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Dokumentenidentifikation DE60034315T2 03.01.2008
EP-Veröffentlichungsnummer 0001153299
Titel CHEMISCHES UND BIOCHEMISCHES NACHWEISVERFAHREN UND VORRICHTUNG
Anmelder TTP LabTech Ltd., Royston, Herts, GB
Erfinder CASSELLS, John, Huntingdon, Cambs PE17 2BQ, GB
Vertreter Witte, Weller & Partner, 70178 Stuttgart
DE-Aktenzeichen 60034315
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 16.02.2000
EP-Aktenzeichen 009038605
WO-Anmeldetag 16.02.2000
PCT-Aktenzeichen PCT/GB00/00549
WO-Veröffentlichungsnummer 2000049415
WO-Veröffentlichungsdatum 24.08.2000
EP-Offenlegungsdatum 14.11.2001
EP date of grant 11.04.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 03.01.2008
IPC-Hauptklasse G01N 33/58(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung chemischer und biochemischer Assays. Die Möglichkeit, Prozesse auf einem zellulären oder subzellulären Level zu charakterisieren, ist sowohl für die Wirkstoffentdeckung als auch für klinische Diagnosen wichtig. Eine Klasse kürzlich untersuchter Wechselwirkungen ist die Bindung eines biologischen Moleküls an ein anderes Molekül, an eine Zelle oder einen Teil einer Zelle. Dies kann bspw. die Bindung von Antikörpern an Antigene sein, von Hormonen an Rezeptoren, von Liganden an Zelloberflächenrezeptoren, von Enzymen an Substraten, von Nucleinsäuren an anderen Nucleinsäuren, von Nucleinsäuren an Proteine und von Viren an Zelloberflächen.

Eine andere Klasse von Wechselwirkungen, die für die Biologie der Zelle wichtig ist, ist die Diffusion oder der Transport von Molekülen oder Zellen über Membranen hinweg. Dies kann bspw. bei der Osmose auftreten, über spezielle Transportproteine oder durch Phagozytose.

Viele Krankheiten werden durch Binde- oder Transportprozesse charakterisiert. Bei der Heilmittelentdeckung ist es das Ziel, Mittel zur Verstärkung oder zur Blockierung des Prozesses zu identifizieren. Bei der klinischen Diagnostik ist es das Ziel, abnormale Funktionen dieser Prozesse zu detektieren; ferner das Vorliegen von abnormalem Nucleinsäurematerial; oder zur Identifizierung von Fremdkörpern (wie bspw. Viren oder Bakterien), um eine Krankheit zu diagnostizieren, so dass eine geeignete Behandlung verabreicht werden kann.

Mit der vorliegenden Erfindung soll ein schnelles und einfaches Assay bereitgestellt werden, um Binde- und Transportprozesse zu detektieren und quantifizieren, die bei der Heilmittelentdeckung und für klinische Diagnosen wichtig sind.

Für die Zwecke der folgenden Beschreibung soll „Rezeptor" jedes biologische Molekül, Zelle oder Struktur bedeuten, die ein anderes Molekül, Zelle oder Struktur bindet. Ähnlich soll „Ligand" jedes organische oder anorganische Molekül bedeuten, das an den „Rezeptor" bindet. In der Beschreibung und den Beispielen liegt der Schwerpunkt auf einem Assay mit einem markierten Liganden, der an einen Rezeptor bindet. Der beschriebene Stand der Technik und die Erfindung kann derart erweitert werden, dass die Wechselwirkung eines nicht-markierten Agonisten oder Antagonisten in einem Kompetitionsassay eingeschlossen ist, wie es für die Heilmittelentdeckung gewöhnlich eingesetzt wird.

Das grundliegende Prinzip einer reversiblen Bindereaktion wird durch die folgende Gleichung beschrieben: Dissoziationskonstante (Kd) = [L] × [R]/[L.R] in welcher [L] = die Konzentration des ungebundenen Liganden im Gleichgewicht, [R] = die Konzentration des ungebundenen Rezeptors im Gleichgewicht, und [L.R] = die Konzentration des gebundenen Liganden-/Rezeptorkomplex im Gleichgewicht ist.

Die Konzentration wird üblicherweise in Mol berechnet, und Kd steht für den Liganden; die Proteinwechselwirkung liegen typischerweise im Bereich 10-4 bis 10-5 M-1.

Das in der Heilmittelentdeckung und bei der Diagnostik klassischerweise verwendete Assay ist das Separations-Assay. Bei diesem Assay wird eine Komponente (bspw. der Ligand) gelöst oder in Lösung suspendiert. Die andere Komponente (bspw. der Rezeptor) kann auf einer Oberfläche, wie bspw. die Wände einer Vertiefung (Well) in einer Mikrotiterplatte, immobilisiert sein, oder kann auf der Oberfläche einer Zelle vorliegen. Eine oder beide Komponenten können eine Markierung tragen, wie bspw. einen fluoreszierenden oder radioaktiven Marker, der an diese angebracht ist, um die Messung mit einem Instrument zu unterstützen. Das Assay wird durch Hinzufügen der löslichen Komponente zu einer Vertiefung, die die immobilisierte Komponente enthält, und durch Ermöglichen der Bindung der Komponenten zur Erreichung eines Gleichgewichts durchgeführt. Mit herkömmlichen Detektoren, wie bspw. collorimetrischen, fluoreszierenden oder Radioaktivität-Plattenlesern ist es nicht möglich, die Menge des gebundenen markierten Liganden in Gegenwart von freiem markierten Liganden zu bestimmen. Das Problem wird dadurch gelöst, dass der freie Ligand von gebundenen Liganden durch Abkippen der Lösung, die den freien Liganden enthält, gelöst. Ein oder mehrere Waschschritte mit frischem Lösungsmittel können durchgeführt werden, um jeden Überschuss an freiem Liganden zu entfernen. Eine Messung der verbleibenden Markierung soll die Konzentration des gebundenen Komplexes in der ursprünglichen Lösung darstellen. Dieses Verfahren kann auch dann durchgeführt werden, wenn der Rezeptor auf einer Zelle vorliegt. Wenn die Zellen nicht in die Vertiefung anhaften, werden die Waschschritte über spezielle Filterplatten durchgeführt, die die Zellen zurückhalten, die jedoch das Waschlösungsmittel hindurchlaufen lassen.

Dieses Verfahren funktioniert dann gut, wenn die Dissoziationsrate des gebundenen Komplexes langsam ist, und wird tatsächlichen bei vielen Assays erfolgreich angewandt. Nichtsdestotrotz birgt dieses Assay-Verfahren bedeutende Nachteile, wenn es in einem breiteren Bereich angewandt wird.

Wenn die Dissoziationsrate schnell ist, werden einigen der gebundenen Markierungen zurück in die Waschlösung freigesetzt, was zu einem Fehler beim Auslesen führt. Die Effizienz des Waschens selber kann von einer Probe zur nächsten variieren, wodurch die Wiederholbarkeit des Assays reduziert wird. Es ist wünschenswert, die Waschschritte in automatisierten Systemen zu reduzieren oder zu eliminieren, um den Durchsatz zu erhöhen, die Komplexizität zu reduzieren und das Risiko einer Kreuz-Verunreinigung zwischen Proben zu eliminieren.

Einige nicht-Separations-Assayverfahren sind in den vergangenen Jahren entwickelt worden, um diese Probleme zu beseitigen, einschließlich des Scintillations-Proximitäts-Assays (SPA), der Fluoreszenzpolarisation (FP), der Fluoreszenzkorrelations-Spektroskopie (FCS) und der zeitaufgelösten Fluoreszenz (TRF). Nichtsdestotrotz bergen diese Techniken Nachteile, die deren Anwendbarkeit beschränken.

SPA beruht auf dem Energietransfer von einem radiomarkierten Liganden auf einen scintillierenden Bead, auf welchem der Rezeptor angebracht ist. Das Assay muss mit relativ hohen Konzentrationen durchgeführt werden, um ein hinreichendes Signal zu produzieren. Die Gesetzgebung bezüglich der Beseitigung des radioaktiven Materials und das Risiko der Aussetzung für die Durchführenden veranlasste viele Firmen, nach Alternativen zu suchen. SPA ist bei einigen Assays, bei denen ganze Zellen verwendet werden, nicht geeignet, und kann auch nicht dazu eingesetzt werden, Rezeptoren oder Proteine innerhalb von Zellen zu untersuchen. Dies bedeutet, dass ein funktioneller Rezeptor aus der Zelle isoliert werden muss, um das Assay durchzuführen, was kostenintensiv und schwierig ist, und in einigen Fällen überhaupt nicht erreicht werden kann.

Mit der FP-Technik wird die Masse eines fluoreszierenden Objekts ausgehend von seiner Rotationsgeschwindigkeit oder Translokationsgeschwindigkeit durch Diffusion berechnet. Die Probe wird durch einen Impuls von polarisiertem Licht beleuchtet, und die emittierte Fluoreszenz wird in der gleichen oder einer anderen Polarisationsebene gemessen. Wenn die Markierung an ein großes Objekt gebunden ist, wird die Rotation oder Translokation langsamer sein, und die Emission wird in der gleichen Polarisationsebene sein wie die Anregung für einige Zeit nach Beleuchtung. Wenn der freie Marker bedeutend kleiner ist als der gebundene Komplex, kann das Molekül sich schneller aus der Ebene des einfallenden polarisierten Lichts bewegen und in eine andere Ebene emittieren. Unter der Voraussetzung, dass der Fluorophor eine hinreichend lange Zerfallszeit besitzt, wird das Licht, das den Detektor erreicht, nach Anregung langsamer zerfallen, wenn eine hinreichend große Anzahl von Fluorophor-markierten Liganden in der Lösung an größere Moleküle gebunden ist.

Das Verfahren ist eher eine Korrelation als eine direkte Messung des gebundenen und freien Markers. Teilweise wird der freie Marke in der gleichen Ebene wie die der Anregung emittieren. Auch ist notwendig, dass der markierte Ligand viel kleiner ist als der Rezeptor, und dass die Zerfallszeit für den Fluorophor länger ist als die Rotationsgeschwindigkeit der Zielmoleküle. Diese Technik hat viele Nachteile: es ist schwierig, zwischen unspezifischer Bindung sowie verunreinigender Hintergrund-Fluoreszenz und spezifisch gebundenem markierten Ligand zu unterscheiden; sie kann nicht dazu eingesetzt werden, intrazelluläre Wechselwirkungen zu untersuchen; die Empfindlichkeit des Verfahrens wird dadurch reduziert, dass sie eher auf dem Zerfall des Signals basiert, als auf einer Peak-Fluoreszenz, und sie ist auf die Verwendung von bestimmten Fluorophoren begrenzt.

FCS ist ähnlich wie FP, mit der Ausnahme, dass mit FCS Beziehungen einzelner Moleküle untersucht werden. Mit dieser Technik wird die Größe eines fluoreszierenden Partikels oder Moleküls ausgehend von dessen Translokationsgeschwindigkeit durch einen fixierten Laserstrahl durch die Braun'sche Bewegung vorhergesagt. Um diese Technik durchzuführen, ist es wünschenswert, dass nur ein einzelnes Fluorophor-Molekül im Laserstrahl zu einem gegebenen Zeitpunkt vorliegt. Daher besteht eine praktische Grenze bezüglich darauf, wie eng der Laserstrahl sein kann (typischerweise im Bereich von wenigen Mikrometern im Durchmesser). Ferner ist es unpraktisch, eine extrem kurze Weglänge durch das Fluid zu haben. Aus diesen Gründen wird FCS gewöhnlich mit sehr niedrigen Konzentrationen des Markers durchgeführt. Diese Technik ist für verunreinigende Hintergrund-Fluoreszenz, die bei praktischen Assays typisch ist, sehr anfällig. Ferner ist sie vergleichsweise langsam, und es dauert bis zu einer halben Stunde kontinuierlicher Messungen, um die Bindung an große Moleküle zu detektieren.

