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Dokumentenidentifikation DE60128144T2 03.01.2008
EP-Veröffentlichungsnummer 0001358000
Titel VORRICHTUNG UND VERFAHREN ZUR TRENNUNG VON MOLEKÜLEN UND BEWEGUNG VON FLUIDEN MITTELS ELEKTROPHORESE
Anmelder Life Therapeutics Ltd., Frenchs Forest, Neusüdwales, AU
Erfinder ROETH, Philip John, Castle Hill, NSW 2154, AU;
BOTTO, Steven Anthony, Rydalmere, NSW 2116, AU;
CURLEY, Benjamin John, Sutherland, NSW 2232, AU;
NAIR, Chenicheri Hariharan, Old Greenwich, CT 06870, US
Vertreter Bohmann, A., Dipl.-Biol.Univ. Dr.rer.nat., Pat.-Anw., 80335 München
DE-Aktenzeichen 60128144
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 21.12.2001
EP-Aktenzeichen 012712535
WO-Anmeldetag 21.12.2001
PCT-Aktenzeichen PCT/AU01/01669
WO-Veröffentlichungsnummer 2002049744
WO-Veröffentlichungsdatum 27.06.2002
EP-Offenlegungsdatum 05.11.2003
EP date of grant 25.04.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 03.01.2008
IPC-Hauptklasse B01D 57/02(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse G01N 27/447(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   B01D 61/42(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C25B 7/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Trennung von Verbindungen, insbesondere von Makromolekülen, bei denen die Flüssigkeitsvolumenbewegung gesteuert werden kann.

Hintergrund hinsichtlich der Technik

Die Elektrophorese auf der Grundlage von Membranen ist eine neue Technologie, die ursprünglich für die Trennung von Makromolekülen wie beispielsweise Proteinen, Nukleotiden und komplexen Zuckern entwickelt wurde. Das Verfahren liefert eine hinsichtlich des Maßstabes vergrößerbare Trennung mit hoher Reinheit, die schneller, billiger und mit einer höheren Ausbeute verbunden ist als derzeitige Verfahren zur Trennung von Makromolekülen, und bietet das Potenzial, Makromoleküllösungen gleichzeitig zu reinigen und zu entgiften.

In einer Form ist die Technologie in einer Patrone gebündelt, die eine Anzahl von in einem System untergebrachten Membranen umfasst, was die Trennung von Verbindungen nach Ladung und/oder Molekulargewicht erlaubt. Das System kann auch gleichzeitig aufkonzentrieren und entsalzen/dialysieren. Die multimodale Natur des Systems erlaubt, dass diese Technologie auf einer Anzahl von anderen Gebieten verwendet werden kann, insbesondere bei der Herstellung von biologischen Bestandteilen zur medizinischen Verwendung. Die Struktur der Membranen kann so konfiguriert werden, dass am Punkt der Trennung auch biologische Verunreinigungen entfernt werden können – eine Aufgabe, die derzeitig nicht in der biotechnologischen Industrie verfügbar ist und die die Produktionskosten durch Zeitverzögerungen und aufgrund der Komplexität der Aufgabe erhöht.

Beispielsweise offenbart US 3,870,617 eine Vorrichtung zur kontinuierlichen Forced-Flow-Elektrophorese und ihre Verwendung, wobei die Vorrichtung herkömmliche mikroporöse, Dialyse- und innenselektive Membranen umfasst, die zur Fraktionierung von Blut unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes und eines hydrostatischen Druckunterschiedes geeignet sind. US 4,608,147 offenbart währenddessen eine Vorrichtung zur Elektroelution biologischer Moleküle aus Schnitten von Elektrophoresegelen zum Betrieb in einer Elektrophoresekammer, wobei die Vorrichtung eine Semi-Reinigung der biologischen Moleküle mittels einer Falle zwischen zwei Membranen umfasst, die für alle Ionen und Moleküle von geringem Molekulargewicht durchlässig sind. US 4,441,978 offenbart eine zweistufige Vorrichtung, bei der eine flüssige Proteinmischung zunächst durch Elektrodialyse und unter Verwendung herkömmlicher innenselektiver Membranen entmineralisiert und anschließend einer isoelektrischen Fokussierung ausgesetzt wird, um die Trennung von Proteinen auf der Grundlage von Unterschieden hinsichtlich ihrer isoelektrischen Punkte zu bewirken.

Die Übertragung von Flüssigkeit von einem Bereich in einen anderen durch eine poröse Membran unter Elektrophoresebedingungen wird als Elektroendoosmose (EEO) bezeichnet. Elektroendoosmose tritt bei membranbasierten Elektrophoresetechnologien natürlicherweise auf, und ihre Steuerung kann zu einer Erhöhung der Produktgewinnung, einer Verringerung der Laufzeiten und zu einem Konzentrieren der Proben führen. Diese Verbesserungen können durch das Aufrechterhalten der Konzentration des Zielmoleküls in einem spezifischen Strom erreicht werden, indem das Ausmaß des Flüssigkeitsvolumenübergangs gesteuert wird. Ein Verfahren zum Steuern von Elektroendoosmose bediente sich der Elektroosmose, wobei eine externe Energieversorgung die Geschwindigkeit eines Systems, das Osmose oder Endoosmose durchläuft, verändert. Die Auswirkung einer großen Volumenerhöhung ist bei der Verwendung des Systems in einem größeren Maßstab potentiell schwerwiegender. Eine Steuerung der Elektroendoosmose würde erheblich zur Kostensenkung und zur effizienteren Instandhaltung von Anlagen beitragen. Die Fähigkeit, Proben zu konzentrieren, ohne z. B. die Aktivität, Funktionalität, Quantität, nachteilig zu beeinflussen, wäre nützlich.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nun eine Modifikation der Elektrophoresetechnologie auf der Grundlage von Membranen entwickelt, um das Steuern von Flüssigkeitsvolumenübertragung/-Endoosmose zu unterstützen.

Offenbarung der Erfindung

In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Elektrophoresevorrichtung gemäß Anspruch 1 bereit, umfassend:

  • (a) eine erste Elektrode in einer ersten Elektrodenzone;
  • (b) eine zweite Elektrode in einer zweiten Elektrodenzone, wobei die erste Elektrode relativ zur zweiten Elektrode so angeordnet ist, dass sie angepasst ist, um dazwischen ein elektrisches Feld in einem elektrischen Feldbereich nach Anlegen eines elektrischen Potenzials zwischen der ersten und der zweiten Elektrode zu erzeugen;
  • (c) eine erste Membran, die in dem elektrischen Feldbereich angeordnet ist;
  • (d) eine zweite Membran, die zwischen der ersten Elektrodenzone und der ersten Membran so angeordnet ist, um dazwischen ein erstes Zwischenvolumen zu definieren; wobei das erste Zwischenvolumen von der ersten und zweiten Elektrodenzone durch die erste und zweite Membran getrennt ist;
  • (e) Mittel, die angepasst sind, um Flüssigkeit zu der ersten Elektrodenzone und der zweiten Elektrodenzone zu übertragen; und
  • (f) Mittel, die angepasst sind, um einen Probenbestandteil an das erste Zwischenvolumen zu übertragen; dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Membran eine Barriere in der Form einer induzierbaren elektro-endo-osmotischen Membran vorliegt, die in der Lage ist, eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes zu steuern, wobei die wenigstens eine induzierbare elektro-endo-osmotische Membran entweder:

    1) aus Zellulosetriacetat mit einem Molekülmassenausschluss von 5 bis 20 kDa oder

    2) aus Polyvinylalkohol hergestellt ist;

Bei der Verwendung wird eine Probe in das erste Zwischenvolumen (auch als Strom 1 bezeichnet) eingebracht, Puffer oder Lösungsmittel wird in den Elektrodezonen bereitgestellt, ein elektrisches Potenzial wird an den elektrischen Feldbereich angelegt, was eine Bewegung von Wasser aus der Probe zu einer benachbarten Elektrodenzone bedingt. Die Probe wird dadurch durch das Heraustreiben von Flüssigkeit aus der Probe konzentriert. Die barrierebildende Membran verhindert im Wesentlichen eine Flüssigkeitsvolumenbewegung in die Probe, und der Elektrophoresevorgang bedingt, dass sich Wasser und Salze aus der Probe herausbewegen.

