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Dokumentenidentifikation DE60034525T2 03.01.2008
EP-Veröffentlichungsnummer 0001096258
Titel Bestimmung von Proteinen wie Immunglobuline E (IgE) in Nasensekreten
Anmelder Bloch-Michel, Etienne, Paris, FR;
Luca, Helène de, Quimper, FR
Erfinder Bloch-Michel, Etienne, 75007 Paris, FR;
De Luca, Helène, 29000 Quimper, FR
Vertreter Dehmel & Bettenhausen Patent- und Rechtsanwälte, 80331 München
DE-Aktenzeichen 60034525
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument FR
EP-Anmeldetag 30.10.2000
EP-Aktenzeichen 004030102
EP-Offenlegungsdatum 02.05.2001
EP date of grant 25.04.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 03.01.2008
IPC-Hauptklasse G01N 33/68(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Fachgebiete Medizin, Biologie und Biochemie. Ihre Anwendungen betreffen Bereiche der Human- und Veterinärmedizin. Ganz besonders beschreibt die Erfindung neue Verfahren, welche die Feststellung des Vorhandenseins und/oder die Ermittlung der Menge an Proteinen oder Glycoproteinen mittels quantitativer Bestimmung in den Nasensekreten erlauben. Spezifischer beschreibt die Erfindung Verfahren, die besonders für die quantitative Bestimmung des Vorhandenseins von Immunglobulinen, insbesondere von Typ E Immunglobulinen (IgE), in Nasensekreten zweckdienlich sind. Die vorliegende Erfindung beschreibt ebenfalls Materialien und Kits für die Durchführung dieser Verfahren, sowie ihre Anwendungen, zum Beispiel bei der Erkennung oder Charakterisierung des allergischen Potenzials von Personen.

Die Durchführung einer quantitativen Bestimmung von Proteinen oder Glycoproteinen, wie IgE, aus Tränenflüssigkeiten ist bekannt. So beschreibt die französische Patentanmeldung, Nr. FR 9015200, eine quantitative Bestimmung von Proteinen in Tränen mit Hilfe eines Streifens, auf dem die IgE adsorbieren, und einer anschließenden immunologischen Anzeige der vorhandenen IgE. Obwohl dieses Verfahren sehr effizient ist, weist es jedoch bestimmte Beschränkungen auf. Es ist nämlich bekannt, dass das Auge aus immunologischer Sicht ein relativ isoliertes Organ ist, so dass die gemessenen IgE in den Tränen eine im Wesentlichen lokale Sensibilität widerspiegeln (d.h. das mögliche Vorliegen von Allergien, die das Auge betreffen), aber wenig über den eher allgemeinen Zustand eines Patienten oder über weitere lokale allergische Sensibilisierungen aussagen.

Die anderen gegenwärtig verfügbaren Verfahren für die quantitative Bestimmung von Immunglobulinen, wie die IgE, basieren im Wesentlichen auf der Messung der IgE-Gehalte im Blut oder Serum. Diese Techniken erfordern eine Blutentnahme beim Patienten. Andererseits erlauben die quantitativen Serumbestimmungen nicht immer eine zuverlässige oder vollständige Aussage über den allgemeinen allergischen Zustand einer Person in dem Maße, wo die Sensibilität einer Person nicht nur von den zirkulierenden IgE sondern ebenfalls von den in Gewebe und/oder an Zellen gebundenen IgE abhängig ist. Insbesondere erlauben diese quantitativen Bestimmungen allein nicht, die Gesamtheit der sich entwickelnden allergischen Phänomene bei einer Person zu erkennen.

Es besteht folglich ein tatsächlicher Bedarf in der gegenwärtigen Technik an weiteren einfachen und wirksamen Verfahren, welche die quantitative Bestimmung von Proteinen, wie IgE, erlauben.

Der Nachweis der IgE in Nasensekreten hat sich bis heute aufgrund der spontanen Variationen des Abflusses besagter Sekrete und der komplizierten Entnahmeverfahren (Absaugung, Spülung, Ausstrich und Biopsie) als schwierig durchzuführen erwiesen.