Die FCS-Technik ist seit mehr als zwanzig Jahren bekannt. Die Schwierigkeit der Verwendung dieser Technik für praktische Assays hat bis vor kurzem ihrem Einsatz entegegengestanden. Einige der Nachteile dieser Technik sind: der fixierte FCS-Strahl untersucht lediglich eine Wechselwirkung zu einem gegebenen Zeitpunkt, der nicht für die gesamte Probe repräsentativ sein muss; es kann nicht direkt zwischen spezifischer und unspezifischer Bindung unterschieden werden; bei der Technik ist es notwendig, die Assays bei einer sehr niedrigen Konzentration durchzuführen, was weitere Probleme mit sich führen kann, wie bspw. der Verlust eines Signals durch eine unspezifische Bindung des Markers oder Rezeptors an die Gefäßwände, sowie ein niedriges Signal-Geräuschpegelverhältnis als Ergebnis einer niedrigen Signalstärke. Die Technik ist ferner gegenüber wärmeinduzierten Wirbelströmen empfindlich. Diese schwerwiegenden Einschränkungen könnten dadurch reduziert werden, dass eine etablierte Technik, die für die Untersuchung des Flusses in Flüssigkeiten eingesetzt wird, angewandt wird. Durch ein Scannen des Laserstrahls wäre es möglich, ein Schnappschuss der Lage einer Anzahl von fluoreszierenden Partikeln zu erhalten. Mit aufeinanderfolgenden Schnappschüssen könnte die Geschwindigkeit und die Richtung der Translokation dieser Partikel und daher deren Massen bestimmt werden. Jedoch würden immer noch viele der grundlegenden Beschränkungen der oben aufgeführten Techniken im Raum stehen.

TRF ist ähnlich wie SPA, wobei es auf dem Energietransfer von einem Molekül auf ein anderes in enger Nachbarschaft zueinander basiert. In diesem Fall wird die Energie von einem Fluorophor in enger Angrenzung zu einem anderen Fluorophor übertragen. Bei der Technik ist notwendig, dass sowohl der Rezeptor als auch der Ligand löslich sind, und dass ein Fluorophor sowohl auf dem Liganden als auch auf dem Rezeptor vorliegt. Dies ist daher bei Assays nicht geeignet, bei welchem kein löslicher Rezeptor gewonnen werden kann, und ferner kann darüber hinaus die chemische Modifizierung des Rezeptors durch die Hinzufügung eines Markers schwierig sein und kann zu einer Reduktion oder Eliminierung der Aktivität führen.

In den vergangenen Jahren ist eine Vielzahl von Instrumenten und Techniken für ein Screening von Zellen mit niedrigem Durchsatz eingeführt worden, die auf bildgebenden Techniken basieren, und zwar unter Verwendung von Mikroskopobjektiven und/oder CCD-Kameras. Charakteristisch hierfür sind Fluoreszenzmikroskope und CCD-Scansysteme. Bei diesen Systemen wird eine Lichtquelle eingesetzt, um eine durchsichtige Platte von unten zu beleuchten. Die Zellen wachsen auf dem Boden der Vertiefungen der Platten oder werden darauf aufgebracht, und ein fluorszierender Marker oder fluoreszierendes Reagens wird zu der Lösung über die Zellen hinzugefügt. Der Detektor fokussiert nur auf den Boden der Vertiefungen (auf den Zellrasen), um zu vermeiden, dass Signale aus der überschüssigen Lösung, die den freien Marker enthält, erhalten werden. Die Probe wird auf einem CCD-Array sichtbar gemacht, und der resultierende Rahmen bezüglich Helligkeit mittels Software analysiert. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um Fluoreszenz innerhalb oder die Bindung an Zellen oder Beads sichtbar zu machen, jedoch bestehen einige Nachteile, die dessen Verwendung für quantitative Assays begrenzen.

Ein CCD hat eine begrenzte Auflösung. Die größten CCDs, die heutzutage verfügbar sind, haben ca. 1 Million Pixel, jedoch haben die kostenintensiven Vorrichtungen, die bei wissenschaftlichen Instrumenten eingesetzt werden, bedeutend weniger Pixel. Daher gibt es einen Kompromiss zwischen Sichtfeld und Auflösung. Dies bedeutet, dass das Sichtfeld im besten Fall typischerweise lediglich 1 mm2 mit einer Auflösung von 4 &mgr;m ist. Damit können nur schlecht aufgelöste Bilder von ca. 100 Zellen gleichzeitig erhalten werden, was zur Gewinnung von statistisch signifikanten Ergebnissen bei einigen Assaytypen nicht ausreichend ist. Die Auflösung reicht nicht aus, um eine genaue Messung der Größe- und Formcharakteristika von Zellen oder Beads zu ermöglichen. Die Empfindlichkeit der CCDs ist wesentlich niedriger als die von PMTs, wodurch sie nicht hinreichend empfindlich genug sind, um mit ihnen quantitative Messungen bei niedrigen Lichtleveln durchzuführen (bspw. markierter Ligand gebunden an Zelloberflächenrezeptoren aus Zellen, mit niedriger Expression, vielleicht lediglich 5.000 Rezeptoren pro Zelle). Bei quantitativen Kompetitionsassays muss man in der Lage sein, die gebundene Fluoreszenz weit unter der Sättigung messen zu können, und bei CCD-bildgebenden Systemen fehlt diese Möglichkeit. Jedes Pixel aus dem CCD-Array hat eine unterschiedliche Empfindlichkeit, so dass die Messungen über den Scan nicht konsistent sind. Jeder Pixel kann lediglich eine Farbe zu einem gegebenen Zeitpunkt detektieren. Vielfarbenbilder können durch Verwendung eines Filterrads vor einem CCD-Array gewonnen werden, und es können viele verschiedene Rahmen mit unterschiedlichen Filtern gewonnen werden. Dies verlangsamt die Lesezeit, und wenn sich die Probe während der Messung bewegt (wie es freie Zellen und Beads sehr wahrscheinlich in Flüssigkeiten tun werden), geht die Spektral-Information verloren. Viele verschiedene CCD-Arrays können eingesetzt werden, um Bilder in vielen verschiedenen Farben zu sammeln, jedoch ist es nicht möglich, eine perfekte Pixel-Ausrichtung zwischen den Detektoren zu erreichen, oder eine echte simultane Multi-Wellenlängendetektion zu erreichen. CCD-Arrays zeigen keine einheitliche Empfindlichkeit über den sichtbaren Bereich hinweg. Bei einer Hintergrundzurückweisung bei niedrigen Signalleveln ist es wichtig, dass echte simultane Spektralmessungen durchgeführt werden.

Mit CCD-Arrays ist es nicht möglich, ein Gebiet wiederholt mit Geschwindigkeiten zu scannen, die schnell genug sind, Messungen von schnellen Übergängen oder Zeit-aufgelösten Fluoreszenztechniken durchzuführen (Nanosekunden bis Mikrosekunden Erfassungs-Geschwindigkeiten).

Einige Systeme, wie bspw. das „FLIPR" von Molecular Devices und FMATTM von Perkin Elmer scannen die Probe mit einem Laser. Bei diesen Systemen werden konfokale Optiken eingesetzt, um die Tiefe des Felds des Detektors bewusst zu begrenzen, wodurch das Hintergrundsignal des freien Markers minimiert wird. Dieses Signal wird nicht zur Messung von Konzentrationen des gebundenen gegenüber dem freien Marker eingesetzt. Darüber hinaus ist die Auflösung dieser Systeme zu schlecht, um eine genaue Messung der Form oder Größe von kleinen Beads oder Zellen zu ermöglichen.

Sämtliche bildgebende Systeme versuchen nicht, die Konzentration des freien Markers zu messen. Bei Assays, die in ein dynamisches Gleichgewicht resultieren, wie bspw. Rezeptor-/Liganden-Bindungsassays, ist es notwendig, eine Messung von sowohl von freien als auch dem gebundenen Liganden zu erhalten, um die Gleichgewichtskonstante oder verwandte Messungen, wie bspw. IC50 zu erhalten. Dies ist insbesondere bei praktischen Assays wichtig, bei welchen die Variabilität bei den flüssigen Handhabungsvorrichtungen und der Verdampfungseffekt bedeuten kann, dass die Konzentration des Liganden im Assay nicht mit der erwünschten Konzentration korrespondiert.

Zusätzlichen zu den beschriebenen Beschränkungen jede der Techniken bestehen allgemeine Nachteile bei all den Techniken für Anwendungen über den breiten Assaybereich hinweg. Mit der Entwicklung des Hochdurchsatz-Screenings ist es wichtig, dass so viele Assaytypen wie möglich mit einem einzigen System ausgeführt werden können. Bei jeder der zuvor genannten Techniken wird ein eigener Detektor benötigt. Hierfür werden oftmals ganze Screening-Teams benötigt, die unterschiedliche Detektoren in die automatisierten Systeme anschrauben müssen, wenn von einem Assaytyp zu einem anderen gewechselt wird. Dadurch wird noch mehr Zeit benötigt und dadurch müssen üblicherweise auch die automatisierten Maschinen reprogrammiert werden.

Die Fluoreszenz-Dektektion wird zum Verfahren der Wahl für die Heilmittelentdeckung, damit Empfindlichkeiten bereitgestellt werden, die nahe denjenigen von Assays mit radioaktiven Markierungen sind, jedoch ohne Gesundheitsrisiken und die Beseitigungsprobleme. Die vorliegende Erfindung bietet eine praktische Lösung für die oben beschriebenen Probleme.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Durchführung eines nicht-Separations-Assays bereitgestellt, zum Bestimmen des Ausmaßes der Bindung einer Komponente an eine andere, wie im nachfolgenden Anspruch 1 beansprucht.

Durch die Anwendung mathematischer Berechnungen auf die Signale, die von dem Detektor empfangen werden, können bestimmte Parameter bestimmt werden.

Das beleuchtende Licht kann durch einen Laserstrahl erzeugt werden. Das empfangene Licht kann ein Licht sein, das durch Fluoreszenz erzeugt wird, und mehr als eine Wellenlänge des Lichtes kann empfangen werden.

Die empfangene Intensität kann dazu eingesetzt werden, die Größe und/oder das Volumen jeder Zelle, Beads, Oberfläche oder jeder Vertiefung und die Anzahl der darin gebundenen Moleküle zu bestimmen.

Das beleuchtende Licht kann derart angeordnet werden, dass die Probe von oben oder von unten bestrahlt wird, wobei das emittierte Licht von oberhalb oder unterhalb der Probe in irgendeiner Kombination derart detektiert wird, dass das beleuchtende Licht sowohl die Stelle als auch ein bedeutendes Volumen der Lösung oberhalb oder angrenzend zu der Stelle beleuchtet wird.

Mit der vorliegenden Erfindung wird ferner eine Vorrichtung zur Durchführung eines nicht-Separations-Assays bereitgestellt, zur Bestimmung des Ausmaßes der Bindung einer ersten markierten Komponente in Lösung an eine zweite Komponente, wie im nachstehenden Anspruch 11 beansprucht.

Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass sie dazu eingesetzt werden kann, einen Referenzwert für die Lösung, in welcher die Beads, Zellen, Oberfläche oder Vertiefungen liegen, bereitgestellt wird, so dass die Konzentration jeder fluoreszierenden Komponente in der Lösung gemessen werden kann (freie Komponente) und die Anzahl der Moleküle jeder fluoreszierenden Komponente, die an den Bead, die Zelle, Oberfläche oder Vertiefungen (gebundene Komponente) gebunden ist, gemessen werden kann, und ein Ausgleich für jedes Signal von der freien Komponente geschaffen werden kann, das mit dem Signal von der gebundenen Komponente zusammenfällt, so dass ein genauer Wert für die Anzahl der an die Beads, Zelle, Oberfläche oder Vertiefung gebundenen Moleküle gemessen werden kann, und ferner, dass die Verhältnisse zwischen gebundenen und freien Signalen geschätzt werden kann, ohne dass es nötig wäre, die Komponenten zu trennen. Darüber hinaus ist es mit dem Verfahren und der Vorrichtung gemäß der Erfindung möglich, nicht nur das Ausmaß der Bindung, sondern auch die Fläche des Beads, der Zelle, der Oberfläche oder das Volumen jeder Vertiefung zu bestimmen, um genauere Ergebnisse sicherzustellen.

Die Lichtquelle kann die Lösung und die Stellen auf lineare Art und Weise scannen, wobei ein Scan den nächsten Scan überlappt, so dass eine kontinuierliche Messung der empfangenen Lichtintensität bereitgestellt werden kann. Die Daten, die sich auf die empfangene Lichtintensität beziehen, können durch Anwendung eines festgesetzten oder variablen Grenzwertes gefiltert werden, um die Datenmenge, die verarbeitet werden muss, zu reduzieren.

Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass es durch Einsatz des kontinuierlichen Scannens der Beads, Zellen, Oberflächen oder Vertiefungen und Lösungen möglich ist, die Lage der Beads, Zellen, Oberfläche oder Vertiefung genau zu bestimmen, und auch eine verlässliche Anzeige falscher Ergebnisse zu ermöglichen, die durch Verunreinigungen und Ähnlichem verursacht werden.

Noch ein weiterer anderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass der Meniskus der Probe gleichzeitig mit der Messung des gebundenen/freien Markers gemessen und in der mathematischen Analyse kompensiert werden kann.

Ein Beispiel der vorliegenden Erfindung wird nun mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert, in welchem:

1 eine schematische Zeichnung einer Vorrichtung ist, die zur Ausführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann;

2 eine schematische Darstellung ist, die den Scan-Vorgang der Vorrichtung aus 1 zeigt; und

3 eine schematische Seitenansicht des Verfahrens und der Vorrichtung der Erfindung ist, die auf zwei Assay-Stellen angewandt werden;

4 und 5 die grundlegenden theoretischen Elemente der Erfindung darstellen;

6 bis 14 Diagrammsets sind, die den Output einer Vorrichtung gemäß der Erfindung an verschiedenen Etappen während eines Verfahrens zeigen, mit welchen ein Assay durchgeführt wird; und

15 bis 21 ein Diagrammset zeigen, das sich auf ein drittes Beispielassay bezieht, mit welchem theoretische Hypothesen bereitgestellt werden.

Die US-A-5663057 beschreibt ein Verfahren zur schnellen Detektion von Mikroorganismen im Wasser. Letzte Verfahrensschritte dieses Verfahrens schließen das Scannen eines Lasers über eine Filtermembran mit ein, auf welchem Fluoreszenzmarkierte Bakterien zurückgehalten werden. Bei dem System wird eine Kombination aus Diskriminanten und Grenzwert-Algorithmen eingesetzt, um einzelne Zellen gegen den kontinuierlichen Hintergrund des freien Markers und der Hintergrund-Fluoreszenz zu selektieren. Die Linienamplitude, die für jede Zelle gewonnen wird, ist eine genaue Messung der Fluoreszenzintensität der Zelle und kann kalibriert werden, wodurch eine Messung der Menge des gebundenen Fluorophors erzielt wird. Aufgrund der Markierung der Bakterien liegt immer etwas freier Marker vor, jedoch ist dies für die bakterielle Detektion unerwünscht, und das Verfahren gemäß der US-A-5663057 versucht dies dadurch zu minimieren, dass der Marker soweit wie möglich innerhalb der Zellen zurückgehalten wird, und versucht die Flüssigkeit auf der Probe durch die Verwendung einer porösen Membran zu minimieren. Aus diesen Gründen gibt es gegenwärtig keine definierte und homogene Flüssigkeitsschicht, die für die Messung einer Konzentration eines Markers in Lösung geeignet wäre. Das System misst die durchschnittliche Hintergrund-Fluoreszenz. Diese Daten werden für Referenzzwecke gesammelt und nicht bei der Detektion von Mikroorganismen eingesetzt.

1 zeigt ein schematisches Diagramm einer Vorrichtung, die in der US-A-5663057 eingesetzt wird, die jedoch zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung angepasst ist, wobei diese Vorrichtung nachstehend detaillierter beschrieben werden wird.

Bezug nehmend auf 1 strahlt ein Laser 1 einen beleuchtenden Lichtstrahl 2 ab, der an einer Reihe von Spiegeln vorbeigeführt wird, sowie an einem Strahlerweiterer 3. Der beleuchtende Strahl 2 wird dann über die Scan-Spiegel 4 und eine Linse 5 weiter ausgerichtet. Die Scan-Spiegel 4 können gesteuert werden, um den Strahl 2 über die Oberfläche eines Filters 6 und einer Assayprobe 7 derart hinwegzuscannen, wie es nachstehend mit Bezug auf 2 beschrieben wird.

An der Strahlerweiterungsposition 3 kann ein Teleskop eingeführt werden, um den Spot mit unterschiedlichen Abständen zu der Scan-Linse 5 fokussieren zu können, oder aber um die Größe des Laserspots auf dem Ziel zu steuern.

Das Licht von der Assayprobe 7 wird durch den Filter 6, die Linse 7 und die Spiegel 4 zu einem oder mehrerer Lichtempfangeinheiten 8 zurückgeführt, welche in diesem Beispiel Fotovervielfacher sind. Die Signale, die durch den Fotovervielfacher 8 generiert werden, werden einer Analyse 9 zugeführt, welche Amplitikations- und Erfassungselektroniken 10 aufweist. Das amplifizierte und erfasste Signal wird anschließend an Datenverarbeitungsmittel 11 weitergeleitet, deren Arbeitsweise nachstehend beschrieben werden wird. Der Output der Verarbeitungsmittel 11 wird an eine Display-Vorrichtung 12 weitergeleitet, die ein einfacher Monitor oder ein Computer sein kann.

Bezug nehmend auf 2 ist ersichtlich, wie der Lichtstrahl 2 sequentiell über die Assayprobe 7 gescannt wird, so dass die gesamte Probenoberfläche bedeckt ist. Es ist bevorzugt, wenn der Scan-Vorgang derart durchgeführt wird, dass jeder benachbarte Scan den vorherigen Scan überlappt, wodurch sichergestellt ist, dass keine Merkmale ausgelassen werden. Die Verarbeitungsmittel 11 können derart ausgestaltet sein, dass sie die Überlappung kompensieren.

Die Prinzipien des Betriebs des Systems gemäß der Erfindung werden nun Bezug nehmend auf die 3 und 4 erläutert. 3 zeigt, wie Linienamplituden erhalten werden, wenn eine Probe gescannt wird. 4 zeigt die Prinzipien des Assays.

Beispiel 1

Zur erleichterten Darstellung eines einfachen Beispiels gemäß der Erfindung werden zunächst eine Anzahl von Hypothesen vorgenommen:

  • 1. Der Laserstrahl soll ein Volumen von nr2h beleuchten, wobei r der Radius des Strahls (in unserem Beispiel 3 &mgr;m) ist, und h die Tiefe der Flüssigkeit ist. Dies wird als Laserbeleuchtungsvolumen (N) bezeichnet.
  • 2. Die Fluorophor-Lösung ist verdünnt, es gibt ein minimales Quenching, und jedes Molekül des Fluorophor in dem Volumenelement strahlt mit der gleichen Intensität.
  • 3. Eine Zelle oder ein Bead besitzt ein sphärisches Volumen, und alle Fluorophor-Moleküle, die an diese Zelle oder das Volumen gebunden sind, besitzen eine ähnliche Fluoreszenz, wie sie in Lösung haben würden. Dies wird als Bead-Volumen (BV) bezeichnet.
  • 4. Jedes Bead oder jede Zelle soll jeweils eine lokale Konzentration eines Rezeptors repräsentieren, welche die Rezeptoranzahl geteilt durch das Bead-Volumen ist.
  • 5. Wo kein Bead oder keine Zelle im Volumenelement vorliegt („leeres Volumenelement") liest der Detektor die Fluoreszenzintensität nur aufgrund des freien Markers. Dieser Intensitätswert wird „leeres Volumenelementsignal" oder UVS bezeichnet. Wenn eine Zelle oder ein Bead in dem Laservolumenelement liegt (ein „gefülltes Volumenelement") wird das Intensitätssignal aus den additiven Intensitäten des Markers berechnet, der auf der Zelle oder dem Bead konzentriert ist, und dem Signal des freien Markers im Überschuss des Volumenelements über dem Bead oder der Zelle. Dieses Signal wird als „gefülltes Volumenelementsignal" oder PVS bezeichnet.

Während ein Fachmann diese Hypothesen als ungenau betrachten mag, haben wir in den Beispielen 3 sowie in den 15 bis 21 gezeigt, dass diese Hypothesen hinreichend sind, um das Verfahren mit einer hohen Korrelation zwischen beobachteten und erwarteten Werten durchzuführen.

Es ist klar, dass die Konzentration der fluoreszierenden Moleküle im Zellvolumen signifikant höher oder niedriger als das äquivalente Volumen der Lösung sein müsste, damit das System einen Unterschied detektieren kann: Signalverhältnis PVS/UVS = <1>

In den meisten Fällen, wurde auf PVS/UVS >1 abgezielt, um die Bindung eines Fluorophors an eine Zelle oder ein Bead zu zeigen. Die Helligkeit des Zellvolumens beruht vorrangig auf drei Faktoren: die Anzahl der Bindestellen (oder Rezeptoren) auf der Zelle oder dem Bead; der Kd der Assoziierung sowie der Konzentration des markierten Liganden in Lösung beim Gleichgewicht.

Es ist auch klar, dass die vorliegende Erfindung dazu eingesetzt werden kann, das Ausmaß der Bindung oder die Nähe eines Fluorophores an eine Oberfläche dort zu bestimmen, wo diese Oberfläche den Fluorophoren modifizieren kann, oder die Emission maskieren oder derart quenchen kann, dass das Licht-Output von Fluorophor reduziert oder lokal eliminiert wird. Beispiele schließen die Umwandlung einer fluoreszierenden Verbindung in eine nichtfluoreszierende Verbindung durch ein Enzym mit ein, einer Reduktion der Fluoreszenz aufgrund des Vorliegens eines quenchenden Stoffes auf einer Oberfläche, einem Bead oder Zelle; die Translokation eines Markers in eine Zelle und der Wechsel in den Spektrum-Charakteristika eines Fluorophores; die Beispiele sind jedoch nicht hierauf beschränkt.