Es ist auch machbar, eine Probe in eine (oder beide) der Elektrodenzonen einzubringen und während des Anlegens des Spannungspotenzials die Bewegung von einer oder mehr als einer Verbindung aus der Probe in das benachbarte Zwischenvolumen zu bedingen.

Die Vorrichtung kann weiterhin umfassen: Mittel, die angepasst sind, um wenigstens über den elektrischen Feldbereich ein ausgewähltes elektrisches Potenzial anzulegen. Bei dieser Form wird eine Energieversorgung bereitgestellt oder in die Vorrichtung integriert. Typischerweise ist die Vorrichtung über irgendein geeignetes elektrisches Verbindungsmittel mit einer externen Energieversorgung verbunden.

In einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Elektrophoresevorrichtung bereit, umfassend:

  • (a) eine erste Elektrode in einer ersten Elektrodenzone;
  • (b) eine zweite Elektrode in einer zweiten Elektrodenzone, wobei die erste Elektrode relativ zur zweiten Elektrode so angeordnet ist, dass sie angepasst ist, um dazwischen ein elektrisches Feld in einem elektrischen Feldbereich nach Anlegen eines elektrischen Potenzials zwischen der ersten und der zweiten Elektrode zu erzeugen;
  • (c) eine erste Membran, die in dem elektrischen Feldbereich angeordnet ist;
  • (d) eine zweite Membran, die zwischen der ersten Elektrodenzone und der ersten Membran so angeordnet ist, um dazwischen ein erstes Zwischenvolumen zu definieren;
  • (e) eine dritte Membran, die zwischen einer zweiten Elektrodenzone und der ersten Membran so angeordnet ist, um ein zweites Zwischenvolumen dazwischen zu definieren; wobei das erste Zwischenvolumen von der ersten Elektrodenzone durch die zweite Membran getrennt ist und das zweite Zwischenvolumen von der zweiten Elektrodenzone durch die dritte Membran getrennt ist; und wobei wenigstens eine Membran eine Barriere ist, die in der Lage ist, eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes zu steuern;
  • (f) Mittel, die angepasst sind, um Flüssigkeit zu der ersten Elektrodenzone, zur zweiten Elektrodenzone und zum zweiten Zwischenvolumen zu übertragen;
  • (g) Mittel, die angepasst sind, um einen Probenbestandteil zum ersten Zwischenvolumen zu übertragen, wobei nach Anlegen des elektrischen Potenzials eine oder mehr als eine Komponente veranlasst wird, sich aus dem Probenbestandteil durch wenigstens eine Membran zu einer benachbarten Elektrodenzone oder einem Zwischenvolumen zu bewegen und wenigstens eine Membran eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung in oder aus der Probe steuert.

In einer bevorzugten Form umfasst die Vorrichtung weiterhin:

  • (h) Mittel, die angepasst sind zum Abführen von in der Vorrichtung erzeugter Wärme.

Bevorzugterweise werden Probe und Flüssigkeit durch Wärmeaustauscher geführt, um die durch die Vorrichtung während der Elektrophorese erzeugte Wärme abzuführen.

Die Vorrichtung kann weiterhin umfassen:

Mittel, die so angepasst sind, dass sie wenigstens über den elektrischen Feldbereich ein ausgewähltes elektrisches Potenzial anlegen. Bei dieser Form wird eine Energieversorgung bereitgestellt oder in die Vorrichtung integriert. Typischerweise wird die Vorrichtung über irgendein geeignetes elektrisches Verbindungsmittel mit einer externen Energieversorgung verbunden.

In einer zweiten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Elektrophoresesystem bereit, umfassend:

  • (a) eine erste Elektrode in einer ersten Elektrodenzone;
  • (b) eine zweite Elektrode in einer zweiten Elektrodenzone, wobei die erste Elektrode relativ zur zweiten Elektrode so angeordnet ist, dass sie angepasst ist, um dazwischen ein elektrisches Feld in einem ersten elektrischen Feldbereich nach Anlegen eines ersten elektrischen Potenzials zwischen der ersten und der zweiten Elektrode zu erzeugen;
  • (c) eine erste Membran, die in dem elektrischen Feldbereich angeordnet ist;
  • (d) eine zweite Membran, die zwischen der ersten Elektrodenzone und der ersten Membran so angeordnet ist, um dazwischen ein erstes Zwischenvolumen zu definieren;
  • (e) eine dritte Membran, die zwischen einer zweiten Elektrodenzone und der ersten Membran so angeordnet ist, um dazwischen ein zweites Zwischenvolumen zu definieren;
  • (f) Mittel, die angepasst sind, um Flüssigkeit zu der ersten Elektrodenzone, zur zweiten Elektrodenzone und zum zweiten Zwischenvolumen zu übertragen;
  • (g) Mittel, die angepasst sind, um einen Probenbestandteil zu dem ersten oder zweiten Zwischenvolumen zu übertragen; wobei nach Anlegen des ersten elektrischen Potenzials eine oder mehr als eine Komponente veranlasst wird, sich aus dem Probenbestandteil durch wenigstens eine Membran zur benachbarten anderen des ersten oder zweiten Zwischenvolumens zu bewegen;
  • (h) eine dritte Elektrode in einer dritten Elektrodenzone;
  • (i) eine vierte Elektrode in einer vierten Elektrodenzone, wobei die dritte Elektrode relativ zur vierten Elektrode so angeordnet ist, dass sie angepasst ist, um dazwischen ein elektrisches Feld in einem zweiten elektrischen Feldbereich nach Anlegen eines zweiten elektrischen Potenzials zwischen der dritten und vierten Elektrode zu erzeugen;
  • (j) eine vierte Membran, die im zweiten elektrischen Feldbereich angeordnet ist;
  • (k) eine fünfte Membran, die zwischen der dritten Elektrodenzone und der vierten Membran so angeordnet ist, dass sie ein drittes Zwischenvolumen dazwischen definiert; wobei das vierte Zwischenvolumen von der dritten und vierten Elektrodenzone durch die vierte und fünfte Membran getrennt ist, und wobei wenigstens eine der vierten oder fünften Membran eine Barriere ist, die in der Lage ist, eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes zu steuern;
  • (l) Mittel, die angepasst sind, um Flüssigkeit zur dritten Elektrodenzone und zur vierten Elektrodenzone zu übertragen; und
  • (m) Mittel, die angepasst sind, um einen Probenbestandteil aus dem ersten oder zweiten Zwischenvolumen zu dem dritten Zwischenvolumen zu übertragen; wobei nach Anlegen des zweiten elektrischen Potenzials bedingt wird, dass sich Flüssigkeit aus dem Probenbestandteil im dritten Zwischenvolumen durch wenigstens die vierte oder fünfte Membran zu einer benachbarten Elektrodenzone bewegt; wobei die Barrieremembran eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung in die Probe verhindert.
  • In einer bevorzugten Form umfasst die Vorrichtung weiterhin:
  • (n) Mittel, die zum Abführen der in der Vorrichtung erzeugten Wärme angepasst sind.

Bevorzugterweise werden Probe und Flüssigkeit durch Wärmeaustauscher geführt, um während der Elektrophorese durch die Vorrichtung erzeugte Wärme abzuführen.

Die Vorrichtung kann weiterhin umfassen:

Mittel, die angepasst sind, um ein erstes ausgewähltes elektrisches Potenzial über den ersten elektrischen Feldbereich anzulegen; und

Mittel, die angepasst sind, um ein zweites ausgewähltes elektrisches Potenzial über den zweiten elektrischen Feldbereich anzulegen. Bei dieser Form wird eine oder mehr als eine Energieversorgung bereitgestellt oder in die Vorrichtung integriert. Typischerweise ist die Vorrichtung über irgendein geeignetes elektrisches Verbindungsmittel mit einer externen Energieversorgung so verbunden, dass zwei getrennte elektrische Potenziale angelegt werden können.