Die vorliegende Erfindung stellt eine Lösung dieser Probleme bereit. Die Erfindung beschreibt nämlich neue Verfahren und Zusammensetzungen für die quantitative Bestimmung von Proteinen und Glycoproteinen. Diese Verfahren basieren in erster Linie auf dem biologischen Material, das für die quantitative Bestimmung der Proteine genutzt wird, d.h. den Nasensekreten. Die vorliegende Erfindung zeigt nämlich, dass es möglich ist, in den Nasensekreten das Vorhandensein von Proteinen oder Glycoproteinen, insbesondere von Immunglobulinen, besonders des Typs E, nachzuweisen und dass diese Proteine auf eine einfache und wirksame Weise quantitativ bestimmt werden können. Die vorliegende Erfindung zeigt außerdem, dass diese quantitative Bestimmung, auf IgE angewandt, besonders empfindlich ist und eine zuverlässige Aussage (und eine zu bestehenden Techniken ergänzende Aussage) über den allergischen Zustand einer Person erlaubt. Insbesondere erlauben die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung vorteilhafterweise das Erkennen der allergischen Bereiche bei einer Person, gleich ob es sich um lokale Allergien (zum Beispiel Allergien des Nasenrachenraums) oder um allgemeine Allergien handelt.

Ein erster Gegenstand der Erfindung beruht auf einem Verfahren zum Nachweis von IgE, umfassend:

  • – das Inkontaktbringen eines Nasensekrets mit einem Material, das die Adsorption der IgE erlaubt, und
  • – den Nachweis aus besagtem Material des Vorhandenseins der IgE mit Hilfe einer Reaktion immunologischer Art.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung beruht auf einem Verfahren zur quantitativen Bestimmung von IgE, umfassend:

  • – das Inkontaktbringen eines Nasensekrets mit einem Material, das die Adsorption der IgE erlaubt, und
  • – die quantitative Bestimmung der an diesem Material adsorbierten IgE mit Hilfe einer Reaktion immunologischer Art.

Diese Anwendungsform umfasst vorteilhafterweise einen Schritt der Ermittlung der Menge (oder der Konzentration) des betreffenden Proteins oder Glycoproteins. In dieser Hinsicht umfasst der obere Schritt der quantitativen Bestimmung bevorzugter die Bestimmung der Menge des betreffenden Proteins oder Glycoproteins, das an besagtem Material adsorbiert ist, wobei die gemessene Menge mit einer Eichkurve verglichen wird, die zuvor oder gleichzeitig erstellt wird. Diese Ermittlung erlaubt die Bestimmung der tatsächlichen Konzentration des betreffenden Proteins oder Glycoproteins im Nasensekret. Die Eichkurve ist vorzugsweise eine Kurve, die aus Referenzlösungen erstellt wird, die das betreffende Protein oder Glycoprotein in definierten Konzentrationen enthalten, die nach demselben Protokoll quantitativ bestimmt werden.

Die vorliegende Erfindung beschreibt und betrifft daher jedes beliebige qualitative und quantitative Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von biologischen Molekülen aus Nasensekreten.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck Nasensekret jede Substanz, die im Bereich der Nase oder Nasennebenhöhle (wie zum Beispiel der Schleim) gebildet wird, insbesondere jede Substanz, die von den Schleimhäuten der Nase oder der Nasennebenhöhlen freigesetzt oder sezerniert wird. Es handelt sich hauptsächlich um Absonderungen, die beim Schnupfen, Nießen, bei allergischen Zuständen oder allergieartigen Zuständen beobachtet werden, Schleim, Hydrorrhoea oder um jede andere Substanz oder Sekret, die/das in einem normalen oder pathologischen physiologischen Zustand, wie er bei allergischen Zuständen vorkommt, freigesetzt wird. Bevorzugter bezeichnet der Ausdruck Nasensekret den Schleim.

Die Untersuchung der Nasensekrete ist Gegenstand mehrerer vielschichtiger Arbeiten gewesen, die sich entweder auf die Biochemie (pH oder biochemische Zusammensetzung des Schleims) oder auf die zellulären Faktoren (lokale Eosinophilie) oder auf dynamische Tests (Provokationstests) konzentrieren. Die Erfindung zeigt jetzt, dass biologische Substanzen, wie Immunglobuline, aus dem Schleim oder anderen Sekreten der Nase oder Nasennebenhöhlen auf eine einfache, empfindliche und reproduzierbare Weise direkt nachgewiesen oder quantitativ bestimmt werden können.