Wenn die Konzentration des freien Fluorophors zu groß ist und/oder die Flüssigkeit zu tief ist, wird es nicht möglich sein, die markierte Zelle zu detektieren. Daher müssen bei praktischen Assays diese Parameter innerhalb der empfindlichen Grenzen erhalten werden. 5 zeigt vorhergesagte Werte für die PVS/UVS-Signalverhältnisse, die gegen Kd bezüglich der folgenden Konditionen geplottet sind: Bead: 6 &mgr;m Durchmesser, mit variierenden angezeigten Anzahlen von Bindestellen; Laserstrahl: 6 &mgr;m Durchmesser; Flüssigkeitstiefe: 100 &mgr;m; und eine Konzentration des markierten Liganden im Gleichgewicht von 1 nM.

Mit den oben gemachten Hypothesen ist es möglich, eine Berechnung für die Anzahl der Moleküle oder der Oberflächenkonzentration eines Liganden, der an jedes Bead oder jede Zelle gebunden ist, sowie für die Konzentration des freien Liganden abzugeben. In diesem Fall gilt: [frei] ∝ UVS [gebunden] ∝ PVS – (UVS.(IV-BV/IV) in welcher

Konzentration des freien Markers = [frei]

Konzentration des gebundenen Markers = [gebunden]

Dies stellt einen sehr vereinfachten Fall für beispielhafte Zwecke dar. In der Praxis ist es notwendig, eine Anzahl von Faktoren zu korrigieren, wie bspw. die Feldtiefe, die Flüssigkeitstiefe, der Meniskus der Flüssigkeit, die Laserverzögerung, das Quenchen etc. Korrektionsverfahren für dieses Modell, um die Genauigkeit der Messung zu verbessern, werden in späteren Beispielen vorgestellt.

Ein praktisches Beispiel der Erfindung wird nun beschrieben.

Beispiel 2

Ein einfaches Beispiel einer Ausführungsform gemäß der Erfindung ist in 6 gezeigt. Eine 5 &mgr;l Probe einer Lösung mit 48 nM Fluoresceinisothiocyanatmarkiertem Biotin (FITC-Biotin) wird zu 5 &mgr;l einer Pufferlösung hinzugefügt, die ein einzelnes Bead mit 2,8 &mgr;m Durchmessern enthält, welches mit Streptavidin beschichtet ist (erhalten von Dynal). Die Probe wurde dem Instrument zum Scannen zugeführt, und zwar als ein 10 &mgr;l Tröpfchen auf der Oberfläche eines Glas-Objektträgers. Die Beleuchtung und die Lichtsammlung wurde von oberhalb der Probe angeordnet. Das Instrument wurde derart eingerichtet, dass es Fluoreszenz-Intensitätsmessungen mit 1 &mgr;m Intervallen über die Probe in x-Richtung mit einem Linie-zu-Linie-Schritt von 2,2 &mgr;m in die y-Richtung durchführte. Als Laserspotgröße wurde 6 &mgr;mm gewählt, was die Überlappung zwischen jeder Scan-Linie ermöglichte. Die Histogramme geben die relative Intensität (analog-in-digital-Umwandler oder ADC-Zahler) gegen die Position (Probennummer) bezüglich mehrerer benachbarter Scan-Linien wieder. Anfänglich hatte das FITC-Biotin nicht genügend Zeit, um zu den Streptavidin-Stellen, die auf dem Bead konzentriert waren, zu diffundieren. Die Probe wurde über die Dauer des Experiments mit Intervallen gescannt. Es ist leicht ersichtlich, dass das von der Beleuchtung erhaltene Signal proportional zu der Anzahl der Markermoleküle (FITC-Biotin) im Weg des Lasers zu jedem gegebenen Punkt sein wird. Wenn, wie in diesem Fall, der Marker durch das Tröpfchen hindurch homogen verteilt ist, dann ist das Signal an jedem Punkt proportional zur Weglänge des Lasers durch die Probe. Das obere Diagramm zeigt klar, dass jede Scan-Linie einen Durchschnitt durch das Tröpfchen darstellt, und dass der Meniskus des Tröpfchens in diesem Fall, wie erwartet, halbkugelförmig ist.

Wenn die Konzentration des Markers bekannt ist, ist es offensichtlich, dass das Volumen und die Form einer Probe (in diesem Falle ein Tröpfchen) durch Berechnungen geschätzt werden kann. Daraus folgt, dass, wenn das Volumen oder die Höhe einer Lösung bekannt ist, dass es nach Kalibrierung der Vorrichtung mit bekannten Lösungen möglich ist, die Berechnung des freien Markers aus den gewonnenen Intensitätssignalen zu berechnen.

Über die Zeit diffundiert das FITC-Biotin zu dem Bead und wird schrittweise auf der Oberfläche des Beads (untere Plots) konzentriert. Bei diesem Experiment war nach 30 Minuten ein Gleichgewicht erreicht. Es ist ersichtlich, dass das Signal auf dem Bead signifikant höher ist als das eines äquivalenten Volumens an Lösung, und dass das Signal von diesem Bead zu dem Signal der Lösung hinzugefügt wird (PVS/UVS = ungefähr 6,1 im Gleichgewicht).

Grenzwertsetzung und Datenreduktion

In Beispiel 2 wurde eine Messung vorgenommen und die Daten zu jedem Punkt in der Probe gespeichert. Der Chemscan®RDI, der für diese Anwendung modifiziert wurde, besitzt drei Detektorkanäle, und mit ihm können im Überschuss 600 Millionen Ablesungen in einem einzigen Scan mit 400 mm2 erreicht werden. Es ist wünschenswert, die Menge an Daten, die an den Computer zur Endanalyse weitergegeben wird, zu reduzieren, um die Analyse zu beschleunigen und um die Menge der Daten, die für die Archivierung gespeichert werden muss, zu vermindern. Dies kann durch die Anwendung eines Grenzwert-Algorithmus auf die Rohdaten erreicht werden. Die Erfindung setzt dabei zwei Typen an Grenzwert-Algorithmen ein. Bei der „Frequenz-Tabelle"-Grenzwertsetzung wird jede Messung in eine Tabelle von Intensitätswerten gesetzt. Wenn eine einzelne Messung die durchschnittliche Intensität sämtlicher Messungen, die bis zu diesem Punkt genommen wurden, mit einem vorbestimmten Prozentsatz überschreitet (bspw. 20 %) dann wird die Messung an den Computer weitergeleitet. Alle Messungen, die diesen Grenzwert nicht überschreiten, werden verworfen. Bei der „dynamischen Grenzwertsetzung" berechnet das System einen sich bewegenden Durchschnitt des Signals und behält diejenigen Messungen zurück, die mit einem vorbestimmten Prozentsatz überhalb des sich bewegenden Durchschnitts befinden. Es ist auch möglich, eine dynamische Grenzwertsetzung durchzuführen, indem der Verlauf der Signalantwort kontinuierlich gemessen und der Start und das Ende eines Ereignisses angestoßen wird, wenn der Verlauf oder die Rate des Wechsels des Verlaufs größer oder kleiner ist als ein vorbestimmter Wert oder ein gesetzter Prozentsatz des Durchschnitts.

Frequenztabellen-Grenzsetzung funktioniert dann gut, wenn es wenig helle Objekte in der Probe gibt, und der Hintergrund niedrig ist. Die dynamische Grenzwertsetzung besitzt den Vorteil, dass mit ihr Signale isoliert und aufgezeichnet werden können, die auf einzelne Stellen in Gegenwart von bedeutenden Konzentrationen des freien Markers.

Die Rohdaten für ein oder mehrere der Linien wird über einen kurzen Zeitraum durch das System während des Scannens zurückbehalten. Dies bedeutet, dass, wenn ein Objekt wie bspw. ein Bead oder eine Zelle durch die Grenzwertsetzung detektiert wird, die Messproben sofort vor und nach dem Objekt zurückgehalten werden können, zusammen mit dem Rest der Messproben für das Objekt vor Zurückweisung des Rests der Hintergrunddaten. Diese werden als Prä- und Post-Proben bezeichnet.

In 7 ist eine typische Scan-Karte fluoreszierender Partikel gezeigt, die in einer flüssigen Probe mit einem Chemscan®RDI-Instrument des Typs gemessen wurden, der in der US-A-5663059 gezeigt ist, wobei gleichzeitig ein dynamischer Grenzwert verläuft. Die Scan-Karte auf der linken Seite zeigt sämtliche gefundenen fluoreszierenden Partikel; die Scan-Karte auf der rechten Seite zeigt diejenigen Partikel, die auf die Charakteristika passen, die bezüglich der Beads fortgesetzt wurden, die mit Fluoreszenz markiert sind, und zwar in einem Assay, das gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde.

Berechnung der Größe und des Volumens des Beads oder der Zelle

8 zeigt die Linienamplituden eines typischen markierten Beads. Beads und Zellen, die in vielen Fällen kugelförmig sind, führen zu Linienamplitude-Plots („Z"), die „Halbsinuskurven" in X und Y sind. Diese Plots stellen keine exakten Repliken der Beads oder Zellen dar. Dies ist lediglich eine Näherung. So besitzt bspw. der Prototyp eine Strahlenergie, die gemäß der Gauß'schen Verteilung verläuft. Ein Beads ist kugelförmig. Deshalb ist eine Korrigierung hinsichtlich der weiteren Breite der Beads eine Kombination aus einer Gauß'schen Verteilung und einer Sinuskurvenfunktion. Die Erfassungsrate ist höher als die Scanrate, weshalb bspw. Proben jeweils in einem Intervall von 1 &mgr;mm gezogen werden (Scannen bei 2 ms-1 und Abfragen bei 2 MHz), jedoch ist die Laserspotgröße größer (6 &mgr;mm Durchmesser). Dies bedeutet, dass der wahre Durchmesser eines Beads oder einer Zelle ungefähr der Breite des Plots minus zweimal des Durchmessers des Laserspots entsprechen wird. Beads mit einer bekannten Größe werden dazu eingesetzt, das Instrument zu kalibrieren.

Messung von freier und gebundener Fluoreszenz

Wenn ein Bead oder eine Zelle kleiner oder gleich groß ist wie der Durchmesser des Laserspots, dann sollte die Peak-Intensität auf dem Plot der Linienamplitude direkt proportional zur Menge des Fluorophor sein, der an dem Bead oder die Zelle gebunden ist, und zu dem Volumen der Fluorophor-Lösung oberhalb dessen. Dies kann als die PVS genommen werden. Bei Beads oder Zellen, die größer als der Laserspot sind, wird der Wert der Peak-Intensität durch einen Wert unter-lesen, der proportional zum Durchmesser der Zelle oder des Beads ist, wofür jedoch kompensiert werden kann. Der Bereich unterhalb des 3-D-Plots kann auch dazu eingesetzt werden, die PVS mit einer anderen Kalibrierung darzustellen.

Die UVS kann aus den Prä- und Post-Proben gewonnen werden, die vor und nach einem durch einen Grenzwert-Algorithmus detektiertem Bead oder Zelle gezogen wurden.

Auf diese Weise ist es möglich, Auslesungen sowohl für den gebundenen als auch den freien Marker zu erhalten, ohne sämtliche gesammelten Rohdaten zu speichern. Bezüglich des Signals von freien Marker, der zu dem gebundenen Marker hinzugefügt wird, kann eine Korrektur vorgenommen werden, indem ein korrespondierender Abschnitt des UVS bis zu 100 % abgezogen wird. Alternativ wird mit dem dynamischen Grenzwert automatisch eine Grundlinie für den Beitrag des freien Markers zur PVS bereitgestellt, und der gebundene Marker kann als die Höhe oder das Gebiet des Peaks oberhalb dieses Grenzwerts genommen werden. Es ist ersichtlich, dass der Wert für die Peak-Intensität für das gefüllte Volumenelement aus dem Maxima dieses Plots gewonnen werden kann, und dass die Intensität des freien Volumenelements von den Prä- und Post-Proben der Ränder des Plots erhalten werden kann.

