte mit Hilfe eines einfachen und ökonomisch vorteilhaften Verfahrens in verschiedenen Mikroskopiesystemen für weitere Analysen relokalisieren zu können. Beispielsweise könnte so eine erste Auswahl interessierender Objekte mit Hilfe von Epifluoreszenzmikroskopie vorgenommen werden; die ausgewählten und relokalisierten Objekte könnten anschließend mittels von Methoden der konfokalen Laserscanning Fluoreszenzmikroskopie näher analysiert werden; eine weitere Analyse hierbei ausgewählter Objekte könnte dann nach Relokalisierung derselben Objekte unter Verwendung von Techniken des Point Spread Function Engineering unter Verwendung fokussierten Laserlichts oder von Strukturierter Beleuchtung erfolgen.

Das hier beschriebene erfindungsgemäße Verfahren erlaubt eine rasche, automatisierbare, mikrometergenaue und ökonomisch vorteilhafte lichtmikroskopische Relokalisation von Objekten.

II. Stand der Technik

Nach dem Stand der Technik wurden verschiedene Verfahren zur lichtmikroskopischen Relokalisierung von biologischen Objekten, insbesondere von Zellen, beschrieben. In der mikroskopischen Analyse solcher zellulärer Objekte werden heute verschiedene kommerzielle Hilfsmittel eingesetzt, um dieselbe Zelle mit verschiedenen Mikroskopieverfahren gezielt wieder zu finden.

Solche am Markt befindlichen Systeme bestehen entweder aus:

  • a) einer Glasscheibe, auf welche ein schwarzes Gittermuster gedruckt wurde (CellLocate Grid, Firma Eppendorf, Hamburg)
  • b) einem Objektträger, in welchen mit einem IR-Laser (IR = infra rot) Strukturen eingeschrieben werden (Cellfinder Mikroskopie-Objektträger, Firma Ing. L.G.A.Luttmer, Arnheim – Holland), ähnlich US-Patent 4,415,405 (URL: http://www.antenna.nl/microlab/)
  • c) einem Polymer mit fluoreszierenden Partikeln, welches mit einem 2-Photonen-Laser ausgehärtet wird.

Die Systeme a und b haben den Nachteil, dass in der Fluoreszenzmikroskopie umständlich zwischen Durchlicht- und Fluoreszenzbeleuchtung umgeschaltet werden muß, da weder die Strukturen des IR-Lasers noch das schwarze Gittermuster in der Folie dargestellt werden können.

Dies führt zu sehr viel aufwendigeren Relokalisationsverfahren. Für konkrete Anwendungen, in denen z.B. tausende von Zellen zu analysieren sind, ergibt sich hierdurch ein ganz erheblicher Mehraufwand. Da moderne analytische Fluoreszenzmikroskopsysteme vielfach sehr spezialisiert sind, ist eine serienmäßige Analyse derselben Zellen mit derartigen Systemen nur möglich, wenn beim Wechsel zwischen verschiedenen Mikroskopsystemen die Relokalisation derselben Objekte rasch und einfach durchgeführt werden kann. Bei heutigen analytischen Lichtmikroskopieverfahren bedeutet dies insbesondere die Automatisierbarkeit des Verfahrens. Diese würde durch klare, bildanalytisch leicht detektierbare fluoreszierende Muster ganz wesentlich vereinfacht.

Eine ähnliche Methode ist in „Microscopy Research and Technique, 2005" unter der Bezeichnung „Two-Photon Fluorescent Microlithography for Live-Cell Imaging" von Santiago Costantino beschrieben. Seine Methode unterscheidet sich jedoch darin, dass mit 2-Photonen-Anregung ein im ultravioletten aushärtendes Polymer mit fluoreszierenden Partikeln verwendet wird und die darin eingebrachten fluoreszierenden Partikel darin eingeschlossen werden, indem ein gepulster Laserstrahl mittels einer xy-Scannereinrichtung direkt das Polymer beschreibt.