In einer weiteren bevorzugten Form sind einige der Membranen Elektrophorese-Trennmembranen, und andere Membranen sind Begrenzungsmembranen, die definierte Porengrößen aufweisen. Bevorzugterweise sind die Begrenzungsmembranen zwischen den Elektrodenzonen und einem benachbarten Zwischenvolumen angeordnet. Wenigstens eine der Begrenzungsmembranen ist die induzierbare elektro-endo-osmotische Membran, die die wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes steuert.

Die Elektrophorese-Trennmembranen sind bevorzugterweise aus Polyacrylamid hergestellt und weisen einen Molekülmassenausschluss von wenigstens 3 kDa auf. Der Molekülmassenausschluss der Membran wird von der gerade bearbeiteten Probe, den anderen Molekülen in der Probenmischung und der Art der ausgeführten Trennung abhängen.

Wenigstens eine Begrenzungsmembran ist bevorzugterweise ebenfalls aus Polyacrylamid hergestellt. Der Molekülmassenausschluss der Begrenzungsmembran wird von der gerade bearbeiteten Probe, den anderen Molekülen in der Probenmischung und der Art der ausgeführten Trennung abhängen.

Die induzierbare elektro-endo-osmotische Membran ist bevorzugterweise eine Zellulosetriacetat (CTA)-Membran. Es wird anerkannt werden, dass die induzierbare elektro-endo-osmotische Membran aus jedem anderen geeigneten Membranmaterial wie mit Glutaraldehyd quervernetztem Poly(vinylalkohol) (PVAI+glut) hergestellt sein kann.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben festgestellt, dass eine CTA-Membran, die einen nominalen Molekülmassenausschluss von 5, 10 oder 20 kDa aufweist, für die Verwendung in der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung besonders geeignet ist.

Der Kathodenzone und der Anodenzone werden durch ein jegliches geeignetes Pumpenmittel geeignete Elektrolyt- oder Pufferlösungen zugeführt. Eine zu verarbeitende Probe wird dem ersten Zwischenvolumen oder zweiten Zwischenvolumen (wenn vorhanden) durch ein jegliches geeignetes Pumpenmittel direkt zugeführt.

Bevorzugterweise sind die Zonen und das Zwischenvolumen/die Zwischenvolumina so konfiguriert, dass man der entsprechenden Flüssigkeit/dem entsprechenden Puffer und Probenlösungen zu fließen erlaubt, wodurch Ströme gebildet werden. Auf diese Weise können große Volumina rasch und effizient verarbeitet werden. Die Lösungen werden typischerweise durch die Zonen und das Zwischenvolumen/die Zwischenvolumina aus entsprechenden Reservoiren durch geeignete Pumpenmittel bewegt oder rezirkuliert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden peristaltische Pumpen als Pumpenmittel zum Bewegen der Probe, der Puffer oder der Flüssigkeiten verwendet.

Elektrodenpuffer oder Elektrolyte und Probenpuffer können ein jeder geeignete Puffer oder Elektrolyt sein. Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf TrisBorat, Hepes/Imidazol, GABA/Essigsäure und Hepes/Histidin-Puffer.

Die vorliegende Erfindung ist zur Trennung oder Behandlung einer jeden Verbindung geeignet, die in der Lage ist, eine Ladung oder ein definiertes Molekülgewicht aufzuweisen. Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf biologische Verbindungen wie Peptide, Proteine, Nukleinsäuren und dergleichen.

In einer Ausführungsform werden der Elektrodenpuffer, andere Puffer und Probenlösungen durch ein jedes geeignete Mittel gekühlt, um sicherzustellen, dass keine Inaktivierung von Mikromolekülen, Verbindungen, Makromolekülen oder anderen Probenbestandteilen während des Elektrophoresevorgangs stattfindet, und um eine erwünschte Temperatur der Vorrichtung aufrechtzuerhalten, während sie verwendet wird.

Zum Sammeln und/oder Konzentrieren von Probenbestandteilen wird bevorzugterweise in wenigstens einem der Volumina oder Ströme, die irgendwelche getrennte Bestandteile oder Moleküle enthalten, gesammelt und durch ein geeignetes Lösungsmittel ersetzt, um sicherzustellen, dass die Elektrophorese auf effiziente Weise weiterlaufen kann.

Bei der Benutzung wird eine Probe in das erste Zwischenvolumen (auch Strom 1 genannt) eingebracht, Puffer oder Lösungsmittel werden für die Elektrodenzonen und das zweite Zwischenvolumen (Strom 2) bereitgestellt, an den elektrischen Feldbereich wird ein elektrisches Potenzial angelegt, was bedingt, dass sich wenigstens ein Bestandteil in der Probe zum Puffer/Lösungsmittel in der benachbarten Elektrodenzone oder zum benachbarten zweiten Zwischenvolumen bewegt. Die barrierebildende Membran verhindert im Wesentlichen die Bewegung von Flüssigkeit in die Probe.

Es wird anerkannt werden, dass die Abfolge der Zwischenvolumina umgedreht werden kann, wobei eine Probe in das zweite Zwischenvolumen (Strom 2) eingebracht wird, Puffer oder Lösungsmittel in den Elektrodenzonen und im ersten Zwischenvolumen bereitgestellt wird, ein elektrisches Potenzial an den elektrischen Feldbereich angelegt wird, was bedingt, dass sich wenigstens ein Bestandteil der Probe zu der benachbarten Elektrodenzone oder zum benachbarten ersten Zwischenvolumen (Strom 1) bewegt.

Es ist auch machbar, eine Probe in eine (oder beide) der Elektrodenzonen einzubringen, und die Bewegung von einer oder mehr als einer Verbindung in eines oder mehr als eines der Zwischenvolumina während des Anlegens der Spannungspotenzials zu bedingen.

Die erste Membran ist bevorzugterweise eine Elektrophorese-Trennmembran, die Polyacrylamid (PA) umfasst und einen definierten Molekülmassenausschluss aufweist. Bevorzugterweise weist die Elektrophorese-Trennmembran einen Molekülmassenausschluss von etwa 1 kDa bis etwa 2000 kDa auf. Die Auswahl des Molekülmassenausschlusses der Trennmembran wird von der gerade bearbeiteten Probe und den anderen Molekülen in der Mischung abhängen. Es wird jedoch anerkannt werden, dass andere Membranenchemien oder -bestandteile für die vorliegende Erfindung verwendet werden können.

Wenigstens eine der zweiten und dritten Membran ist eine Begrenzungsmembran, die bevorzugterweise aus Polyacrylamid hergestellt ist und üblicherweise einen Molekülmassenausschluss aufweist, der geringer als der der Trennmembran ist, bevorzugterweise von etwa 1 kDa bis etwa 1000 kDa. Die Auswahl des Molekülmassenausschlusses der Begrenzungsmembran wird von der gerade bearbeiteten Probe und der Größe der zu entfernenden Makromoleküle abhängen. Die Begrenzungsmembran kann den gleichen Molekülmassenausschluss oder einen anderen Ausschluss als den der die Barriere bildenden Membranen aufweisen.

In einer bevorzugten Form sind die Membranen, die das erste und zweite Zwischenvolumen bilden, in der Form einer Patrone oder Kassette bereitgestellt, die zwischen den Elektrodenzonen der Vorrichtungen angeordnet ist. Die Konfiguration der Patrone ist bevorzugterweise ein Gehäuse, wobei die erste Membran zwischen der zweiten und dritten Membran angeordnet ist und somit die benötigten Zwischenvolumina bildet.

Bevorzugterweise ist die Patrone oder Kassette aus der Elektrophoresevorrichtung herausnehmbar und so angepasst, dass sie die Patrone enthält oder aufnimmt.

Die Patrone kann auch eine oder mehr als eine der Elektroden umfassen.

Der Abstand zwischen den Elektroden hat eine Wirkung auf die Trennung oder Bewegung der Probenbestandteile durch die Membranen. Je kürzer der Abstand zwischen den Elektroden, desto schneller ist die elektrophoretische Bewegung der Bestandteile. Von einem Abstand von etwa 6 mm wurde festgestellt, dass er für eine Vorrichtung im Labormaßstab geeignet ist. Für Versionen im größeren Maßstab wird der Abstand von der Anzahl und Art der Trennmembranen, der Größe und des Volumens der Kammern für Proben, den Puffern und getrennten Produkten abhängen. Bevorzugte Abstände lägen in der Größenordnung von etwa 6 mm bis etwa 10 cm. Der Abstand wird mit der an die Vorrichtung angelegten Spannung in Beziehung stehen.