Das freie Volumenelementsignal kann auch von dem durchschnittlichen Hintergrundgrenzwert erhalten werden, der durch das System aufgezeichnet wird, oder als das niedrigste Signal, das irgendwo im Scan gewonnen wird.

Statistische Abfrage und Analyse

Einzelne Beads oder Zellen können in Schlüsselparametern wie bspw. Größe, Anzahl der Bindestellen oder Rezeptor-Expression enorm variieren. Aus diesen Gründen ist es zu vermeiden, sich auf die Messung von Signalen aus lediglich einer handvoll Beads oder Zellen zu verlassen, wenn quantitative Daten gesammelt werden. Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung kann eine signifikante Anzahl an Beads oder Zellen verwendet werden (typischerweise 100-1000 in einer Probe). Die Schlüsselparameter, wie bspw. Peak- oder Durchschnitts-Intensitäten aller Beads oder Zellen, werden individuell abgespeichert, diese Daten werden anschließend als eine Population verarbeitet. Jeder Bead oder jede Zelle ist effektiv ein separates Assay, und die Daten, die für die Population erhalten werden, stellen typischerweise eine Gauß'sche Verteilung dar (siehe 9).

Die Erfindung setzt Populationsstatiken ein, um genaue Daten für eine darauffolgende mathematische Analyse bereitzustellen. Die Werte für die Peak-Intensität oder Gebietsintensität der Zielstelle sowie die Intensität des benachbarten freien Markers wird hinsichtlich jeder Stelle in der Probe aufgezeichnet. Diese Daten werden dann als Frequenzhistogramm geplottet. Auf die Populationsdaten wird eine Gauß'sche Verteilung angewandt, und der Mittelwert wird berechnet. Das gleiche Verfahren der Gauß'schen Anpassung wird auf Frequenzhistogramme für andere größere Diskriminanten, wie bspw. die Größe, Form und Spektral-Charakteristika angewandt. 10 zeigt ein Frequenzhistogramm hinsichtlich der Peak-Intensität einer Bead-Population mit einer Intensität, die nahe dem Hintergrundgeräusch-Grenzwert-Cutt-Off ist. Hier ist ersichtlich, dass die Anpassung dieser Daten auf eine Gauß'sche Verteilung zu einer genauen Darstellung der Population führt, wohingegen ein Durchschnitt diejenigen Ergebnisse ignorieren würde, die unterhalb des detektierbaren Grenzwertes liegen. 11 zeigt die Korrelation zwischen Histogrammen bezüglich unterschiedlicher Messungen der gleichen Population. 12 zeigt ein typisches Histogramm der „Gauß'schen Form", die eine Population kontaminierender Partikel unterscheidet. Man beachte, dass die Population der kontaminierenden Partikel selber nicht über eine Gauß'sche Form verteilt ist.

Korrektur der Meniskuseffekte der Flüssigkeit

Der Meniskus der Flüssigkeit kann bei der Durchführung der Assays ein Problem darstellen. Es ist wünschenswert, eine festgesetzte Weglänge durch die Flüssigkeit zu haben (einheitliche Tiefe), um genaue und reproduzierbare Messungen sowohl innerhalb einer Vertiefung als auch von einer Vertiefung zum nächsten zu erhalten, wenn die Probe von oben gescannt wird. Der Meniskus fungiert auch als eine Linse, was möglicherweise dazu führt, dass Abschnitte der Probe außerhalb des Fokus liegen. Leider kann es extrem schwer sein, den Meniskus in den kleinen Volumen, die für das Arzneimittel-Screening gefordert werden (< 1 &mgr;l), zu kontrollieren, da sowohl ein konvexer als auch ein konkaver Meniskus in der gleichen Vertiefung vorliegen kann. 6 zeigt die Möglichkeit der Vorrichtung, den Meniskus einer flüssigen Probe zu plotten. Diese Probe war in Tropfen auf einen flachen Objektträger. Das System wurde auch dazu verwendet, die Meniski von Proben in Mikrovertiefungen zu plotten, und zwar während von oben oder von unten gescannt wurde. Die Konzentration des freien Markers ist über das Volumen der Probe im Wesentlichen konstant, und die UVS kann dazu eingesetzt werden, den Meniskus zu plotten, wodurch eine mathematische Anpassung auf die Daten übertragen werden kann, um dessen Auswirkungen zu korrigieren. Die Daten können durch Plotten der UVS von den Signalen, die von den durch die dynamische Grenzwertsetzung detektierten Stellen erhalten wurden, weitestgehend reduziert werden. Auf diese Weise würden eintausend Stellen (bspw. Zellen) für mehrere tausend UVS Auslegungen sorgen, was es ermöglicht, dass der Meniskus in hinreichender Weise korrigiert wird, wenn auch bei einer niedrigeren Auflösung. Das PVS/UVS-Verhältnis kann durch die Messung der Peak-Intensität (für PVS) und des Durchschnitts der Prä- und Post-Proben (für UVS) für jede Stelle bestimmt werden.

Kalibrierung

Das von dem Detektor erhaltene Signal ist nicht immer direkt proportional zum Laserdurchmesser- und zur Flüssigkeitstiefe. So ist bspw. Folgendes denkbar:

  • 1. Der Laserspot fokussiert vorzugsweise auf den Boden der Vertiefung. Je nach optischem Set-up kann die Tiefe des Fokusses sich mit dem Spotdurchmesser ändern. Mit dem experimentellen System erreichte eine Laserspotgröße von 6 &mgr;m Durchmesser eine ± 26 &mgr;m Fokustiefe. Eine Erhöhung dieses Wertes auf 10 &mgr;m ergab eine ± 74 &mgr;m Fokustiefe. Wenn die Flüssigkeitstiefe größer ist als die Fokustiefe, wird ein Abschnitt des Laservolumenelements außerhalb des Fokusses liegen.
  • 2. Der Winkel der Lichtsammlung wird beschränkt sein, wobei die Lichtsammlung von Markermolekülen in der Flüssigkeit, die dem Detektor am nächsten liegen, effizienter sein wird als diejenige, die weiter weg liegen.
  • 3. Die Refraktion des abgestrahlten Lichts bei Zwischenflächen, insbesondere Flüssigkeit/Luft, wird die Effizienz der Lichtsammlung von Markermolekülen in der Flüssigkeit reduzieren.
  • 4. Moleküle im Weg des Lasers können die Erregung oder Ausstrahlung derart verzögern, dass das erhaltene Signal eine nichtlineare Beziehung zu der Konzentration für eine vorgegebene Weglänge besitzt.
  • 5. Der Detektor kann über Abschnitte seines Bereiches nichtlinear sein.

Diese Probleme können durch die Kalibrierung des Systems mit Beads mit bekanntem Fluorophorgehalt und Größenverteilung in Lösungen mit bekannten Tiefen und Fluorophor-Konzentration korrigiert werden. Die erhaltenen Werte können in einer Software-Nachschlagtabelle eingesetzt werden, oder können dazu eingesetzt werden, Algorithmen abzuleiten, um das grundlegende mathematische Modell, das in Beispiel 1 beschrieben ist, zu korrigieren. Unter Verwendung dieser Algorithmen ist es dann möglich, Folgendes genau zu bestimmen:

Die Tiefe eines Fluids mit bekannter Fluorophor-Konzentration; die Fluorophor-Konzentration eines Fluids mit bekannter Tiefe; die Menge eines Fluorophores, das mit einem Objekt innerhalb einer Fluorophor-Lösung gebunden oder mit diesem assoziiert ist.

Der Laserspot wird auf den Grund der Platte, wo die Beads oder die Zellen platziert sind, fokussiert. Magnetische Beads können eingesetzt werden, so dass ein Magnet die Beads in die Fokusebene des Lasers zieht. Der Großteil der Lösung selber liegt nicht innerhalb der Fokustiefe, wird jedoch durch einen Lichtkegel erleuchtet.

Jedoch besitzt das Nadelloch des Detektors ein Gebiet, das bedeutend größer ist als die Spotgröße, und die Emission von diesem Kegel wird gesammelt. Daher wird ein Fluoreszenzsignal erhalten, das ähnlich zu demjenigen ist, das gewonnen werden würde, wenn der Strahl tatsächlich kollimiert wäre. Dadurch erreicht man eine nahezu lineare Beziehung zwischen der Flüssigkeitstiefe und dem Signal, und zwar für jede vorgegebene Fluorophor-Konzentration, sogar unterhalb der Fokustiefe des Lasers. 13 zeigt die Kalibrierung der Vorrichtung mit Fluorescein-Losungen fixierter Tiefe und bekannter Konzentration. 14 zeigt eine Kalibrierung der Vorrichtung mit Beads mit bekanntem Fluoresceingehalt (Sigma Chemical Co.) und bekannter Größe innerhalb einer Flüssigkeit mit bekannter Tiefe.

Anwendung von Diskriminanten

In Beispiel 2 ist die Kd der Liganden-/Rezeptorassoziierung sehr niedrig und die Konzentration der Rezeptoren an der Stelle ist relativ hoch. Bei diesem Modell-Experiment würden wir keine signifikante Beeinflussung einer Hintergrund-Kontaminierung erwarten. Bei praktischen Assays, insbesondere bei der Heilmittelentdeckung, ist es üblich, einen schwächeren Kd-Wert zu haben, und niedrigere Konzentrationen an Rezeptoren. Eine Kd von 10-9 ist typisch, wobei vielleicht 50.000-100.000 Rezeptoren auf einer Zelle, oder wenige 100.000 Rezeptoren auf den Beads vorliegen. Es ist auch wünschenswert, niedrige Konzentrationen des markierten Liganden zu verwenden, um Kosten zu reduzieren, oder um eine Sättigung der Rezeptoren zu vermeiden. Dies führt zu niedrigeren Signalen aus den Assays. Eine als Hintergrund auftretende natürlich vorkommende Auto-Fluoreszenz von Komponenten des Assays, insbesondere der Zellkulturkomponenten und Partikeln auf der Stammflüssigkeit des markierten Liganden, kann eine Helligkeit besitzen, die gleich ist oder größer als die zu untersuchenden Stellen. Praktische Experimente haben gezeigt, dass in einem echten Assay bis zu 60.000 kontaminierende Objekte in 1 &mgr;l vorliegen können, mit einer Helligkeit die ähnlich zu derjenigen der markierten Stelle ist.

Die Reinigung der biologischen Proben zur Reduzierung der Hintergrundsverunreinigung ist teuer und führt oftmals zu einer reduzierten Aktivität. Es ist wünschenswert, Assays mit einem Minimum an Komponentenreinigung durchführen zu können.

Bei der vorliegenden Erfindung wurden die Linie-zu-Linie-Korrelation, die Größendiskrimination, das Kriterium der Gauß'schen Form, der Farbunterscheidung und andere Diskriminanten eingesetzt, die in der US-A-5663057 beschrieben wurden, um die Signale von verunreinigten Objekten auszuschließen. Diese Diskriminanten wurden dazu entwickelt, um Bakterien positiv zu identifizieren und aufzuzählen, die viel heller markiert sind als der Hintergrund, und welche daher nicht immer passend sind für den Ausschluss einer Hintergrundverunreinigung in biochemischen Assays, bei welchen der Zielanalyt manchmal heller ist als die Kontamination. Daher wurden zu der Technik neue Diskriminanten hinzugefügt, um die vorliegende Erfindung durchzuführen:

Das Hintergrundrauschen, das nahe dem Empfindlichkeitslimit des Instrumentes liegt, zeigt oftmals eine Gauß'sche Form, die ähnlich der des Ziels im primären Kanal ist. Bei Signalen mit niedriger Intensität setzt die Erfindung eine Korrelation zwischen den Detektoren ein. Die Zielobjekte geben Signale, die in mehr als einem der Detektionskanäle eine Gauß'sche Form aufweisen, wohingegen Hintergrundgeräusche, wie bspw. elektrische Geräusche, dies nicht tun.