In der hier vorgelegten Erfindung verwenden wir hingegen ausschließlich ein im Ultravioletten aushärtendes Polymer und nutzen dessen Eigenfluoreszenz aus, ohne daß zusätzlich fluoreszente Partikel eingebracht werden müssen. Ein weiterer Unterschied besteht darin, dass das von uns beschriebene erfindungsgemäße Verfahren eine Maske verwendet, was zum einen für eine wirtschaftliche und schnelle Massenproduktion unumgänglich ist; zum anderen verwenden wir zur Belichtung eine gewöhnliche UV-Lampe anstatt des sehr teuren 2-Photonen Lasersystems. Einzig zur einmaligen Herstellung der Maske wird ein UV-Laser benötigt, der jedoch im 1-Photonen-Modus arbeitet, z.B. ein He-Cd Laser mit einer Emission von 325 nm.

Weiterhin beschreibt die von Costantino publizierte Methode im Gegensatz zu unserer nicht, wie sich eine Resistenz der fluoreszierenden Schicht gegenüber der Umgebung (z.B. Zellen) ergibt und auch nicht, wie innerhalb kurzer Zeiten eine eindeutige automatisierbare Relokalisation von Objekten möglich sei.

Zur Methode b) (US-Patentnummer 4,415,405):

Dieses Patent steht mit seinen Ansprüchen und auch mit der Methode nicht im Zusammenhang mit dem von uns bechriebenen Verfahren. Die in US 4,415,405 verwendete Methode ist materialabtragend; wir hingegen bringen zusätzliches Material auf. Weiterhin ist die o.g. Patentmethode nicht fluoreszent und besteht zudem aus einem feinmaschigen Gitternetz, welches wiederum die zur Proben-Detektion verfügbare Freifläche stark reduziert. Eine schnelle automatisierte Relokalisation ist ebenfalls nicht beschrieben. Die einzige Gemeinsamkeit besteht in der lithographischen Strukturierung einer Schicht, was jedoch ein seit Jahrzehnten etablierter Stand der Technik ist.

III. Problemlösung durch das erfindungsgemäße Verfahren

Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung wird anhand der folgenden Anwendungsbeispiele zur lichtmikroskopischen Relokalisation von Objekten mithilfe eines fluoreszierenden Koordinatensystems unter Verwendung eines photolitographischen Strukturierungsprozesses beschrieben.

Ausführungsbeispiel 1

Die Erfindung (im weiteren Mikrofluoreszenzkoordinator, MFK genannt) löst das Problem wie folgt:

Der MFK wird auf den Träger der biologischen Objekte aufgebracht.

Beispielsweise ist der Träger ein Mikroskopiedeckglas mit 24·24·0,17 mm. Auf diesen wird ein fluoreszierender Photoresist, z.B. Typ AZ1505 (Microchemicals GmbH, Ulm) nach dem Spincoating-Verfahren aufgebracht, wobei eine Lackdicke von ca. 600 nm erreicht wird.

Die Strukturierung erfolgt lithographisch mit einer Maske und UV-Licht (UV = ultra violett). Im Anschluß an den Belichtungsprozeß nach dem Stand der Technik wird der belackte Mikroskopieträger in ein Entwicklerbad gegeben.

Damit diese Photoresist-Struktur die (meist biologischen) Präparate nicht beeinflussen kann, wird die fertig entwickelte Lackschicht mit einer ca. 1 &mgr;m dicken SiO2-Schicht bedeckt.

Diese Schicht wird mit einem Sputtergerät aufgebracht und verschafft dem System sowohl eine chemische Passivierung gegen Alkohole und Lösungsmittel, eine erweiterte mechanische Festigkeit und eine Oberfläche, auf der lebende Zellen ohne größere Schädigungen mikroskopiert werden können.

Der fluoreszierende MFK beispielsweise weist eine rechtwinklige Anordnung von zwei 20 &mgr;m breiten Linien auf, die jeweils eine Länge von 15 mm haben. Im Abstand von 500 &mgr;m befindet sich jeweils eine 10 &mgr;m breite und 200 &mgr;m lange Linie als Markierung, die zusätzlich alle 1000 &mgr;m fortlaufend von 1 bis 15 mit einer 130 &mgr;m großen Nummer beschriftet ist, so daß das System als ein eigenständiges Längen-Messgerät verwendet werden kann. Ein 1 mm langes Feinraster, dessen Rastergröße 50 &mgr;m beträgt, befindet sich auf beiden Achsen jeweils in deren Mitte und dient der genaueren Auflösungsbestimmung des verwendeten Verschiebetisches.