Die Wirkung des elektrischen Feldes beruht auf der Gleichung: e = V/d (e = elektrisches Feld, V = Spannung, d = Abstand).

Daher gilt, dass die Trennung umso schneller abläuft, je kleiner der Abstand zwischen den Elektroden ist. Bevorzugterweise sollte der Abstand zwischen den Elektroden verringert werden, um die elektrische Feldstärke zu erhöhen und dadurch die Übertragungsgeschwindigkeiten durch die Membran weiter zu verbessern.

Die Fließgeschwindigkeit der Probe/des Puffers/der Flüssigkeit übt einen Einfluss auf die Trennung der Bestandteile aus. In Abhängigkeit von der Konfiguration der Vorrichtung und der Natur und des Volumens der zu trennenden Probe werden Geschwindigkeiten in Millilitern pro Minute bis zu Litern pro Minute verwendet. Zurzeit beträgt die bevorzugte Fließgeschwindigkeit bei einer Vorrichtung im Labormaßstab etwa 20 ± 5 mL/min. Jedoch werden bei den verschiedenen Trennsystemen Fließgeschwindigkeiten von etwa 0 mL/min bis etwa 50 000 mL/min verwendet. Die maximale Fließgeschwindigkeit liegt in Abhängigkeit von dem Pumpenmittel und der Größe der Vorrichtung noch höher. Die Auswahl der Fließgeschwindigkeit hängt von dem zu übertragenden Produkt, der Übertragungseffizienz, der Vor- und Nachanordnung hinsichtlich anderer Anwendungen ab.

Die Auswahl oder das Anlegen der Spannung und/oder des angelegten Stromes schwankt in Abhängigkeit von der Trennung. Typischerweise werden bis zu mehrere tausend Volt verwendet, aber die Auswahl und Änderung der Spannung wird von der Konfiguration der Vorrichtung, den Puffern und der zu trennenden Probe abhängen. Bei einer Vorrichtung im Labormaßstab beträgt die bevorzugte Spannung etwa 250 V. Jedoch werden in Abhängigkeit von der Übertragung, der Effizienz, der Maßstabserhöhung und dem besonderen Verfahren etwa 0 V bis etwa 5 000 V verwendet. Höhere Spannungen werden in Abhängigkeit von der Vorrichtung und der zu behandelnden Probe ebenfalls in Betracht gezogen.

Optional kann das elektrische Potenzial periodisch gestoppt und/oder umgekehrt werden, um die Bewegung eines Bestandteils, der in eine Membran eingetreten ist, zurück in das Volumen oder den Strom, aus dem er kam, zu bedingen, während im Wesentlichen nicht bedingt wird, dass irgendwelche Bestandteile, die vollständig durch die Membran hindurchgewandert sind, durch die Membran zurückwandern.

Die Umkehr des elektrischen Potenzials ist eine Option, aber eine Ruheperiode ist eine andere Alternative. Ruhe (eine Periode ohne ein angelegtes elektrisches Potenzial) ist ein optionaler Schritt, der eine optionale Umkehr des elektrischen Potenzials ersetzen kann oder vor oder nach einer optionalen Umkehr des elektrischen Potentials enthalten sein kann. Diese Ruhetechnik kann oft bei spezifischen Trennanwendungen als eine Alternative oder Ergänzung zum Umkehren des Potenzials eingesetzt werden.

Aus Gründen der Bequemlichkeit wird das erste Zwischenvolumen oder der erste Strom als Strom 1 bezeichnet, und das zweite Zwischenvolumen oder der zweite Strom wird als Strom 2 bezeichnet. Typischerweise wird die Probe in Strom 1 eingebracht und es wird bedingt, dass sich die Bestandteile durch die Trennmembran in Strom 2 bewegen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Elektroden aus einem Titannetz hergestellt, das mit Platin beschichtet ist. Es wird jedoch anerkannt werden, dass andere Materialien und Konfigurationen verwendet werden können.

Bei der Verwendung wird ein Puffer oder ein anderes geeignetes Lösungsmittel durch die Elektrodenzonen zirkuliert, und eine flüssige Probe wird in wenigstens eines des ersten und zweiten Zwischenvolumina eingebracht. Wenn ein elektrisches Potenzial oder Feld über die Elektroden an der Vorrichtung angelegt wird, wird bedingt werden, dass sich einige Bestandteile in der Probe durch die Membran in das benachbarte Zwischenvolumen oder in eine Elektrodenzone bewegen. Die induzierbare elektro-endo-osmotische Membran verhindert oder steuert eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung zwischen dem Zwischenvolumen und der Elektrodenzone und verhindert dadurch eine unerwünschte Verdünnung der Probe oder der abgetrennten Verbindung während des Trennvorgangs.

Die Membranen können in der Form einer Mehrschicht- oder Sandwich-Anordnung hergestellt sein. Die Dicke der Membranen kann eine Wirkung auf die Trennung oder Bewegung der Verbindungen haben. Es wurde festgestellt, dass die Bewegung umso schneller und effizienter abläuft, je dünner die Membran ist.

In einem zweiten Aspekt gemäß Anspruch 11 stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Konzentrieren einer Probe dar. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren:

  • (a) Bereitstellen einer Elektrophoresevorrichtung gemäß des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung;
  • (b) Hinzugeben von Puffer oder Elektrolyt zu der ersten und zweiten Elektrodenzone;
  • (c) Hinzugeben der Probe zum ersten Zwischenvolumen;
  • (d) Anlegen eines elektrischen Potenzials zwischen den Elektroden, was bedingt, dass sich Flüssigkeit in der Probe durch eine Membran in eine benachbarte Elektrodenzone bewegt; und optional
  • (f) Erhalten der konzentrierten Probe; wobei die Barrieremembrane eine Flüssigkeitsvolumenbewegung aus der Probe heraus erlaubt.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, um wenigstens einen Bestandteil aus einer Probe herauszubewegen, während die Flüssigkeitsvolumenbewegung gesteuert wird, wobei das Verfahren umfasst:

  • (a) Bereitstellen einer Elektrophoresevorrichtung gemäß der ersten Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung;
  • (b) Hinzugeben von Puffer oder Elektrolyt zu der ersten und zweiten Elektrodenzone;
  • (c) Hinzugeben der Probe zu dem ersten Zwischenvolumen;
  • (d) Hinzugeben von Puffer oder Flüssigkeit zum zweiten Zwischenvolumen;
  • (e) Anlegen eines elektrischen Potenzials zwischen den Elektroden, was bedingt, dass sich wenigstens eine Verbindung aus der Probe heraus durch eine Membran in eine benachbarte Elektrodenzone oder Zwischenvolumen bewegt; und optional
  • (f) Sammeln der Verbindung, die sich aus der Probe bewegt hat; wobei die Barrieremembran eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung in oder heraus aus einem oder mehr als einem Zwischenvolumen steuert.

In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, um wenigstens einen Bestandteil aus einer Probe herauszubewegen, während die Flüssigkeitsvolumenbewegung gesteuert wird, wobei das Verfahren umfasst:

  • (a) Bereitstellen einer Elektrophoresevorrichtung gemäß der zweiten Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung;
  • (b) Hinzugeben von Puffer oder Elektrolyt zu der ersten, zweiten, dritten und vierten Elektrodenzone;
  • (c) Hinzugeben der Probe zum ersten Zwischenvolumen;
  • (d) Hinzugeben von Puffer oder Flüssigkeit zum zweiten Zwischenvolumen;
  • (e) Anlegen eines ersten elektrischen Potenzials zwischen der ersten und zweiten Elektrode, was bedingt, dass sich wenigstens eine Verbindung aus der Probe durch eine Membran ins zweite Zwischenvolumen bewegt;
  • (f) Überführen einer Probe, die die Verbindung enthält, aus dem zweiten Zwischenvolumen zu dem dritten Zwischenvolumen;
  • (g) Anlegen eines zweiten elektrischen Potenzials zwischen der dritten und vierten Elektrode, was bedingt, dass sich Flüssigkeit in dem dritten Zwischenvolumen durch eine Membran in eine benachbarte Elektrodenzone bewegt, wodurch die Verbindung in der Probe aufkonzentriert wird; und optional
  • (h) Sammeln der konzentrierten Probe; wobei die Barrieremembran eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung in oder heraus aus dem dritten Zwischenvolumen steuert.