Für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung kann das Inkontaktbringen des Materials mit den Nasensekreten entweder durch direktes Inkontakbringen des Adsorptionsmaterials mit den Nasenschleimhäuten oder durch Gewinnen der Nasensekrete und Herstellen eines Kontakts in einer geeigneten Vorrichtung (Plättchen, Röhrchen, Schale, Schiffchen, etc.) erfolgen. Vorzugsweise erfolgt das Inkontaktbringen des Materials mit den Nasensekreten, indem das Material direkt mit den Nasenschleimhäuten der Person in Kontakt gebracht wird. Dies erfolgt üblicherweise durch manuelles Einführen des Adsorptionsmaterials (oder eines Teils davon) in ein Nasenloch der Person.

Der Kontakt zwischen dem Nasensekret und dem Material erfolgt vorzugsweise während eines Zeitraums, der hinreichend ist, um die Adsorption von Proteinen oder Glycoproteinen an diesem Material zu erlauben. Wenn eine quantitative Bestimmung durchgeführt wird, wird der Kontakt vorzugsweise aufrechterhalten, bis ein Gleichgewicht zwischen der Menge an Proteinen oder Glycoproteinen, die an dem Material adsorbiert sind, und ihrer Konzentration in den Nasensekreten der Person erreicht wird. Im Allgemeinen kann dieser Kontakt einen Zeitraum aufrechterhalten werden, der zwischen einigen Sekunden bis zu mehreren Minuten, üblicherweise 1 bis 5 Minuten, zum Beispiel 1 bis 3 Minuten, dauert. Es versteht sich, dass dieser Zeitraum ohne weiteres vom Durchführenden in Abhängigkeit der allgemeinen oder lokalen Bedingungen, von der Art des untersuchten Proteins oder Glycoproteins und dem verfolgten Ziel (Nachweis, quantitative Bestimmung, etc.) angepasst werden kann.

Das im Rahmen der Erfindung für die Adsorption der Proteine und/oder Glycoproteine verwendete Material kann jeder beliebige, vorzugsweise flache Träger sein, der mit den Nasensekreten in Kontakt gebracht werden kann, der insbesondere in das Nasenloch, ohne es zu verletzen, eingeführt werden kann. Dieses Material kann verschiedene Formen einnehmen, wie zum Beispiel in Form eines Fadens, einer Pastille oder Scheibe, eines chirurgischen Schwamms, einer Spitze, eines Stäbchens oder Streifens etc. vorliegen. Das Material, das die Adsorption erlaubt, umfasst vorzugsweise wenigstens einen Teil, der aus einem Adsorptionsmaterial besteht, vorzugsweise einem die Person nicht belastenden oder toxischen Material, wenn das Inkontaktbringen mit den Nasenschleimhäuten direkt durchgeführt wird. Es kann sich insbesondere um ein Cellulose-Material (zum Beispiel mit einer geringen Dichte), Polymere, Makromolekülkomplexe, natürlichen oder synthetischen Ursprungs, allein oder in Kombination, handeln. Vorzugsweise handelt es sich um ein Cellulose-Material.

In einer bevorzugten Anwendungsform der Erfindung und besonders für die Ermittlung der IgE besteht das Adsorptionsmaterial aus Streifen, die wenigstens einen Teil aus Cellulosepapier geringer Dichte, mit gelegten oder nicht gelegten Fasern, umfassen. Als besondere Beispiele kann man insbesondere die Streifen für den Schirmer-Test der Laboratoires Faure (Annonay, Frankreich) (Papiertyp Whatman Nr. 1) oder Streifen nennen, die aus Papier Nr. 2312 von Schleicher & Schuell (Dassel, Deutschland) hergestellt sind. Die Papiere Nr. 566 und 1573 der gleichen Herkunft eignen sich ebenfalls. Trotz einer weniger guten Empfindlichkeit kann man ebenfalls vom gleichen Lieferanten die Papiere Nr. 1577, 1575, 1506, 1507, 903, 589/2, 589/3, 589/5, 589/6, 572 und 512 anführen.

Die Streifen können vorteilhafterweise Abmessungen in der Größenordnung von 55 mm × 5 mm besitzen. Bei der Probennahme lässt man zum Beispiel ungefähr die ersten 15 mm des Streifens vollsaugen, wobei einige Minuten hierfür ausreichen.

Die Streifen können für ein Abtrennen des mit den Schleimhäuten in Kontakt gebrachten Endes von dem restlichen Streifen vorgesehen sein. Aber man kann in der Tat nach einer Probennahme den Streifen, einschließlich während der weiteren Schritte, ganz lassen. Der Streifen kann dann nach der Probennahme mehrere Wochen vor dem Schritt der Anzeige oder der quantitativen Bestimmung aufbewahrt werden.