Die zeigt schematisch diese Struktur. Andere geometrische Anordnungen, die eine Positionierung des Objekts erlauben, sind ebenfalls erfindungsgemäß.

Einzelheiten der Technischen Realisierung des Mikrosfluoreszenzkoordinators 1. Maskenherstellung:

  • • Quarzglasscheibe, hier 70 × 70 mm für 10 min. mit Millipore-Wasser in ein Ultraschallbad legen
  • • Mit Stickstoffgas trocknen
  • • Für 20 min. in 10% Dextranlösung in ein Ultraschallbad legen
  • • Mit Millipore-Wasser abspülen
  • • Für 10 min mit Millipore-Wasser in ein Ultraschallbad legen
  • • Bei 200°C 5 min. auf eine Heizplatte legen
  • • 100 &mgr;L Hexadimethylsiloxan zusammen mit der Glasscheibe in einen Exikator geben
  • • 10 min lang den Exikator evakuieren
  • • 20 min das Glas im Exikator trocknen lassen
  • • 1000 &mgr;L AZ1505 Lack mit einem Spincoater auf das Glas aufbringen (4000 rpm 35 s).
  • • Softbake des Lacks bei 80°C für 30 min auf einer Heizplatte
  • • Mit einem CAD-Programm (hier AutoCAD2004) wird die Struktur im Maßstab 1:1 erstellt
  • • Anschließend mit einem Maskenschreiber (DWL66, Heidelberg Instruments) die importierte AutoCAD-Struktur schreiben
  • • Maske 1 min mit AZ305 entwickeln (Verdünnung 1:6 mit Millipore-Wasser)
  • • 15 min in Millipore-Wasser legen
  • • mit Stickstoffgas trocknen
  • • 150 nm Chrom mit einem Plasmasputter auf die entwickelte Maske sputtern
  • • Maske 15 min in Aceton legen, um den unbelichteten Lack unter der Chromschicht zusammen mit dieser abzulösen (Lift-off Technik)
  • • Mit Millipore-Wasser abspülen
  • • Mit Stickstoffgas trocknen.

Eine solche Maske braucht nur einmal hergestellt zu werden und hat eine Lebenserwartung von mehreren tausend Belichtungszyklen, entsprechend einer Verwendbarkeit für die Herstellung von mehreren tausend MFK. Mit Hilfe von Computer Aided Design (CAD) Verfahren nach dem Stand der Technik können beliebige andere Muster realisiert werden. Erfindungsgemäß sind dabei alle Muster, die eine Relokalisierung der biologischen Objekte mit einer Präzision besser als 50 &mgr;m erlauben.

2. Lackierung und Strukturierung der Deckgläser:

  • • Deckglas 5 min. mit Aceton in ein Ultraschallbad legen
  • • Mit Millipore-Wasser abspülen
  • • Mit Stickstoffgas trocknen
  • • Deckglas mit 175 &mgr;L Lack AZ1505 in einem Spincoater beschichten (400 rpm 15 s, 4000 rpm 45 s)
  • • Für 30 min bei 80°C auf eine Heizplatte legen (Softbake)
  • • Maske auf das beschichtete Deckglas legen und für 10 s mit UV-Licht belichten
  • • 15 s in Lösungsmittel AZ351 entwickeln (Verdünnung 1:6 mit Millipore-Wasser)
  • • Mit Millipore-Wasser den Entwickler vom Deckglas abspülen
  • • Mit Stickstoffgas trocknen

Durch die Molekülstruktur des Photolackes lässt sich Fluoreszenzlicht innerhalb eines sehr breiten Spektrums anregen; daher erlaubt diese hier vorgestellte Methode eine einfache Verwendung in der Fluoreszenzmikroskopie. Wird anstatt einer Fluoreszenzmikroskopie-Technik eine Auflicht- oder Durchlichtmikroskopie-Methode verwendet, ist ebenfalls die Struktur des Koordinatensystems zu erkennen, da der Lack ein merkliches Absorptionsvermögen aufweist. Mit Phasenkontrastmikroskopie ist die Struktur wegen des vom Glas abweichenden Brechungsindex ebenfalls eindeutig und gut sichtbar.