Die Barrieremembran kann eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung in eines oder mehr als eines der Zwischenvolumina verhindern oder kann die Bewegung der Flüssigkeit aus einem Zwischenvolumen heraus bedingen.

In einer bevorzugten Form sind zwei Vorrichtungen in einer Weise verbunden, dass sie die Flüssigkeitsvolumenbewegung in eines oder mehr als eines der Zwischenvolumina weiter steuern oder verhindern können. Die erste Vorrichtung ist gemäß der ersten Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung mit oder ohne die Barrieremembran konfiguriert und funktioniert so, dass sie eine oder mehr als eine Verbindung der Wahl trennt. Die zweite Vorrichtung kann gemäß des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung konfiguriert sein und erlaubt die Konzentrierung der getrennten Verbindung. Bevorzugterweise wird das an jede Vorrichtung angelegte elektrische Potenzial getrennt gesteuert. In einer bevorzugten Form steht das zweite Zwischenvolumen der ersten Vorrichtung mit dem ersten Zwischenvolumen der zweiten Vorrichtung in Flüssigverbindung. Bei der Verwendung und nachdem bedingt wurde, dass sich die zu trennende Verbindung zum zweiten Zwischenvolumen der ersten Vorrichtung bewegt, wird sie dann zum ersten Zwischenvolumen der zweiten Vorrichtung übertragen, was bedingt, dass sich unerwünschte Flüssigkeit aus der getrennten Verbindung herausbewegt. Dieses duale Vorrichtungssystem fungiert als weiterer Probenkonzentrator ohne einen wesentlichen Verlust an Flüssigkeit oder Probe.

In einer weiteren bevorzugten Form sind die beiden Vorrichtungen in einer Weise verbunden, dass sie die Flüssigkeitsvolumenbewegung in eines oder mehr als eines der Zwischenvolumina weiter steuern oder verhindern. Die erste Vorrichtung ist gemäß der ersten Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung mit oder ohne Barrieremembrane konfiguriert und funktioniert so, dass eine oder mehr als eine Verbindung der Wahl abgetrennt wird. Die zweite Vorrichtung ist gemäß des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung konfiguriert und erlaubt die Konzentrierung der Probe während der Elektrophorese. Bevorzugterweise wird das elektrische Potenzial, das an einer jeden Vorrichtung angelegt ist, getrennt gesteuert. In dieser bevorzugten Form besteht zwischen dem ersten Zwischenvolumen der ersten Vorrichtung, das die Probe enthält, und dem ersten Zwischenvolumen der zweiten Vorrichtung eine Flüssigkeitsverbindung. Bei der Verwendung wird die Probe zwischen den beiden Vorrichtungen zirkuliert, um das Aufstauen von Flüssigkeit, das während der Elektrophorese in der ersten Vorrichtung bedingt wird, zu beseitigen oder zu verringern. Die zu trennende Verbindung wird veranlasst, sich zum Sammeln zum zweiten Zwischenvolumen der ersten Vorrichtung zu bewegen. Dieses duale Vorrichtungssystem fungiert ohne einen wesentlichen Verlust an Flüssigkeit oder Probe als weiterer Probenkonzentrator.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der Vorrichtung gemäß des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung für die Trennung oder Elektrophoresebearbeitung von einer oder mehr als einer Verbindung aus einer Probe.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der Vorrichtung gemäß der zweiten Ausführungsform des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung für die Trennungs oder der Elektrophoresevbearbeitung von einer oder mehr als einer Verbindung aus einer Probe.

GradiflowTM ist eine Marke von Gradipore Limited, Australien.

Damit die vorliegende Erfindung besser verstanden werden kann, werden bevorzugte Formen unter Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen und Beispiele beschrieben werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1 zeigt ein schematisches Diagramm einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. 1A zeigt eine Anordnung von Elektroden, Elektrodenzonen und einem Zwischenvolumen. 1B zeigt die Anordnung von zwei Membranen relativ zu den Elektroden.

2 zeigt ein schematisches Diagramm einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. 2A zeigt eine Anordnung von Elektroden, Elektrodenzonen und den ersten und zweiten Zwischenvolumen. 2B zeigt die Anordnung von drei Membranen relativ zu den Elektroden.

3 zeigt ein schematisches Diagramm einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. 3A zeigt eine Anordnung von Elektroden, Elektrodenzonen und dem ersten, zweiten und dritten Zwischenvolumen. 3B zeigt die Anordnung von fünf Membranen relativ zu zwei Sätzen Elektroden.

4 zeigt eine PAGE von CTA-Kalibrierungsexperimenten.

5 zeigt Endoosmose-Geschwindigkeiten mit CTA-Membranen.

6 zeigt einen Vergleich der CTA-Orientierung und der endo-osmotischen Geschwindigkeit.

7 zeigt die Geschwindigkeit der Volumenentfernung infolge von Elektroendoosmose unter Verwendung von CTA-Membranen.

8 zeigt die Wiedergewinnung von Rinderserumalbumin (BSA) unter Spannungswechsel.

9 zeigt die Geschwindigkeit der Volumenentfernung aufgrund von Elektroendoosmose mit PVAI-Membranen.

10 zeigt die Geschwindigkeit der Volumenentfernung aufgrund von Elektroendoosmose.

11 zeigt die Leitungsverbindung von zwei Vorrichtungen, die eine Konzentrierungsmaschine für Strom 1 zur Steuerung von Endoosmose beinhalten.

12 zeigt den Vergleich der endo-osmotischen Geschwindigkeit und der prozentualen Wiedergewinnung von Fibrinogen.

13 zeigt eine PAGE-Analyse der gleichzeitigen Trennung und Konzentrierung von Rinder-Prionenprotein (PrP) aus Rinderhirn-Homogenat unter Verwendung einer Elektrophorese-Technologie auf der Grundlage von Membranen und einer PVAI-Membran. Teil A: SDS-PAGE der Proben aus dem Elektrophoreselauf; Teil B: Western Blot der Proben aus dem Elektrophoreselauf unter Verwendung von anti-PrP R029 (Prionics, Schweiz). S10Strom 1 bei 0 min; S1180Strom 1 bei 180 min; S20Strom 2 bei 0 min; S2180Strom 2 bei 180 min.

14 zeigt eine erste Konfiguration der vorliegenden Erfindung, die die gleichzeitige Konzentrierung und teilweise Reinigung von Proben erlaubt.

15 zeigt eine PAGE-Analyse der Konzentrierung des Einspeisungsstroms mit teilweise Reinigung.

16 zeigt eine PAGE-Analyse eines Stroms, der entfernte Verunreinigungen enthält.

17 zeigt eine zweite Konfiguration der vorliegenden Erfindung, die die gleichzeitige Konzentrierung und Reinigung von Zielprotein bei Abreicherung von Verunreinigungen des Einspeisungsstroms und EEG-Steuerung des Einspeisungsstromvolumens erlaubt.

18 zeigt eine PAGE-Analyse eines Einspeisungsstroms, der im Verlauf des Experimentes konzentriert wurde, aber auch hinsichtlich verunreinigender Proteine abgereichert wurde. Die Abreicherung von Verunreinigungen erhöht die Übertragung des Zielproteins zum Produktstrom durch eine Vereinfachung der Inhalte des Einspeisungsstroms.

19 zeigt eine PAGE-Analyse von Zielprotein, das in Strom 2 gereinigt und konzentriert wurde. Die Übertragungsgeschwindigkeit an den Produktstrom wurde durch das Konzentrieren des Einspeisungsstroms aufrechterhalten. Als die Konzentration des Zielmoleküls im Einspeisungsstrom abgereichert war, verlangsamte sich die Übertragungsgeschwindigkeit, es sei denn, das Einspeisungsstromvolumen wurde verringert. Diese Volumenverringerung könnte zu einer Störung durch die erhöhte Konzentration an Verunreinigungen führen, es sei denn, die Menge der Verunreinigungen im Einspeisestrom ist auch abgereichert.