Der Schritt des Nachweises oder der quantitativen Bestimmung kann mit jeder beliebigen, dem Fachmann bekannten immunchemischen Technik durchgeführt werden, die auf der Verwendung von spezifischen Antikörpern und/oder Antigenen beruht, allein oder in Kombinationen, die markiert sein können und gemäß verschiedenen Strategien angezeigt werden können (kolorimetrische, enzymatische, fluoreszierende, radioaktive Markierungen, Markierungen des Typs Avidin-Biotin, etc.).

Insbesondere kann man beim immunologischen Schritt des Nachweises oder der quantitativen Bestimmung Antikörper einsetzen, die gegen das betreffende Protein/Glycoprotein gerichtet sind, um dieses einzufangen und anschließend für den Nachweis oder die quantitative Bestimmung der folglich gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe zu sorgen. Dieses Verfahren ist vorzugsweise ein „Sandwich"-Verfahren, das in der Veröffentlichung von E. BLOCH-MICHEL und L. HELLEBOID, Revue française des Laboratoires Nr. 207, Mai 1990, Seiten 43 bis 46, beschrieben ist. Nach dieser Anwendungsform wird das Adsorptionsmaterial (oder der Teil des Adsorptionsmaterials, der mit den Nasensekreten in Kontakt gewesen ist) in eine Lösung verbracht, die in einem Röhrchen oder ähnlichem (Platte, Schale, Kolben, Ampulle, etc.) enthalten ist und zwei Antikörper-Typen umfasst, die gegen das betreffende Protein/Glycoprotein gerichtet sind: einerseits freie markierte Antikörper und andererseits an einer festen Phase gebundene Antikörper (die im Allgemeinen nicht markiert sind). Die Proteine schwimmen in der Lösung und binden an die markierten Antikörper. Jeder so erhaltene Komplex wird an einen Antikörper an der festen Phase gebunden. Das Vorhandensein oder die Menge an betreffendem Protein oder Glycoprotein kann nun durch Nachweis oder Messung der Intensität der im Röhrchen gebundenen Markierung bestimmt werden.

Die Antikörper können monoklonale oder polyklonale Antikörper sein. Die Antikörper an der festen Phase können Antikörper sein, die an einer festen Phase, wie insbesondere Papierscheibe, Kügelchen, etc. immobilisiert sind, oder die direkt an der Innenseite des Kunststoffröhrchens immobilisiert sind (an der Innenwand gebundene Antikörper) und als Empfänger für den Reaktionskomplex etc. dienen. Die Fixierung der Antikörper an den festen Träger kann mit jeder dem Fachmann bekannten Technik (mittels Adsorption, kovalenter Bindung, etc.) erfolgen.

Für das immunchemische Verfahren können, unter den für die Antikörper weiter oben beschriebenen Bedingungen, ebenfalls Reaktionen von Antigenen, wie Allergenen, mit Antikörpern genutzt werden, besonders in einer „Sandwich"-artigen Reaktion, wie sie oben angeführt ist, in diesem Fall verwendet man vorteilhafterweise einen Antikörper und ein Antigen, wobei ein Partner markiert und frei ist und der andere Partner an einer festen Phase immobilisiert ist.

Zusätzlich zu diesen „Sandwich"-artigen Reaktionen kann die vorliegende Erfindung ebenfalls jedes andere Verfahren für den Nachweis oder für die quantitative Bestimmung von Antigenen in einer Lösung nutzen. In dieser Hinsicht kann man besonders verschiedene immunenzymatische Techniken (des Typs ELISA, etc.) oder radioimmunologische Techniken (des Typs RIA, etc.) nennen.

Vorzugsweise werden während des Nachweis- oder Bestimmungsschrittes die Reaktionsröhrchen (oder andere Reaktionsbehälter) geschüttelt, um die Empfindlichkeit zu erhöhen, d.h. die Messung sehr geringer Mengen zu erlauben.