Eine bakterielle Detektion zielt auf eine Detektion eines seltenen Ereignisses ab. Die relative Intensität jedes Ereignisses ist nicht wichtig, vorausgesetzt es liegt über einem Grenzwert. Bei der vorliegenden Erfindung ist ein Intensitätswert sowohl für den gebundenen als auch für den freien Marker notwendig.

Dieses Beispiel wird zeigen, wie das Verfahren gemäß der Erfindung eingesetzt werden kann, eine Dissoziationskonstante für ein Assay zu berechnen, das auf Beads basiert und das Ausmaß der kompetitiven Inhibierung dieser Assoziation durch eine aktive Verbindung zu messen. 4 zeigt die Messprinzipien.

Magnetische Beads, beschichtet mit den Rezeptoren, werden hergestellt. Die Anzahl der Rezeptoren auf den Beads wird durch deren Inkubation in einer Lösung an markierten Liganden geschätzt. Die Liganden-Konzentration wird so ausgewählt, dass sie überhalb der erwarteten Kd für die Assoziierung liegt. Die Menge des gebundenen Liganden wird dadurch gemessen, dass die Beads mit einem Magneten in den Fokuspunkt des Instruments gezogen werden und dass die Suspension gemessen wird. Ein dynamischer Grenzwert-Algorithmus wird eingesetzt, um lediglich diejenigen Objekte zu detektieren, die signifikant heller als der Hintergrund sind. Ein Set an Diskriminanten für die halbe Breite, die Größe, die Spektral-Verhältnisse, die Gauß'sche Form etc. wird auf die Rohdaten angewandt, und lediglich diejenigen Objekte, die auf die Charakteristika der Beads passen, werden angezeigt.

Die Histogramme aller Messungen auf den Beads werden geplottet und hinsichtlich einer Gauß'schen Verteilung in jedem Parameter überprüft, um zu bestätigen, dass das System tatsächlich die Beads von den kontaminierenden Partikeln im Hintergrund unterschieden hat. Das Signal, das auf den freien Liganden zurückzuführen ist, kann im Anschluss an das Signal von den Beads gemessen werden. Alternativ kann der Grenzwert-Algorithmus derart gesetzt werden, dass der Hintergrund auf Null gesetzt wird, und dass lediglich Peaks überhalb dieses Hintergrunds gemessen werden. Auf diese Weise kann das Signal, das auf den freien Marker zurückzuführen ist, von dem Gesamtsignal abgezogen werden, wodurch lediglich das Signal der Beads erzielt wird.

Die Peak- oder Durchschnittsintensität aller Objekte, die als Beads bestätigt werden, wird in einem Frequenzhistogramm geplottet. Auf dieses Histogramm wird eine Gauß'sche Anpassung gesetzt, und der Intensitätswert im Zentrum dieser Verteilung wird als typischer Wert der Population genommen. Die Anzahl der Fluorophor-Moleküle (und daher der Rezeptoren), die mit den Beads assoziiert sind, wird dann durch ein Vergleich des Fluoreszenzwertes gemessen, welcher mit einer Kalibrierungskurve erhalten wurde, der von Beads mit einem bekannten Fluorophor-Gehalt gewonnen wurde.

Die Kd der Assoziation kann durch eine Wiederholung des Assays mit einer Konzentration des markierten Liganden unterhalb der erwarteten Kd geschätzt werden. Eine Messung des gebundenen markierten Liganden wird beim Gleichgewicht für die Mitte der Verteilung der Peak-Intensitätswerte erhalten. Die Konzentration des freien Liganden im Gleichgewicht wird erhalten vom Signal der Lösung in unmittelbare Nachbarschaft zu den Beads. Das Volumen der Beads kann geschätzt werden, und eine mathematische Korrektur auf die Halbbreite angewandt werden, welche für die Beads ermittelt wurde.

Das Volumen der Beads und die durchschnittliche Anzahl der Rezeptor-Moleküle pro Beads sind nun bekannt. Dies kann als lokale Konzentration dargestellt werden.

Das Volumen des freien Markers, der durch den Laser beleuchtet wird, und die Konzentration dieses Volumens im Gleichgewicht ist nun ebenfalls bekannt.

Eine Messung der Dissoziationskonstanten für die Assoziation kann nun durch Anwendung eines mathematischen Modells, wie nachstehend beschrieben, berechnet werden:

Vereinfachtes mathematisches Modell

Bezug nehmend auf 4 ist die Kd eines reversiblen Rezeptors: die Liganden-Wechselwirkung kann dadurch geschätzt werden, dass angenommen wird, dass die Zelle oder der Bead eine lokale Rezeptor-Konzentration darstellt, in welche die Rezeptor-Moleküle durch das Volumen der Zelle oder des Beads hindurch als gleichmäßig verteilt, betrachtet werden. Dies wird die Bead-Rezeptorkonzentration genannt (BR). Diese Arbeitshypothese funktioniert gut in der Praxis hinsichtlich der Bead- und Zellgrößen sowie hinsichtlich der assoziierten Rezeptoranzahlen, die in den praktischen Assays verwendet worden. Daher gilt:

BV
= Beadvolumen
NRB
= Durchschnittliche Anzahl der Rezeptoren pro Bead
BR
= NRB/(BV × Avogadro'sche Zahl)

Die Konzentration des freien Liganden wird als Liganden-Konzentration der Flüssigkeitsmasse angenommen, und als im Wesentlichen konstant (keine merkliche Depletion des freien Liganden). Um eine Schätzung der Kd gegenüber PVS/UVS zu erhalten, nehmen wir an:

NLB
= vorhergesagte Anzahl an markierten Liganden-Molekülen auf jedem Bead
(L)
= Konzentration der Menge des freien Liganden
IV
= Beleuchtungsvolumen des Laserstrahls
NLB – [L] × NRB × BV × Avogadro'sche Zahl/(Kd + [L])

Die Anzahl der Liganden-Moleküle im UVS = [L] × IV × Avogadro'sche Zahl PVS = {(IV – BV) × [L] × Avogadro'sche Zahl} + NLB

Daher kann mit diesem Modell die Kd gegenüber PVS/UVS vorhergesagt werden, wie in 4 geplottet. Ist dieser Plot einmal gewonnen, kann die Kd einer Assoziierung ausgehend von einer einzelnen Messung des PVS/UVS-Signals erhalten werden, welches über einen breiten Bereich von Konzentrationen des freien Liganden gewonnen wurde, und kann daher auf verschiedene Assays angewandt werden, bei welchen der gebundene oder der freie Marker variiert. Dieses mathematische Modell zeigte eine gute Korrelation mit experimentellen Ergebnissen von PVS/UVS in Beispiel 3.

Die Technik gestattet es der Kd durch eine einzelne Messung zu messen, ohne Serienverdünnungen testen zu müssen, jedoch können auch Serienverdünnungen eingesetzt werden, um die Genauigkeit der Messung zu verbessern. Es versteht sich, dass die Kd für einen Rezeptor auf einer Oberfläche von derjenigen in Lösung variieren kann, jedoch werden die meisten Rezeptoren auf oder in Zellmembranen gefunden. Mit dieser Technik werden Mittel bereitgestellt, mit welchen die Kd für Biomoleküle in deren natürlicher Umgebung geschätzt werden kann.

Die Berechnung kann auf ein mathematisches Modell reduziert werden, das in die Software des Instruments eingebettet ist. Das Instrument bestimmt automatisch die Signale der mittleren Peak-Intensität für die Beads oder Zellen, für die Anzahl der Beads oder Zellen, für deren echte Dimensionen und das Signal aufgrund der freien Fluoreszenz. Diese Werte werden auf das mathematische Modell angewandt, um eine Messung der Kd in Echtzeit direkt zu bestimmen. Das Instrument kann ferner das statistische Konfidenzintervall in der Genauigkeit des Ergebnisses bestimmen.

Die kompetitive Inhibition durch eine aktive Verbindung (bspw. ein mögliches Arzneimittel) kann ausgehend von der Änderung in den Verhältnissen der gebundenen gegenüber den freien Signalen gemessen werden, welches beobachtet wird, wenn die Verbindung zu einem Modell-Assay hinzugefügt wird. Es ist möglich, IC50 auf diese Weise zu messen, und ferner die Kd der Verbindung zu bestimmen.

Nachweismessungen

Ein spezifisch gemessenes Beispiel, auf welches als Beispiel 3 Bezug genommen wird, wurde durch geführt, um die oben gemachten theoretischen Hypothesen zu bestätigen, was im Folgenden nun Bezug nehmend auf die 15 bis 21 beschrieben werden wird.

In diesem Beispiel waren die Reagenzien Polystyrol-Mikrokügelchen, beschichtet mit Ziegen-Antimaus-Antikörper, 5,5 &mgr;m im Durchmesser, Bindekapazität 1,48 &mgr;g Maus IgG/mg Beads, 1,045 × 109 Beads/ml in Borpuffer (100 mM, pH 8,5, mit 0,1 % Rinderserumalbumin, 0,05 % Tween, 10 mM EDTA und 0,1 % Natriumazid), gelagert bei 4 °C, bezogen von Bang's Laboratories, Inc., 9025 Technology Drive, Fishers, IN 46038-2866, USA.

Maus IgG, K (MOP-21), Fluoresceinisothiocyanat(FITC)-Konjugat, Immunglobulin-Konzentration 200 &mgr;g/ml, Proteinkonzentration 200 &mgr;g/ml, Fluorescein/Protein-Molverhältnis 5,8 in Phosphat-gepufferter Saline (0,01 M, pH 7,4, mit 1 % Rinderserumalbumin und 15 mM Natriumazid). Spezifität (Immunelektrophoresie): einzelner Bogen der Fällung gegenüber einem Antimaus-Gesamtserum, Antimaus IgGI und Antimaus IgG K (vor der Konjugation). Spezifität (Ouchterlony Doppeldiffusion): einzelner Bogen der Fällung mit AntimausIgGi, keine Reaktion mit Antimaus IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM oder IgA (vor der Konjugation). Erhalten von Sigma, 3050 Spruce Street, Saint Louis, Missouri 63103, USA.

Dulbecco's Phosphat-gepufferte Saline (10 mM, pH 7,4, mit 120 mM Natriumchlorid, ohne Calcium oder Magnesium).

Erhalten von Life Technologies Ltd., P.O. Box 35, 3 Fountain Drive, Inchinnan Business Park Paisly, PA4 9RF, UK.

Quantum-Fluoreszenz-Beads mit 450.000 Molekülen eines äquivalenten löslichen Fluorochroms (450.000 MESF), 7-10 &mgr;m Durchmesser, ungefähr 2 × 106 Beads/ml in Phosphatpuffer mit oberflächenaktiven Stoffen und 0,1 % Natriumazid (Information aus der technischen Produktanleitung). Erhalten von Sigma.

Fluoresceinisothiocyanat (FITC) Isomer 1, ungefähr 98 % rein (HPLC-Analyse). Erhalten von Sigma.