20 zeigt ein schematisches Diagramm einer dritten Konfiguration der vorliegenden Erfindung, wobei das Zielmolekül an den zweiten Strom übertragen und der Einspeisungsstrom konzentriert wird.

21 zeigt ein schematisches Diagramm einer vierten Konfiguration der vorliegenden Erfindung, die die Übertragung des Produktes an Strom 1 während des Konzentrierens erlaubt und optional das Reinigen von Strom 2 mit dem Pufferstrom oder einem optionalen dritten Strom.

22 zeigt ein schematisches Diagramm einer fünften Konfiguration der vorliegenden Erfindung, die EEG-Membranen auf beiden Seiten des Einspeisungsstroms verwendet, um die Konzentrierungswirkung zu erhöhen, wobei das MMCO der EEO-Membranen so ausgewählt ist, dass die Übertragung der Verunreinigungen weg von dem Zielprotein erlaubt wird, das im zentralen Einspeisungsstroms gehalten und konzentriert wird.

23 zeigt ein schematisches Diagramm einer sechsten Konfiguration der vorliegenden Erfindung, die zwei membranbasierten Elektrophoresevorrichtungen für das getrennte Konzentrieren und Reinigen verwendet.

24 zeigt ein schematisches Diagramm einer siebten Konfiguration der vorliegenden Erfindung, wobei das Zielmolekül im Einspeisungsstrom verbleibt und konzentriert wird.

Modus/Modi zum Ausführen der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist auf eine Elektrophoresetechnologie auf der Grundlage von Membranen gerichtet, um die Steuerung von Flüssigkeitsvolumenübertragung/Endoosmose zu unterstützen. In einer Ausführung, wie sie in 1A gezeigt ist, umfasst die Elektrophoresevorrichtung 100 eine erste Elektrodenzone 111 und eine zweite Elektrodenzone 112, wobei die erste Elektrodenzone 111 und die zweite Elektrodenzone 112 jeweils eine Elektrode 113 bzw. 114 enthalten und die zweite Elektrodenzone 112 relativ zur ersten Elektrodenzone 111 so angeordnet ist, dass sie angepasst ist, um dazwischen nach Anlegung eines ausgewählten elektrischen Potenzials zwischen den Elektroden 113 bzw. 114 ein elektrisches Feld in einem elektrischen Feldbereich 115 zu erzeugen. Die Vorrichtung 100umfasst weiterhin ein erstes Zwischenvolumen 116, das durch eine erste Membran 117, die in dem elektrischen Feldbereich 115 angeordnet ist, und eine zweite Membran 118, die zwischen der ersten Elektrodenzone 111 und der ersten Membran 117 angeordnet ist, definiert ist. Das erste Zwischenvolumen 116 ist von der ersten Elektrodenzone 111 und der zweiten Elektrodenzone 112 durch die erste Membran 117 und die zweite Membran 118 getrennt. Wenigstens eine der Membranen ist eine Barrieremembran, die in der Lage ist, eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes zu steuern. In 1B ist die Barrieremembrane als die erste Membran 117 dargestellt. Es wird anerkannt werden, dass die zweite Membran 118 die Barrieremembrane bilden kann. In 1 ist die erste Elektrode 113 ausschließlich aus Bequemlichkeit als eine Kathode dargestellt, und die zweite Elektrode 114 ist ausschließlich aus Bequemlichkeit als Anode dargestellt. Die Polarität der Elektroden kann umgekehrt werden, wobei die erste Elektrode 113 eine Anode und die zweite Elektrode 114 eine Kathode ist.

Die Vorrichtung 100 umfasst die Mittel 119, 120, 121 zur Übertragung von Flüssigkeiten zu der ersten Elektrodenzone 111, der zweiten Elektrodenzone 112 und dem ersten Zwischenvolumen 116, und wenigstens eine der Flüssigkeiten enthält eine Probenkomponente. Die Vorrichtung 100 kann weiterhin Mittel umfassen zum Anlegen eines ausgewählten elektrischen Potenzials wenigstens über den elektrischen Feldbereich. Das Anlegen des ausgewählten elektrischen Potenzials bedingt, dass wenigstens ein Teil einer Flüssigkeit innerhalb der Probenbestandteile durch wenigstens eine Membran in eine benachbarte Elektrodenzone wandert, und dass wenigstens ein Teil der Probenbestandteile durch wenigstens eine Membran in das erste Zwischenvolumen wandert. Die Barrieremembranen kontrolliert eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung in das erste Zwischenvolumen hinein und aus diesem heraus, so dass ein teilweise konzentriertes Produkt gesammelt wird und/oder im ersten Zwischenvolumen verbleibt.

Bei der Verwendung wird eine Probe in das erste Zwischenvolumen 116 (auch als Strom 1 bezeichnet) eingebracht, Puffer oder Lösungsmittel sind in den Elektrodenzonen 111 bzw. 112 bereitgestellt, ein elektrisches Potenzial wird an den elektrischen Feldbereich angelegt, was die Bewegung von Wasser aus der Probe heraus in eine benachbarte Elektrodenzone bedingt. Die Probe wird dadurch konzentriert, dass Flüssigkeit aus der Probe ausgetrieben wird. Die Barrieremembran verhindert im Wesentlichen eine Flüssigkeitsvolumenbewegung in die Probe, und der Elektrophoresevorgang bedingt, dass sich Wasser und Salze aus der Probe herausbewegen.

Es ist auch machbar, die Probe in eine der (oder beide) Elektrodenzonen einzubringen und während des Anlegens des Spannungspotenzials die Bewegung von einer oder mehr als einer Verbindung aus der Probe in das benachbarte Zwischenvolumen zu bedingen.

In einer anderen Ausführungsform umfasst die Elektrophoresevorrichtung 200, wie in 2A gezeigt ist, eine erste Elektrodenzone 211 und eine zweite Elektrodenzone 212, wobei die erste Elektrodenzone 211 und die zweite Elektrodenzone 212 jeweils eine Elektrode 213 bzw. 214 umfassen. Die zweite Elektrodenzone 212 ist relativ zur ersten Elektrodenzone 211 so angeordnet, dass sie angepasst ist, um nach Anlegen eines ausgewählten elektrischen Potenzials zwischen den Elektroden 213 bzw. 214 ein elektrisches Feld in einem elektrischen Feldbereich 215 zu erzeugen. Die Vorrichtung 200 weist ein erstes Zwischenvolumen 216 und ein zweites Zwischenvolumen 226 auf. Das erste Zwischenvolumen 216 ist durch eine erste Membran 217, die in einem elektrischen Feldbereich 215 angeordnet ist, und durch eine zweite Membran 218, die zwischen der ersten Elektrodenzone 211 und der ersten Membran 217 angeordnet ist, definiert. Das zweite Zwischenvolumen 226 ist durch eine erste Membran 217 und eine dritte Membran 222 definiert, die zwischen der zweiten Elektrodenzone 212 und der ersten Membran 217 angeordnet ist. Das erste Zwischenvolumen 216 ist von der ersten Elektrodenzone 211 durch die zweite Membran 218 getrennt, und das zweite Zwischenvolumen 226 ist von der zweiten Elektrodenzone 212 durch die dritte Membran 222 getrennt. Wenigstens eine der ersten, zweiten und dritten Membran 217, 218, 222 ist eine Barrieremembrane, die in der Lage ist, eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes zu steuern. In 2B ist die Barrieremembran als die zweite Membran 218 gezeigt. Es wird anerkannt werden, dass die erste Membran 217 oder die dritte Membran 222 die Barrieremembrane ausbilden können. In 2 ist die erste Elektrode 213 ausschließlich aus Bequemlichkeit als eine Kathode, und die zweite Elektrode 214 ausschließlich aus Bequemlichkeit als eine Anode gezeigt. Die Polarität der Elektroden kann umgekehrt sein, wobei die erste Elektrode 213 eine Anode und die zweite Elektrode 214 eine Kathode ist.