Wie oben angegeben, werden für eine quantitative Bestimmung von Proteinen oder Glycoproteinen die erhaltenen Ergebnisse im Allgemeinen mit einer Eichkurve verglichen, die aus Referenzlösungen erstellt ist, die nach demselben Protokoll bestimmt werden. Diese Referenzlösungen können mittels Verdünnung (oder Verdünnungsreihen) des reinen Proteins oder Glycoproteins künstlich hergestellte Lösungen sein. Es kann sich ebenfalls um biologische Proben, wie zum Beispiel eine Probe von Tränen oder Blut (oder Serum) handeln. In dieser Hinsicht umfasst das Verfahren der Erfindung in einer besonderen Anwendungsform einen zusätzlichen Schritt des Vergleichs der Mengen, die in den Nasensekreten gemessen werden, mit den Mengen, die in einer anderen biologischen Probe, wie Tränen, Blut oder Serum, gemessen werden.

Die Verfahren der Erfindung können für einen Nachweis oder eine quantitative Bestimmung verschiedener Protein- oder Glycoproteinarten angewandt werden. Es kann sich insbesondere um Immunglobuline (IgG, IgM, IgE, etc.), Entzündungsproteine oder um andere Proteine oder Glycoproteine, die an physiologischen oder physiopathologischen Phänomenen beteiligt sind, oder um Markierungen handeln, die für die Durchführung diagnostischer Bestimmungen zweckdienlich sind. Bevorzugt handelt es sich um Immunglobuline, noch bevorzugter um Typ E Immunglobuline (IgE). Die in den Beispielen angeführten Ergebnisse zeigen nämlich, dass die IgE in den Nasensekreten nachgewiesen werden können und dass die quantitativen Bestimmungen der Erfindung eine hohe Empfindlichkeit bieten, was den Nachweis von Mengenschwankungen von IgE erlaubt, die mit einem lokalen oder allgemeinen allergischen Zustand korreliert sind.

In dieser Hinsicht beruht ein besonderer Gegenstand der Erfindung auf einem Verfahren zur Erkennung, Verfolgung oder Charakterisierung einer Allergie bei einer Person, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren einen Schritt des Nachweises und/oder der quantitativen Bestimmung der in den Nasensekreten vorhandenen IgE umfasst.

Dieser Nachweis oder diese quantitative Bestimmung wird vorteilhafterweise unter den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt.

Der Nachweis zeigt an, dass der allergische Charakter der betreffenden Person noch nicht bekannt oder aufgezeigt ist oder sich in einem noch nicht bestätigten frühen Stadium befindet. Das Verfahren der Erfindung ist ebenfalls für die Verfolgung und/oder für die Charakterisierung einer Allergie anwendbar, d.h. für eine Untersuchung der Entwicklung des allergischen Stadiums einer Person oder für die Bestimmung des gezeigten Allergietyps, besonders seines lokalen oder allgemeinen Charakters.

Das Verfahren der Erfindung kann zur gleichzeitigen quantitativen Bestimmung mehrerer Proteine oder Glycoproteine von Interesse oder mehrerer Protein- oder Glycoproteinarten von Interesse angewandt werden. Es kann sich insbesondere um Gesamt-IgE oder auch um bestimmte IgE handeln, die für bestimmte Antigene (Allergene) spezifisch sind. Gemäß einer bevorzugten Anwendung umfasst das Verfahren der Erfindung einen Nachweis oder eine quantitative Bestimmung der in Nasensekreten vorhandenen IgE ohne Differenzierung der Antigenspezifität (Gesamt-IgE).

Das Verfahren kann folglich nicht nur für die quantitative Bestimmung der nasalen Gesamt-IgE sondern auch für die quantitative Bestimmung spezifischer IgE, insbesondere bei geringen Konzentrationen, anwendbar sein. Um so mehr kann man eine quantitative Bestimmung der spezifischen IgE durchführen.

Für die spezifischen IgE verwendet man vorteilhafterweise Allergene oder Reaktogene, die, so wie es für die Antikörper beschrieben ist, unter Umständen unlöslich gemacht oder markiert sein können.

Zudem erlaubt das Verfahren gemäß der Erfindung die Erstellung nicht nur von Diagnosen im Falle lokaler Allergien (vom Typ Nasenrachenraumallergie) sondern ebenfalls im Falle allgemeiner Allergien. Im letzteren Fall erlaubt die erhöhte Empfindlichkeit des Verfahrens die Quantifizierung der IgE im Transsudat. In dieser Hinsicht kann das Verfahren der Erfindung insbesondere für eine Erkennung oder eine Verfolgung der Entwicklung von Allergien, wie von Asthma, Ekzemen, Rhinitis, allergischer Sinusitis, etc., verwendet werden.