Die erste Notwendigkeit zum Nachweis der Assay-Hypothesen ist es, nachzuweisen, dass das Verhältnis zwischen Fluoreszenz und Fluorophor-Konzentration bei einer festgesetzten Weglänge und zwischen der Fluoreszenz und der Weglänge bei einer fixierten Fluorophor-Konzentration linear ist.

Die zwei biochemischen Parameter, die für den Nachweis benötigt werden, sind die Kd der Binde-Wechselwirkung und die maximale Anzahl der verfügbaren Bindestellen auf dem Bead. Dies kann beides in einem einzelnen Bead-Titrations-Experiment gemessen werden.

Die Kd ist die Offensichtliche bei den zwei Messungen, und ist zu der Konzentration eines fluoreszierenden Liganden äquivalent, was in der Hälfte der maximalen Bead-Fluoreszenz resultiert, nachdem die mittlere Bead-Intensität der Peakhöhe hinsichtlich der Intensität der darüber liegenden Ligandenlösung korrigiert wurde.

Die maximale Anzahl der verfügbaren Stellen auf einem Bead kann dadurch gefunden werden, dass die aggregierte Fluoreszenz des freien Liganden (das Assay sollte unter Bedingungen durchgeführt werden, die keine Lösungsdepletion verursachen) bei einer fixierten Weglänge und PMT-Gewinn gegen die Liganden-Konzentration geplottet wird. Nach Plotten der Fluoreszenz gegen die Liganden-Konzentration, kann die Konzentration des Liganden, dessen Lösungs-Fluoreszenz gleich ist mit derjenigen der korrigierten mittleren Peak-Bead-Intensität, genommen werden. Dieser Wert und der Wert der Weglänge werden in eine geeignete Rechensoftware eingespeist, und anschließend wird die effektive Anzahl der fluoreszierenden Liganden-Moleküle im Laserweg berechnet. Die effektive Anzahl der Stellen pro Bead ist gleich mit dieser Anzahl. Es ist wichtig, dass die Antwort der Lösungsfluoreszenz gegenüber der Weglänge für diese Berechnung linear ist.

Es sollte bemerkt werden, dass, obwohl der Weg des Laserlichts konisch sein wird, unser Modell vorhergesagt hat, dass die effektive Anzahl der Fluorophor-Moleküle innerhalb dieses Kegels durch die Hypothese gemessen werden kann, dass das beleuchtete Volumen das eines Zylinders ist, mit einem Durchmesser gleich dem Laserspotdurchmeser.

Es ist wichtig, den Wert der Bead-Intensität für die Fluoreszenz der darüber liegenden Fluorophor-Losung zu korrigieren, da die verwendeten Beads durchsichtig sind, wodurch das Laserlicht jeden darüber liegenden Fluorophor anregen kann. Das Kollektionsnadelloch für das fluoreszierende Licht weist einen Durchmesser von 2 mm auf; daher wird das meiste der Lösungsfluoreszenz nicht durch den Bead hindurch geführt werden müssen, um erfasst zu werden. Dies wurde experimentell nachgewiesen, indem die Fluoreszenz von 450.000 MESF-Beads in unterchiedlichen Konzentrationen der Fluorescein-Lösung (in PBS, Nullprobe, 0,25 &mgr;M, 0,5 &mgr;M und 1,0 &mgr;M) mit einer festgesetzten Tiefe (20 &mgr;m) gemessen wurden. Ein Plot der unkorrigierten Bead-Fluoreszenz gegenüber der Fluorescein-Konzentration ergab eine gerade Linie, wenn 100 % der Lösungsfluoreszenz abgezogen wurde, alle der Beads besaßen eine ähnliche Intensität (17).

Das Verhältnis der mittleren korrigierten Bead-Fluoreszenz gegenüber der Lösungsfluoreszenz kann nun gegen die gebundenen bis freien Auslesungen geplottet werden, welche durch Software unter Verwendung der Input-Werte von Kd, der verfügbaren Rezeptorstellen, der Weglänge und der Fluorophor-Konzentration vorhergesagt wurden. Wenn das Modell genau ist und die Kd und die Werte für verfügbare Rezeptorstellen genau sind, sollte die Kurve der gemessenen gebundenen bis freien gegenüber der vorhergesagten gebundenen bis freien Fluoreszenz eine gerade Linie mit einer Neigung von 1 sein.

Die experimentelle Bestätigung der linearen Beziehung zwischen Fluoreszenz- und Fluorophor-Konzentration wurde dadurch erreicht, dass die Fluoreszenz mehrere Fluorescein-Lösungen in Dulbecco's PBS mit Konzentrationen zwischen 0,1 &mgr;M und 1 &mgr;M mit einem festgesetzten Fotovervielfacher-Gewinn bei einer fixierten Weglänge (500 &mgr;m) gemessen wurde. Die Weglänge wurde dadurch festgesetzt, dass eine zweckgerichtete Durchziehvorrichtung in die Fluorescein-Lösung eingebracht wurde, welche mittels Noniusschub auf die erwünschte Tiefe gesetzt wurde. Die Lösungen wurde auf der oben beschriebenen Vorrichtung gescannt, welche auf einen Fluoreszenz-Aggregat-Modus eingestellt war (Grenzwertsetzung effektiv abgeschaltet, um Daten aus der freien Lösung sammeln zu können), wobei die abgelesene Fluoreszenz die mittlere Fluoreszenz war, geschätzt aus dem Scan-Profil. Ein Plot der Fluoreszenz gegen die Fluorescein-Konzentration erzielte eine gerade Linie (15). Die Bestätigung der linearen Beziehung zwischen Fluoreszenz und Weglänge bei der Konzentration, die bei einem fixierten PMT-Zugewinn eingesetzt wurde, wurde auf ähnliche Art und Weise erzielt, unter Verwendung einer 1 &mgr;M-Fluorescein-Lösung und durch Variieren der Tiefe der Durchziehvorrichtung, welche durch Noniusschub eingestellt wurde. Ein Plot der Fluoreszenz gegen die Weglänge erzielte eine gerade Linie (16).

Lösungen von MOPC-21-FITC-Konjugaten mit Konzentrationen von 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1,0 &mgr;M wurden in Dulbecco's PBS vorbereitet. Ziege-Antimaus-Beads wurden durch Vortexen resuspendiert und wurden auf Konzentrationen mit 2.500 Beads/&mgr;l mit Dulbecco's PBS verdünnt. Diese verdünnte Bead-Suspension wurde anschließend zu jeder der MOPC-21-FITC-Lösungen hinzugefügt (2 &mgr;l Beads plus 100 &mgr;l Lösung ergaben eine Endkonzentration von 50 Beads/&mgr;l), wobei eine PBS-Blindprobe mit eingeschlossen war. Nach dem Mischen wurden die Reaktionsgefäße 3 Stunden lang im Dunkeln und bei Raumtemperatur inkubiert, sowie gelegentlich gemischt.

Die Bead-Suspensionen (jeweils 50 &mgr;l) wurden anschließend von unten in einer Mikrotitterplatte mit durchsichtigen Grund in dem wie oben beschriebenen Gerät gescannt, wobei die Probentiefe bei 200 &mgr;m fixiert war.

Die Grenzwert-Algorithmen wurden derart eingestellt, dass jedes einzelne Bead ausgewählt wurde, und die Daten wurden hinsichtlich der Peak-Intensität und der halben Breite gesammelt. Der Wert für die Lösungsfluoreszenz (UVS) wurde durch Abschalten des Grenzwertes und durch Scannen eines gröberen Profils erhalten. Der Wert für die Lösungsfluoreszenz wurde als die Mittellinie des gezeigten Profils genommen. Die unkorrigierte mittlere Bead-Intensität der Peak-Höhenfluoreszenz (PVS) für jede Lösungskonzentration wurde aus dem Screen der Scan-Ergebnisse erhalten, zusammen mit dem Regelabweichungswert und der Anzahl der betrachteten Ergebnisse. Um das Signal isolieren zu können, das nur auf den Bead zurückzuführen ist, wurde die Lösungsfluoreszenz von dem Fluoreszenzwert der mittleren Bead-Peak-Intensität für jeden Datenpunkt abgezogen. Die korrigierte Bead-Fluoreszenz wurde anschließend gegen MOPC-21-FITC-Konzentration geplottet (18). Aus diesem Plot war es offensichtlich, dass eine Bindung eines zweiten Liganden aufzutreten begann, und zwar überhalb der Liganden-Konzentration von 100 nM (18), die möglicherweise auf eine Antikörper-Antikörper-Selbstbindung zurückzuführen ist. Daher wurde beschlossen, die Titrationskurve auf 100 nM zu plotten (19) und die Kd der Interaktion zu berechnen, sowie die Anzahl der verfügbaren Rezeptoren pro Bead aus dieser Kurve, wie oben beschrieben, nach Plotten der Lösungs-Fluoreszenz gegen MOPC-21-FITC-Konzentration (20). Die experimentellen Ergebnisse bezüglich gebunden gegenüber frei wurden gegen die vorhergesagten Werte geplottet (21).

Die Kd der Bindereaktion erwies sich als 1,2 nMol/l und die maximale Anzahl der verfügbaren Bindestellen-Bead betrug 245.000. Der Plot des experimentellen Verhältnisses gebunden gegenüber frei gegen das vorhergesagte PVS/UVS-Verhältnis war linear mit einer Neigung von 1,86. Die Linearität bei diesem Nachweis ist wichtiger als die Neigung, da angenommen wurde, dass die Laserspotgröße 6 &mgr;m ist, und jede Variation in diesem Wert wird die vorhergesagten B/F-Werte auf lineare Art und Weise beeinflussen.

Dieses Beispiel beweist, dass die Vorrichtung gemäß der Erfindung dazu eingesetzt werden kann, der Kd einer Assoziierung zu messen und zu schätzen; ferner die Größe und das Volumen eines Beads oder einer Zelle; die Anzahl der Bindestellen auf einem Bead oder einer Zelle; die Konzentration des freien Markers und die Belegungsrate der Bindestellen während eines Assays. Darüber hinaus kann das System, sobald es einmal kalibriert ist, sowie das Verfahren gemäß der Erfindung dazu eingesetzt werden, die Kd einer reversiblen Binde-Wechselwirkung in einer einzelnen Vertiefung zu schätzen, ohne die Notwendigkeit von Reihenverdünnungen oder von Abtrennungen, und zwar durch Einsatz eines einfachen mathematischen Modells auf die gewonnenen Messungen.

Diese fundamentale Prinzip kann auf die Messung von komplexeren Wechselwirkungen angewandt werden, die mehrere Dissoziationskonstanten beinhalten, und kann ferner dazu eingesetzt werden, den Kd-Wert einer kompetitierenden Verbindung zu berechnen.