Die Vorrichtung umfasst die Mittel 219, 220, 221 zur Übertragung von Flüssigkeiten zu den Elektrodenzonen 211 bzw. 212 und die Zwischenvolumina 216 bzw. 226, und wenigstens eine der Flüssigkeiten umfasst eine Probenkomponente. Die Vorrichtung 200 kann auch Mittel zum Anlegen eines ausgewählten elektrischen Potentials wenigstens über den elektrischen Feldbereich umfassen. Das Anlegen des elektrischen Potenzials bedingt, dass wenigstens einer von wenigstens einem Teil einer Flüssigkeit innerhalb des Probenbestandteils durch wenigstens eine Membran in eine benachbarte Elektrodenzone wandert, und dass wenigstens ein Teil des Probenbestandteils durch wenigstens eine Membran in wenigstens eines der Zwischenvolumina wandert. Die Barrieremembranen kontrolliert eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung in die Zwischenvolumina und aus diesen heraus, so dass ein teilweise konzentriertes Produkt gesammelt wird und/oder in wenigstens einem der Zwischenvolumina verbleibt.

Bei der Verwendung wird eine Probe in das erste Zwischenvolumen (auch als Strom 1 bezeichnet) eingebracht, Puffer oder Lösungsmittel werden in den Elektrodenzonen und dem zweiten Zwischenvolumen (Strom 2) bereitgestellt, ein elektrisches Potenzial wird an den elektrischen Feldbereich angelegt, was bedingt, dass sich wenigstens eine Komponente in der Probe zum Puffer/Lösungsmittel in der benachbarten Elektrodenzone oder zum benachbarten zweiten Zwischenvolumen bewegt. Die Barrieremembrane verhindert im Wesentlichen die Bewegung von Flüssigkeit in die Probe.

Es wird anerkannt werden, dass die Abfolge der Zwischenvolumina umgekehrt werden kann, wobei eine Probe ins zweite Zwischenvolumen (Strom 2) eingebracht wird, Puffer oder Lösungsmittel in den Elektrodenzonen und im ersten Zwischenvolumen bereitgestellt wird, ein elektrisches Potenzial über den elektrischen Feldbereich angelegt wird, was bedingt, dass sich wenigstens ein Bestandteil in der Probe zur benachbarten Elektrodenzone oder zum benachbarten Zwischenvolumen (Strom 1) bewegt.

Es ist auch machbar, dass eine Probe in eine der (oder beide) Elektrodenzonen eingebracht wird, und während des Anlegens des Spannungspotenzials die Bewegung von einer oder mehr als einer Verbindung in eines oder mehr als eines der Zwischenvolumina bedingt wird.

In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Elektrophoresevorrichtung 300, wie sie in 3 gezeigt ist, eine erste Elektrodenzone 311 und eine zweite Elektrodenzone 312, wobei die erste Elektrodenzone 311 und die zweite Elektrodenzone 312 jeweils eine Elektrode 313 bzw. 314 enthalten und die zweite Elektrodenzone 312 relativ zur ersten Elektrodenzone 311 so angeordnet ist, dass sie angepasst ist, um dazwischen nach Anlegung eines ausgewählten elektrischen Potenzials zwischen den Elektroden 313 bzw. 314 ein elektrisches Feld über einen elektrischen Feldbereich zu erzeugen. Die Vorrichtung 300 weist ein erstes und ein zweites Zwischenvolumen 316 bzw. 326 auf. Das erste Zwischenvolumen 316 ist durch eine erste Membran 317, die in dem elektrischen Feldbereich angeordnet ist, und durch eine zweite Membran 318, die zwischen der ersten Elektrodenzone 311 und der ersten Membran 317 angeordnet ist, definiert. Das zweite Zwischenvolumen 326 ist durch die erste Membran 317 und eine dritte Membran 319, die zwischen der zweiten Elektrodenzone 312 und der ersten Membran 317 angeordnet ist, definiert. Das erste Zwischenvolumen 316 ist durch die zweite Membran 318 von der ersten Elektrodenzone 311 getrennt. Das zweite Zwischenvolumen 326 ist von der zweiten Elektrodenzone 312 durch die dritte Membran 319 getrennt.

Die Vorrichtung umfasst Mittel zur Übertragung von Flüssigkeiten zu den Elektrodenzonen und Zwischenvolumina, und wenigstens eine der Flüssigkeiten enthält einen Probenbestandteil. Die Vorrichtung umfasst weiterhin Mittel zum Anlegen eines ausgewählten elektrischen Potenzials wenigstens über den elektrischen Feldbereich. Das Anlegen des elektrischen Potenzials bedingt, dass wenigstens einer von wenigstens einem Teil einer Flüssigkeit innerhalb der Probenkomponente durch wenigstens eine Membran in eine benachbarte Elektrodenzone wandert, und dass wenigstens ein Teil der Probenbestandteil durch wenigstens eine Membran in wenigstens eines der Zwischenvolumina wandert. Die Barrieremembranen steuert eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung in die Zwischenvolumina und aus diesen heraus, so dass ein teilweise konzentriertes Produkt gesammelt wird und/oder in wenigstens einem der Zwischenvolumina verbleibt.

Die Vorrichtung 300 umfasst weiterhin eine dritte Elektrodenzone 331 und eine vierte Elektrodenzone 332, wobei die dritte Elektrodenzone 331 und die vierte Elektrodenzone 332 jeweils eine Elektrode 323 bzw. 324 enthalten. Die vierte Elektrodenzone 332 ist relativ zur dritten Elektrodenzone so angeordnet, dass sie angepasst ist, um dazwischen nach Anlegen eines ausgewählten elektrischen Potenzials ein elektrisches Feld in einem elektrischen Feldbereich zwischen den Elektroden zu erzeugen. Die Vorrichtung 300 umfasst weiterhin ein drittes Zwischenvolumen 336, das durch eine vierte Membran 327, die in dem elektrischen Feldbereich angeordnet ist, und eine fünfte Membran 328, die zwischen der dritten Elektrodenzone 331 und der vierten Membran 327 angeordnet ist, definiert ist. Das dritte Zwischenvolumen 336 ist von der dritten Elektrodenzone 331 und der vierten Elektrodenzone 332 durch die vierte Membran 327 und die fünfte Membran 328 getrennt. Wenigstens eine der Membranen ist eine Barrieremembrane, die in der Lage ist, eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes zu steuern.

In 3 wird ausschließlich aus Bequemlichkeit die erste Elektrode 313 als eine Kathode, die zweite Elektrode 314 als eine Anode, die dritte Elektrode 323 als eine Kathode und die vierte Elektrode 324 als eine Anode dargestellt. Die Polarität der Elektroden kann umgekehrt sein, wobei die erste Elektrode 313 und die dritte Elektrode 323 Anoden und die zweite Elektrode 314 und vierte Elektrode 324 Kathoden sind. In ähnlicher Weise sind die erste Elektrode 313 und die vierte Elektrode 324 Anoden und die zweite Elektrode 314 und dritte Elektrode 323 Kathoden.

3A zeigt die Verbindung von zwei Vorrichtungen, um eine Vorrichtung gemäß dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung auszubilden. Die erste Vorrichtung führt eine Art Reinigung oder Trennung einer Probe aus, während die zweite Vorrichtung die teilweise gereinigte Probe konzentriert. Es ist auch machbar, dass man die erste Vorrichtung gemäß des zweiten Aspektes der vorliegenden Erfindung so konfigurieren läßt, dass wenigstens eine der ersten, zweiten oder dritten Membranen ebenfalls eine Barrieremembran ist, die in der Lage ist, unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung zu steuern. In dieser Form kann der Fluss von Flüssigkeit in oder heraus aus der Probe ebenfalls gesteuert werden.