Wie oben angegeben, ist die Erfindung ebenfalls für eine quantitative Bestimmung von Substanzen in der Nase, die einen entzündlichen oder pathologischen Zustand wiedergeben, und insbesondere für Substanzen anwendbar, die sich wahrscheinlich in den Nasensekreten in geringen und vorzugsweise ziemlich kleinen Konzentrationsbereichen befinden.

Die Materialien und Verfahren der Erfindung können für den Nachweis oder die quantitative Bestimmung der Proteine oder Glycoproteine in den Nasensekreten eines jeden Menschen, egal ob Erwachsener oder Kind, gesund oder eine Krankheit aufweisend, verwendet werden. Außerdem kann die Erfindung ebenfalls für den Nachweis oder die quantitative Bestimmung von Proteinen oder Glycoproteinen in den Nasensekreten von beliebigen anderen Säugern (insbesondere Hunde, Rinder, Schafe, Pferde, Schweine, etc.) Verwendung finden.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf Kits zur Durchführung der oben beschriebenen Verfahren. Diese Kits umfassen vorteilhaft Lösungen, welche die Durchführung einer Immunreaktion erlauben, und insbesondere wenigstens einen anti-IgE-Antikörper. Dieser Antikörper kann ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper sein, der markiert oder nicht markiert sein kann. Bevorzugter umfassen die Kits der Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung der Immunreaktion, wie zum Beispiel ein Röhrchen, eine Vertiefung, Schale oder ein Kolben. Zudem können die Kits der Erfindung außerdem ein Adsorptionsmaterial umfassen, das für die Durchführung der Probennahme zweckdienlich ist.

In einer besonderen Anwendungsform umfassen die Kits der Erfindung ein Röhrchen (oder analoge Vorrichtung), das mit einem anti-IgE-Antikörper beschichtet ist, und eine Lösung eines anti-IgE-Antikörpers, der an ein Enzym (zum Beispiel Peroxidase) gekoppelt ist. Bevorzugter umfassen sie außerdem ein Adsorptionsmaterial (insbesondere einen Streifen), das mit einem IgE-Standard getränkt ist, und/oder eine Waschlösung und/oder ein chromogenes Substrat eines Enzyms (zum Beispiel OPD). Diese Kits können ohne weiteres für den Nachweis oder die quantitative Bestimmung der IgE aus Nasensekreten gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Ein anderer Gegenstand der Erfindung beruht ebenfalls auf der Verwendung eines Materials, das die Adsorption von Proteinen oder Glycoproteinen erlaubt, für den Nachweis oder die quantitative Bestimmung von Proteinen oder Glycoproteinen aus einem Nasensekret einer Person durch direktes Inkontaktbringen des besagten Materials mit einer Nasenschleimhaut der besagten Person. Das Material ist vorzugsweise ein wie oben definiertes Material und wird für den Nachweis des Vorhandenseins oder die quantitative Bestimmung der Immunglobuline verwendet.

Ein anderer Gegenstand der Erfindung beruht ebenfalls auf der Verwendung eines Materials, das die Adsorption von Proteinen oder Glycoproteinen erlaubt, für die Herstellung eines Produkts oder Kits für die Durchführung eines Verfahrens zur Diagnose, Erkennung, Verfolgung oder Charakterisierung einer Allergie bei einer Person.

Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden bei der Lektüre der nachfolgenden Beispiele offensichtlich, die als Veranschaulichung und nicht als Beschränkung betrachtet werden sollen. Diese Beispiele veranschaulichen besonders das Prinzip der quantitativen Bestimmung der Gesamt-IgE mit Hilfe einer immunenzymatischen Technik in Nasensekreten, die mit Hilfe eines Papierstreifens beprobt werden.

1. Prinzip der quantitativen Bestimmung

Der immunenzymatische Nachweis ist mit einer „Sandwich-Technik" unter Verwendung zweier monoklonaler anti-IgE-Antikörper durchgeführt worden. Die Reaktion läuft in zwei Schritten ab:

  • – Immunreaktion: die IgE, die quantitativ zu bestimmen (oder nachzuweisen) sind, werden 3 h bei 18–25°C in Röhrchen in Gegenwart zweier monoklonaler anti-IgE-Antikörper inkubiert, wobei einer davon an der Innenwand der Röhrchen gebunden ist und der andere, in der flüssigen Phase, mit Peroxidase markiert ist. Der Inkubation folgt ein Waschen der Röhrchen.
  • – enzymatische Anzeige: man gibt in die Röhrchen ein chromogenes OPD-Substrat (Orthophenylendiamin). Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei 18–25°C gibt man ein Blockierungsmittel (Schwefelsäure) hinzu und liest die erhaltene Farbe spektrophotometrisch ab.