Anspruch[de]
Verfahren zur Durchführung eines nicht-Separations-Assays zum Bestimmen des Ausmaßes der Bindung einer Komponente an eine andere, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:

Bereitstellen einer ersten markierten Komponente in einer Lösung;

Bereitstellen eines Arrays an Beads, Zellen, Oberflächen oder Vertiefungen und Anbringen einer zweiten Komponente auf den Beads oder Oberflächen oder in die Zellen oder Vertiefungen;

Eintauchen des Arrays in die Lösung;

Scannen des Arrays mit einem leuchtenden Lichtstrahl derart, dass das Licht durch die Lösung hindurchstrahlt, wobei die Beads, Zellen, Oberflächen oder Vertiefungen ausgeleuchtet werden;

Bestimmen einer Lichtintensität, die von jedem der Beads, Zellen, Oberflächen oder Vertiefungen empfangen wird, bei zumindest einer Wellenlänge während der Beleuchtung;

Bestimmen einer Bindungsmenge der ersten markierten Komponente an die zweiten Komponente, und zwar ausgehend von einem Höchstwert für die Intensität des empfangenen Lichts, einer Fläche unterhalb einer Messkurve der Spitzenintensität oder der Fläche unterhalb einer 3-D-Intensitätsmesskurve einer Lokation der zweiten Komponente;

Bestimmen einer Menge der ersten markierten Komponente in der Lösung, und zwar ausgehend von Prä- und Post-Intensitätswerten der zweiten Komponente, dem niedrigsten Signal, welches während des Scannens des Arrays erhalten wurde, oder einem durchschnittlichen Hintergrundwert, der während des Scannens erhalten wurde;

Bestimmen eines Verhältnisses zwischen i) einer Bindungsmenge der ersten markierten Komponente an die zweite Komponente und ii) der Menge der ersten markierten Komponente in der Lösung.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem der leuchtende Lichtstrahl durch einen Laserstrahl erzeugt wird. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in welchem das empfangene Licht ein Licht ist, das durch Fluoreszenz erzeugt wird. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welchem mehr als eine Licht-Wellenlänge empfangen wird. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welchem die empfangene Intensität dazu eingesetzt wird, um i) zumindest einen Durchmesser oder ein Volumen jedes Beads, Zelle oder Vertiefung zu bestimmen, oder um ii) einen Durchmesser einer Oberfläche, und eine Anzahl von an einen Bead, eine Zelle, Oberfläche oder Vertiefung gebundenen Molekülen zu bestimmen. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welchem das beleuchtende Licht derart angebracht wird, um eine Probe von oberhalb oder unterhalb zu beleuchten, wobei ein emittierendes Licht von oberhalb oder unterhalb der Probe in irgendeiner Kombination derart detektiert wird, dass das beleuchtende Licht sowohl den Bead, die Zelle, Oberfläche oder Vertiefung als auch ein signifikantes Volumen der Lösung oberhalb oder in der Nähe des Beads, der Zelle, der Oberfläche oder der Vertiefung beleuchtet. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welchem der beleuchtende Lichtstrahl die Lösung und die Beads, Zellen, Oberflächen oder Vertiefungen auf lineare Art und Weise scannt, wobei ein Scan den nächsten überlappt, so dass eine kontinuierliche Messung der empfangenen Lichtintensität vorgesehen werden kann. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welchem die mit der empfangenen Lichtintensität in Bezug stehenden Daten durch Einsatz eines fixierten oder variablen Grenzwertes gefiltert werden, um eine Datenmenge, die verarbeitet werden muss, zu reduzieren. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, welches ferner die Schritte der Verwendung eines Grenzwertes umfasst, um Beads, Zellen, Oberflächen oder Vertiefungen mit assoziierten Bindestellen von einem Hintergrundsignal der freien Markierung derart zu isolieren, dass Proben des Prä- und Post-Grenzwertsignals als Messung der freien Markierung, die angrenzend zu jedem Bead, Zelle, Oberfläche oder Vertiefung ist, verwendet werden können, und Korrigieren der Effekte eines Flüssigkeitsmeniskus. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, in welchem ein Fingerprint oder Diskriminanten eingesetzt werden, um eine Gesamtheit an Beads, Zellen, Oberflächen oder Vertiefungen, welche assoziierte Bindestellen haben, aus einem Hintergrund kontaminierender Partikel herauszusuchen, und zwar bevor die Bindungsmenge und die Menge der ersten markierten Komponente in der Lösung, die mit den Bindestellen assoziiert ist, bestimmt wird. Vorrichtung zur Durchführung eines nicht-Separations-Assays zum Bestimmen eines Bindungsausmaßes einer ersten markierten Komponente in einer Lösung an eine zweiten Komponente auf einem Array mit Bindungsstellen, wobei die Vorrichtung Folgendes aufweist:

Mittel zum Scannen (4, 5, 6) des Arrays mit einem beleuchtenden Lichtstrahl (2), und zwar derart, dass das Licht durch die Lösung hindurchstrahlt, wobei die Beads, Zellen, Oberflächen oder Vertiefungen beleuchtet werden;

Mittel (8, 9, 10) zum Bestimmen einer Lichtintensität, die von den Beads, Zellen, Oberflächen oder Vertiefungen und der Lösung bei zumindest einer Wellenlänge während der Beleuchtung empfangen wird;

Mittel zum Empfangen der Lichtintensität;

Mittel (11) zum Bestimmen einer Bindungsmenge einer ersten markierten Komponente an die zweite Komponente, ausgehend von dem Peak-Intensität-Wert des empfangenen Lichts, einer Fläche unterhalb des Plots der Peakintensität oder der Fläche unterhalb eines 3-D-Intensitätsplots einer Lokation einer zweiten Komponente;

Mittel zum Bestimmen einer Menge der ersten markierten Komponente in der Lösung, und zwar ausgehend von Prä- und Post-Intensitätswerten der zweiten Komponente des niedrigsten Intensitätssignals, welches während des Scans des Arrays erhalten wird, oder eines durchschnittlichen Hintergrundwerts, welcher während des Scans erhalten wird; und

Mittel zum Bestimmen des Verhältnisses zwischen i) einer Bindungsmenge der ersten markierten Komponente an die zweite Komponente und ii) der Menge der ersten markierten Komponente in der Lösung.
Vorrichtung nach Anspruch 11, bei welcher die Mittel zum Scannen einen Laserstrahl mit einschließen. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 12, bei welcher mehr als eine Lichtwellenlänge empfangen wird. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, bei welcher die Mittel zum Bestimmen die empfangene Intensität dazu einsetzen, um i) zumindest den Durchmesser oder das Volumen jedes Beads, jeder Zelle oder Vertiefung zu messen, oder um ii) einen Durchmesser einer Oberfläche und eine Anzahl von an den Bead, die Zelle, Oberfläche oder Vertiefung gebundenen Molekülen zu bestimmen. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 14, bei welcher das beleuchtende Licht derart angebracht ist, dass eine Probe von oben oder unten beleuchtet wird, wobei das emittierende Licht von oberhalb oder unterhalb der Probe in jeder Kombination derart detektiert wird, dass das beleuchtende Licht sowohl den Bead, die Zelle, Oberfläche oder Vertiefung und ein signifikantes Volumen der Lösung oberhalb oder in der Nähe zu dem Bead, der Zelle, Oberfläche oder Vertiefung beleuchtet. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 15, bei welcher der beleuchtende Lichtstrahl die Lösung und die Beads, Zellen, Oberflächen oder Vertiefungen auf lineare Art und Weise scannt, wobei ein Scan den nächsten überlappt, so dass eine kontinuierliche Messung der empfangenen Lichtintensität vorgesehen werden kann. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 16, bei welcher die mit der empfangenen Lichtintensität verbundenen Daten dadurch gefiltert werden, dass die Mittel zum Bestimmen mit einem fixierten oder variablen Grenzwert eingesetzt werden, um die Datenmenge, die prozessiert werden muss, zu reduzieren. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 17, bei welcher das empfangene Licht durch ein Nadelloch gesammelt wird, welches derart fixiert oder angepasst werden kann, dass es ermöglicht wird, einen wesentlichen Anteil der Fluoreszenz aus der freien Markierung zu detektieren. Verfahren nach Anspruch 10, in welchem eine Gauss-Kurve bezüglich der Gesamtheit erstellt wird, und ein Mittelwert davon verwendet wird, um die Bindungsmenge und die Menge der ersten markierten Komponente in der Lösung zu messen. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und 19, in welchem die Kompensierung der Bindungsmenge – für einen Effekt einer ersten markierten Komponente in Lösung um einen Bead, eine Zelle, eine Oberfläche oder Vertiefung herum – dadurch bereitgestellt wird, indem die empfangene Intensität der ersten markierten Komponente in Lösung von der empfangenen Intensität der ersten markierten Komponente gebunden an den Bead, die Zelle, Oberfläche oder Vertiefung abgezogen wird. Verfahren nach Anspruch 2, in welchem das Array ein Array an Beads ist, und ein Bead in dem Array ein magnetischer Bead ist, und ein Magnet bereitgestellt wird, so dass der Magnet den Bead in eine Fokalebene zieht. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 18, welche ferner Mittel zur Kompensierung der gemessenen Bindungsmenge aufweist – für einen Effekt der ersten markierten Komponente in Lösung um einen Bead, eine Zelle, Vertiefung oder Oberfläche herum – indem die empfangene Intensität der ersten markierten Komponente in Lösung von der empfangenen Intensität der ersten markierten Komponente gebunden an den Bead, die Zelle, Oberfläche oder Vertiefung abgezogen wird. Vorrichtung nach Anspruch 12, bei welcher das Array ein Array an Beads ist, und ein Bead in dem Array ein magnetischer Bead ist, und ein Magnet bereitgestellt wird, so dass er den Bead in eine Fokalebene des Laserstrahls zieht. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 und 19 bis 21, in welchem eine Anzahl von Beads oder Zellen im Array bestimmt wird. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 18, 22 und 23, welche ferner Mittel zum Bestimmen einer Anzahl von Beads oder Zellen in dem Array aufweist. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, 19 bis 21 und 24, in welchem die Dissoziationskonstante (Kd) der Bindung ausgehend vom Verhältnis der Bindungsmenge zur Menge der ersten markierten Komponente in der Lösung gemessen wird. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 18, 22, 23 und 25, welche ferner Mittel zum Bestimmen einer Dissoziationskonstanten der Bindung aufweist, ausgehend vom Verhältnis der Bindungsmenge zur Menge der ersten markierten Komponente in Lösung. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, 19 bis 21, 24 und 26, in welchem die mit der empfangenen Lichtintensität in Verbindung stehenden Daten dadurch gefiltert werden, dass ein fixierter oder variabler Grenzwert eingesetzt wird, um einen oder mehrere Beads, Zellen, Oberflächen oder Vertiefungen zu detektieren. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 18, 22, 23, 25 und 27, bei welchem die Daten, die mit der empfangenen Lichtintensität in Verbindung stehen, dadurch gefiltert werden, dass ein fixierter oder variabler Grenzwert eingesetzt wird, um einen oder mehrere Beads, Zellen, Oberflächen oder Vertiefungen zu detektieren. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, 19 bis 21, 24, 26 und 28, in welchem eine kompetitive Inhibierung durch eine dem Assay hinzugefügte aktive Verbindung bestimmt wird, und zwar ausgehend von einer Änderung im Verhältnis zwischen i) der Bindungsmenge der ersten markierten Komponente an die zweite Komponente und ii) der Menge der ersten markierten Komponente in Lösung, wenn die Verbindung hinzugefügt wird. Verfahren nach Anspruch 30, in welchem eine Dissoziationskonstante der dem Assay hinzugefügten aktiven Verbindung ausgehend von der gemessenen kompetitiven Inhibierung bestimmt wird. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 18, 22, 23, 25, 27 und 29, bei welcher die kompetitive Inhibierung durch eine dem Assay hinzugefügte aktive Verbindung bestimmt wird, und zwar ausgehend von einer Änderung im Verhältnis zwischen i) der Bindungsmenge der ersten markierten Komponente an die zweite Komponente, und ii) der Menge der ersten markierten Komponente in Lösung, wenn die Verbindung hinzugefügt wird. Vorrichtung nach Anspruch 32, bei welcher eine Dissoziationskonstante der dem Assay hinzugefügten aktiven Verbindung ausgehend von der gemessenen kompetitiven Inhibierung, bestimmt wird.






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