3. Anwendung des MFK zur Bestimmung von Objektpositionen

Die Objektrelokalisation geschieht in einem 4-stufigen Prozeß. Zunächst werden die Objekte mithilfe eines ersten Mikroskopsystems analysiert; ein solches erstes Mikroskopsystem kann z.B. ein Epifluoreszenzmikroskop oder ein konfokales Laserscanning Fluoreszenzmikroskop sein. Für eine rasche Relokalisation der Objekte in einem zweiten Mikroskopsystem ist es vorteilhaft, wenn eine digitale Registrationsmöglichkeit besteht. Die Koordinaten eines an diesem ersten Mikroskopsystem befindlichen Verschiebetisches werden rechnerisch auf die orthogonale Lackstruktur der hier beschriebenen Erfindung transformiert. Bei Vorliegen einer digitalen Registrierung ist dieser Schritt mit bildanalytischen Methoden leicht automatisierbar. Dieser Schritt wird für jedes zu untersuchende Objekt durchgeführt. Zusätzlich wird die Position des Schnittpunktes sowie mindestens eines weiteren Referenzpunktes auf einer der beiden Lack-Achsen bestimmt.

Die zweite Stufe besteht nun darin, die in dem ersten Mikroskopiesystem analysierten Objekte (z.B. Zellen) in einem zweiten Mikroskopsystem erneut zu identifizieren. Identifizieren bedeutet, ein bestimmtes in dem ersten Mikroskopiesystem detektiertes Objekt, z.B. eine bestimmte Zelle, in dem zweiten Mikroskopiesystem innerhalb kurzer Zeit mit einer für die Identifikation ausreichenden Präzision der Relokalisierung sicher wieder aufzufinden. Ein solches zweites Mikroskopsystem kann z.B. ein konfokales Laserscanning Fluoreszenzmikroskop mit anderen technischen Eigenschaften sein, oder ein 4Pi-Mikroskop, oder ein Spatially Modulated Illumination Mikroskop, oder irgend ein anderes Mikroskopsystem. Das zweite Mikroskopsystem kann auch mit dem ersten Mikroskopsystem identisch sein. Für zelluläre Objekte mit einer typischen Ausdehnung von 10 &mgr;m bis 30 &mgr;m ist eine Präzision im Bereich mehrer Mikrometer völlig genügend. Hierzu wird erneut die Position des Schnittpunkts der beiden Achsen sowie der Referenzpunkt gesucht. Sind diese zwei Punkte gefunden, kann der Drehwinkel zwischen beiden Meßreihen auf einfache Weise nach bekannten trigonometrischen Verfahren berechnet werden. In der dritten Stufe wird nun eine Drehmatrix auf die in der ersten Messreihe gefundenen Positionen angewandt. Im letzten Schritt erfolgt eine Transformation der Systempositionen zurück auf die des aktuell verwendeten Verschiebetisches. Unter Berücksichtigung des im Allgemeinen nur wenige Grad kleinen Drehwinkels, kann die Drehmatrix in Potenzen, etwa nach der Methode von Taylor, entwickelt werden. Mit einem computergestützten Verfahren kann dies leicht berechnet werden. Ein weiterer Ansatz besteht darin, ganz auf die Reihenentwicklung zu verzichten und die Drehmatrixkomponenten tabellenbasiert zu bestimmen. Somit reduziert sich ein solcher Algorithmus auf einfache Additionen und Multiplikationen. Die genannten rechnerischen Operationen können leicht automatisiert werden.