Im Verlauf derselben Bestimmungsreihe führt man eine Leerreaktion (Röhrchen ohne IgE), Standards (Röhrchen, die bekannte IgE-Mengen enthalten) und eine Positivkontrolle durch.

2. Beschreibung der Reagenzien (Kits zur quantitativen Bestimmung)

Die folgenden Reagenzien werden bei der Durchführung des Verfahrens eingesetzt:

  • – Papierstreifen zur Durchführung der Probennahme in der Nase,
  • – Polystyrolröhrchen, die mit anti-IgE-Antikörper beschichtet sind,
  • – Streifen, mit IgE-Standard getränkt,
  • – Streifen, mit positiver Kontrolle getränkt,
  • – Peroxidase-markierter anti-IgE-Antikörper in Lösung,
  • – Waschlösung,
  • – Chromogen (OPD in Tablettenform mit Verdünnungsmittel)
  • – Blockierungsmittel (Schwefelsäure)

3. Verfahrensweise

Das Verfahren wird folgendermaßen durchgeführt.

Für die Immunreaktion werden die Streifen, die zuvor mit den Nasensekreten in Kontakt gebracht worden sind, (oder die Standard- oder Kontroll-Streifen) in die Röhrchen verbracht (außer dem Röhrchen der Leerreaktion). 300 &mgr;l Antikörper, an Peroxidase konjugiert, werden zugegeben und die Röhrchen werden unter Schütteln mit einer Geschwindigkeit von 360 UpM 3 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Das Reaktionsmedium in allen Röhrchen wird abgesaugt und die Waschlösung wird auf die Röhrchen verteilt (2 ml pro Röhrchen) und die Streifen werden aus den Röhrchen entfernt. Die Lösung wird erneut abgesaugt und der Waschvorgang wird zweimal wiederholt. Die Lösungen werden dann sorgfältig abgesaugt.

Für die enzymatische Anzeige werden 300 &mgr;l Anzeigelösung in jedes Röhrchen verteilt. Nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur und unter Lichtschutz wird 1 ml Blockierungsmittel in jedes Röhrchen gegeben. Die Röhrchen werden geschüttelt (zum Beispiel auf einem Vortex-Schüttler). Die gebildete Farbe wird bei 492 nm gegen die Leerreaktion abgelesen.

4. Ergebnisse

Verschiedene Vorversuche sind bei Menschen, in pathologischem oder gesundem Zustand, durchgeführt worden, um die vorhandenen IgE in ihren Nasensekreten (einschließlich Sekrete der Nasennebenhöhlen) quantitativ zu bestimmen.

Die erhaltenen Ergebnisse können folgendermaßen zusammengefasst werden:

In einer ersten Versuchsreihe ist der Test der nasalen IgE der Erfindung mit nasalen Provokationstests (thermisch und eosinophil) bei etwa 50 Personen verglichen worden. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass der Test der nasalen IgE der Erfindung empfindlicher als der eosinophile Provokationstetst und selektiver als der thermische Provokationstest ist.

In einer zweiten Versuchsreihe ist der Test der nasalen IgE der Erfindung mit einem Hauttest bei 17 Personen verglichen worden, die wegen Allergie auslösender Manifestationen im Nasenrachenraum einen Arzt konsultiert hatten. Während der Hauttest negativ war, hat der Test der Erfindung bei 10 Personen den Nachweis einer wesentlichen Erhöhung der IgE in den Nasensekreten erlaubt. Diese Versuche scheinen anzuzeigen, dass die Tests der Erfindung einen zuverlässigeren Nachweis als die früheren Hauttests erlauben. Diese Ergebnisse scheinen ebenfalls die Dominanz der lokalen Hypersensibilität über die allgemeine Hypersensibilität zu bestätigen.