4. Untersuchungen zur Langzeitstabilität des MFK gegenüber Anregungslicht

Damit ein System wie der MFK zur Relokalisation von Objekten sinnvoll eingesetzt werden kann, ist es wichtig, daß die fluoreszierende Struktur bis zum Abschluß der Analyse intakt bleibt, d.h. eine Ausbleichng genügend langsam erfolgt. Das Ausbleichverhalten wurde untersucht, indem eine Fläche mehrfach (bis zu 320 mal) nacheinander mit dem fokussierten Laserstrahl (sichtbarer Spektralbereich) eines konfokalen Laserscanning Fluoreszenzmikroskops zur Fluoreszenz angeregt und sofort die Fluoreszenzintensität pro Anregungsschritt gemessen wurde. Die zeigt den gemessenen Verlauf der Fluoreszenzintensität als Funktion von der Abtasthäufigkeit für zwei typische Anregungswellenlängen pro bestrahlter Fläche.

Ausführungsbeispiel 2:

Dieses entspricht Beispiel 1 mit folgenden Änderungen:

Es wurde eine einfachere Maskenstruktur gewählt, die nur aus einem Kreuz zweier 1000 &mgr;m langer und 3 &mgr;m dicker Linien in einer 2 × 2 mm großen Box besteht. Damit eine eindeutige Orientierung der Achsen möglich ist, befindet sich im ersten Quadrant ein 20 × 20 &mgr;m großes Quadrat sowie im vierten Quadranten ein Vollkreis mit 400 &mgr;m Durchmesser. zeigt den in diesem zweiten Ausführungsbeispiel realisierten MFK.

Ausführungsbeispiel 3:

Die dritte Ausführung entspricht dem ersten Ausführungsbeispiel, wobei hier ein kreisförmiges Deckglas (30 mm Durchmesser, 170 &mgr;m Dicke) mit der Struktur des ersten Ausführungsbeispieles versehen worden.

Diese Deckgläser kommen z.B. bei der konfokalen Laser Scanning 4Pi-Mikroskopie zum Einsatz und bieten nun erstmals die Möglichkeit, mit einem konfokalen Laserscanning Fluoreszenzmikroskop eine Vorauswahl der zu analysierenden Strukturen zu treffen und diese dann höchstauflösend mit einem kommerziellen 4Pi Mikroskop (Leica Microssystems Mannheim) innerhalb sehr kurzer Zeiten zu messen, ohne langwierig diese Bereiche suchen zu müssen. Ein wesentlicher Vorteil der schnellen Relokalisierung ist die Verminderung der Ausbleicheffekte aufgrund von Mehrphotonen-Absorption, wie sie bei dieser Form der Mikroskopie für die erhöhte optische axiale Auflösung erforderlich ist.

Ausführungsbeispiel 4:

Dies ist identisch zu den Beispielen 1 bis 3, jedoch ohne daß eine Deckschicht aus Glas (SiO2) aufgebracht wurde. Falls die Deckgläser bei der weiteren Benutzung nicht Alkoholen oder Lösungsmitteln ausgesetzt werden, ist dies eine sehr preiswerte und schnell zu fertigende Alternative zu den Ausführungsbeispielen 1 bis 3.

Ausführungsbeispiel 5:

Ausführungsbeispiel 5 ist identisch zu Ausführungsbeispielen 1-4, mit dem Unterschied, dass statt eines Glasdeckglases der Dicke 170 &mgr;m ein Deckglas mit einer anderen Dicke oder aus einem anderen Material, z.B. Quarz verwendet wird. Beispielsweise werden Quarzdeckgläser vorteilhaft bei der 4Pi Mikroskopie verwendet.

Ausführungsbeispiel 6:

Ausführungsbeispiel 6 ist identisch zu Ausführungsbeispielen 1-4, mit dem Unterschied, dass statt eines Deckglases ein Objektträger oder ein sonstiger Träger verwendet wird.

Das neue Herstellungsverfahren vereinigt alle Einsatzgebiete, die bisher mit anderen Relokalisierungsverfahren nach dem Stand der Technik schon möglich gewesen sind; darüber hinaus bietet jedoch folgende erfindungsgemäße Vorteile: Ökonomisch preiswerte Realisierung von Mikrofluoreszenzkoordinatoren (MFK); unmittelbare Einsatzmöglichkeit in der Fluoreszenzmikroskopie; schnelle und automatisierbare Relokalisation von zellulären Objekten bei Verwendung einer Vielfalt verschiedener Mikroskopsysteme.

IV. Anwendungsbeispiel für die Zellbiologie:

Die praktische Verwendbarkeit des MFK wurde unter anderem mit auf ihm aufgebrachten Lymphozyten getestet. Hierbei wurde untersucht, ob sich die Lackstruktur zusammen mit den Lymphozyten-Kernen abbilden läßt. Die zeigt eine Aufnahme mit einem konfokalen Laser Scanning Mikroskop (CLSM) von diesem Versuch. Der Abstand der Teilstriche beträgt 10 &mgr;m. Die fluoreszenzgefärbten Zellkerne der Lymphozyten sind deutlich erkennbar. Die Position relativ zum Koordinatensystem ist visuell mit einer Präzision von besser 5 &mgr;m bestimmbar. Mit bildanalytischen Verfahren ist die Positionierungspräzision noch wesentlich besser.

Die Fixierung der Zellen konnte sowohl mit PFA (= Paraformaldehyd) als auch mit Methanol-Eisessig durchgeführt werden.

V. Wirtschaftliche Nutzung:

Die hier beschriebene Erfindung stellt einen wirtschaftlich günstigen Weg dar zur raschen und präzisen, mikrometergenauen Relokalisation insbesonders fluoreszierender Objekte mit verschiedenen Mikroskopietechniken. Das Verfahren ist grundsätzlich für relativ hohe Stückzahlen bei geringen Stückkosten geeignet. Aufgrund der arbeitsintensiven Nutzung moderner hochauflösender Fluoreszenzmikroskopiesysteme (die Analyse einer einzelnen Zelle kann bis zu mehreren Minuten betragen) und der hohen Abschreibungskosten (ein konfoklaes Multiphotonen Laser Scanning Mikroskop z.B. hat einen Beschaffungswert von ca. 400,000 EUR, ein ein 4Pi-Mikroskop ca. 1 Mio. EUR.) ist die Beschleunigung der Lokalisierung außerordentlich wünschenswert. Verglichen mit diesen Kosten sind die Aufwendungen für die Herstellung von MFKs sehr gering.


Anspruch[de]
Verfahren zur Herstellung fluoreszierender Markierungen auf Mikroskopie-Deckgläsern und/oder Objektträgern zur Relokalisation mikroskopischer Objekte, dadurch gekennzeichnet, dass sich eine fluoreszierende, zur quantitativen Positionsangabe geeignete Struktur zusammen mit den zu untersuchenden Objekten auf dem zur Mikroskopie verwendeten Träger der Objekte befindet, wobei die zur Positionsangabe geeignete Struktur mithilfe eines optisch strukturierbaren, fluoreszenten Photoresist mit einem Maskenverfahren realisiert wird. Verfahren nach Anspruch 1 unter der Verwendung des Photoresist AZ1505 (Firma Microchemicals Ulm). Nach Verfahren nach Anspruch 1 und 2, das auf Basis eines lithographischen chemischen Strukturierungsprozesses einer Photoresist-Schicht beruht, die zuvor auf das Mikroskopie-Deckglas aufgebracht wurde. Wie Verfahren unter Anspruch 1 und 3, indem der Lack durch ein Druck- oder Stempelverfahren auf die Träger aufgebracht wird. Verfahren nach Anspruch 1, 3, 4 zum Aufbringen der Struktur auf eine Petri-Schale oder einen anderen nicht glasförmigen Träger Verfahren entsprechend 1 und 3, wobei eine SiO2-Schicht zur Passivierung und zum Schutz der Struktur anschließend aufgesputtert wird. Verfahren nach Anspruch 2 und 3 wobei für das Mikroskopiedeckglas aus Glas ein spezifisches Material aus Quarz für Anwendungen in der 4Pi-Mikroskopie verwendet wird.






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