Die erhaltenen Ergebnisse zeigen außerdem, dass die auf den Streifen gesammelten IgE direkt proportional zu ihrer Konzentration in dem Bestimmungsmedium quantitativ bestimmt werden können, ohne dass die Ermittlung des Gewichts oder der gesammelten Menge erforderlich ist. Dieses Phänomen hat seinen Grund darin, dass sich sehr schnell (in einigen Minuten) ein Gleichgewicht zwischen den IgE, die auf dem Papier adsorbieren, und den IgE, die in Lösung verbleiben, einstellt. Wenn das Papier mit der anti-IgE-Antikörperlösung inkubiert wird, lösen dann die IgE sich vom Papier und bilden einen Antigen-Antikörper-Komplex, der nun quantitativ bestimmt werden kann.

Die quantitative Bestimmung gemäß der Erfindung ist von Vorteil, da sie in einem Schritt durchgeführt werden kann, und dass sie durch das Schütteln der Röhrchen die Bestimmung von sehr kleinen Proteinmengen (weniger als 2 kUI/l) erlaubt.

In einer dritten Versuchsreihe wird der Test der nasalen IgE der Erfindung bei einer Kontrollgruppe von 9 Menschen (5 Frauen und 4 Männer) im Alter von 25 bis 55 Jahren und bei einer Gruppe von 17 Patienten (7 Frauen und 10 Männer) von 7 bis 61 Jahren praktiziert.

Die Kontrollgruppe besteht aus Personen, die weder Rhinitissymptome noch allergische Symptome zeigen und keine persönliche oder familiäre medizinische Vorgeschichte aufweisen. Die zweite Gruppe besteht aus Personen, die aufgrund von Symptomen einer chronischen Rhinitis, die sich über einen Zeitraum von mehr als 3 Monate gezeigt haben, einen Arzt konsultiert haben.

Die Streifen sind mit dem Nasenschleimhäuten der Personen 60 Sekunden in Kontakt gebracht worden, anschließend zur Analyse unter den oben beschriebenen Bedingungen ins Laboratorium geschickt worden (unter 15 Tage).

Die erhaltenen Ergebnisse zeigen in den Nasensekreten der Kontrollpersonen eine mittlere optische Dichte von 0,136 und in den Nasensekreten der Personen mit Symptomen eine mittlere optische Dichte von 1,752.

Der gemäß der Erfindung praktizierte Test der nasalen IgE hat folglich erlaubt, eine signifikante Differenz in der lokalen IgE-Sekretion zwischen der Kontrollgruppe und der Patientengruppe nachzuweisen und folglich die allergischen Personen von den gesunden Personen eindeutig zu unterscheiden.


Anspruch[de]
Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von IgE, umfassend:

– das Inkontaktbringen eines Nasensekrets mit einem Material, das die Adsorption der IgE erlaubt und wenigstens einen Teil umfasst, der aus einem Adsorptionsmittel zusammengesetzt ist, das aus einem Cellulose-Material, einem Polymer oder einem Makromolekülkomplex, natürlichen oder synthetischen Ursprungs, allein oder in Kombinationen, ausgewählt ist, wobei das Material in direkten Kontakt mit den Nasenschleimhäuten einer Person gebracht wird, und

– den Nachweis oder die quantitative Bestimmung des Vorhandenseins von IgE aus besagtem Material durch eine Reaktion immunologischer Art, wobei dieser Schritt des Nachweises oder der quantitativen Bestimmung die Inkubation des Adsorptionsmaterials oder des Teils des Adsorptionsmaterials, das mit den Nasensekreten in Kontakt gewesen ist, in einer Lösung umfasst, die zwei gegen die IgE gerichtete Antikörpertypen enthält: einerseits freie markierte Antikörper und andererseits Antikörper an einer festen Phase.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt der quantitativen Bestimmung die Bestimmung der betreffenden Menge an IgE umfasst, die an dem besagten Material adsorbiert ist, wobei die gemessene Menge auf eine Eichkurve bezogen ist. Verfahren nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Adsorptionsmaterial wenigstens einen Teil umfasst, der aus einem für die Person nicht belastenden oder toxischen Cellulose-Adsorptionsmittel zusammengesetzt ist. Verfahren nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Adsorptionsmaterial aus einem Träger in Form eines Fadens, Pastille oder Scheibe, chirurgischen Schwamms, Spitze, Stäbchens oder Streifens besteht. Verfahren nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper mit einer kolorimetrischen, enzymatischen, fluoreszierenden, radioaktiven Markierung und/oder einer Markierung des Typs Avidin-Biotin markiert sind. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Nachweises oder der quantitativen Bestimmung mit einem immunologischen ELISA-Verfahren durchgeführt wird. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper monoklonale oder polyklonale Antikörper sind. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von Gesamt-IgE.






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