Die Vorrichtung umfasst Mittel zur Übertragung von Flüssigkeiten an die dritte Elektrodenzone, die vierte Elektrodenzone und das dritte Zwischenvolumen, und wenigstens eine der Flüssigkeiten enthält ein teilweise konzentriertes Produkt aus wenigstens einem des ersten und zweiten Zwischenvolumens. Die Vorrichtung umfasst weiterhin Mittel zum Anlegen eines ausgewählten elektrischen Potenzials über wenigstens den elektrischen Feldbereich. Die Anlegung des ausgewählten elektrischen Potenzials bedingt, dass wenigstens einer von wenigstens einem Teil einer Flüssigkeit innerhalb des Probenbestandteils durch wenigstens eine Membran in eine benachbarte Elektrodenzone wandert, und dass wenigstens ein Teil des ersten teilweise konzentrierten Produktes durch wenigstens eine Membran in das dritte Zwischenvolumen wandert. Die Barrieremembranen steuert eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung in das dritte Zwischenvolumen und aus diesem heraus, so dass ein zweites, teilweise konzentriertes Produkt gesammelt wird und/oder im dritten Zwischenvolumen verbleibt.

EXPERIMENTE UND ERGEBNISSE

Die Übertragung von Flüssigkeit aus einem Bereich in einen anderen durch eine poröse Membran wird als Endoosmose bezeichnet. Endoosmose ist bei der membranbasierten Elektrophoresetechnologie ein wichtiger Punkt, und ihre Steuerung kann die Produktwiedergewinnung erhöhen, die Zahl der Durchgänge verringern und Proben konzentrieren. Ein Verfahren zum Lenken von Endoosmose bedient sich der Elektro-osmose, wobei eine externe Energieversorgung die Geschwindigkeit eines Systems, das Osmose oder Endoosmose durchläuft, verändert.

Um eine biokompatible Membran zu identifizieren, wurden Zellulosetriacetat (CTA)-Membranen für eine Reihe von Dialyse-Experimenten verwendet, wobei CTA als eine hoch endo-osmotische Membran identifiziert wurde. Aufgrund der hohen endo-osmotischen Geschwindigkeit von CTA wurde seine Rolle beim Steuern von Endoosmose untersucht. Es wurden auch zusätzliche Arbeiten ausgeführt, um die endo-osmotische Geschwindigkeit von PVAI-Membranen zu untersuchen.

Die folgenden Parameter wurden untersucht:

  • i) ob CTA-Endoosmose spannungsabhängig ist;
  • ii) ob PVAI-Endoosmose spannungsabhängig ist;
  • iii) ob CTA-Endoosmose pH-abhängig ist; und
  • iv) ob CTA in die membranbasierte Elektrophoresetechnologie einbezogen werden kann, um die Ausbeute, Reinigungsgeschwindigkeiten zu verbessern und/oder als Konzentrator zu wirken.

Materialien

Elektrophoresevorrichtung auf der Grundlage von Membranen, hergestellt von Gradipore Limited, Australien.

  • 5 kDa-, 500 kDa-, 700 kDa- und 1500 kDa-Molekülmassenausschluss-Polyacrylamid (PA)-Membranen (Gradipore).
  • 5 kDa-, 10 kDa- und 20 kDa-Zellulosetriacetat (CTA)-Membranen (Sartorius).
  • 5% Polyvinylalkohol (PVAI)-Membran (Gradipore Limited).
  • Rinderserumalbumin (BSA) 67 kDa pI ~ S, Ovalbumin 45 kDa pI 4,2, Trypsin-Inhibitor 14 kDa pI 4,7 und Fibrinogen 330 kDa pI 5,5.

Kalibrierung des Molekülmassenausschlusses von CTA-Membranen

Der Molekülmassenausschluss der 10 kDa- und 20 kDa-CTA-Membranen wurde zur Verwendung bei der membranbasierten Elektrophoresetechnologie bestimmt. Die 10 kDa- und 20 kDa-CTA-Membranen wurden in getrennten Reinigungsläufen verwendet, in denen eine 3 mg/mL-Proteinmischung (jeweils 1 mg/mL BSA, Ovalbumin und Trypsininhibitor in TB pH 8,0) in den Strom 1 eingebracht und bei 250 V 45 min lang in den Strom 2 getrennt wurde. Eine nichtreduzierende PAGE von Strom 1 nach 0 min und von Strom 2 nach 45 min wurde ausgeführt, um den Molekülmassenausschluss von der 10 kDa- und 20 kDa-CTA-Membran zu bestimmen (4).

Die Ergebnisse der CTA-Kalibrierungsexperimente (4) legten nahe, dass der tatsächliche Ausschluss der CTA-Membranen bei den 10 kDa-Membranen 14 kDa und bei den 20 kDa-CTA-Membranen 45 kDa betrug. Der 14 kDa-Molekülmassenausschluss der 10 kDa-CTA-Membran wurde aus der PAGE bestimmt, da nur der Trypsin-Inhibitor (14 kDa) nach dem Durchwandern durch die 10 kDa-CTA-Membrane während des 45-minütigen Elektrophoreselaufes beobachtet wurde. Der 45-kDa-Molekülmassenausschluss der 20 kDa-CTA-Membran wurde aus der PAGE bestimmt, da der Trypsin-Inhibitor (14 kDa), Ovalbumin (45 kDa) und eine kleine Menge BSA (67 kDa) während des 45-minütigen Elektrophoreselaufes durch die 20 kDa-CTA-Membran hindurch wanderten.

Orientierung der CTA-Membranen

Die CTA-Membranen waren asymmetrisch. Daher wurde für die Verwendung von CTA-Membranen für weitere Experimente die Orientierung (glänzende Seite oben oder unten) und die endo-osmotische Geschwindigkeit von 5 kDa-, 10 kDa- und 20 kDa-CTA-Membranen analysiert. Diese Parameter wurden in Zweistrom- und Einzelstrom-Vorrichtungskonfigurationen bestimmt, um zu identifizieren, welche Konfiguration die höchste endo-osmotische Geschwindigkeit aufwies. Dazu gehörte das Aufnehmen der Volumenänderung alle 5 Min. und das Vergleichen der ESA-Menge (1 mg/mL) zu Beginn und am Ende.

Die experimentellen Daten legten nahe, dass die 5 kDa-CTA-Membran im Vergleich zu den anderen CIA-Membranen sowohl in der Standard- als auch der Einzelstrom-Konfiguration die niedrigste endo-osmotische Geschwindigkeit (5) aufwies. Die endo-osmotischen Geschwindigkeiten für sowohl die 10 kDa- als auch für die 20 kDa-Membran waren vergleichsweise hoch, wobei die Einzelstrom-Konfiguration eine höhere endo-osmotische Geschwindigkeit zeigte als die Standard-Konfiguration (5). Die 10 kDa-CTA-Membran wies bei beiden Konfigurationen im Vergleich zu den 5 kDa- und der 20 kDa-CTA-Membranen die höchste endo-osmotische Geschwindigkeit auf.

Da die CTA-Membranen asymmetrisch waren (eine glänzende Seite und eine matte Seite) wurde auch ein Vergleich der Orientierung ausgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die endoosmotische Geschwindigkeit von 5 kDa-CTA-Membranen mit der glänzenden Seite nach oben höher war als mit der glänzenden Seite nach unten (6). Jedoch schnitten die 10 kDa- und die 20 kDa-CTA-Membranen mit der glänzenden Seite nach unten etwas besser ab als mit der glänzenden Seite nach oben. Insgesamt wies die 10 kDa-CTA-Membran eine höhere endoosmotische Geschwindigkeit auf.

Es wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass die Einzelstrom-Konfiguration der membranbasierten Elektrophoresetechnologie unter Verwendung einer 10 kDa-CTA-Membran bei beiden Symmetriezuständen die höchste endo-osmotische Geschwindigkeit zeigte. Dies lieferte die Grundlage für die verbleibenden experimentellen Vorgehensweisen unter Verwendung von CTA-Membranen. Aus Konsistenzgründen wurden alle verbliebenen CTA-Experimente in der Einzelstrom-Konfiguration unter Verwendung einer 10 kDa-Membran mit der glänzenden Seite nach oben ausgeführt.

Endoosmose und Spannung bei Verwendung von CTA-Membranen.

Um zu bestimmen, ob die Endoosmose spannungsabhängig war, wurde eine Reihe von Experimenten vorbereitet, bei denen die Volumenänderung aufgrund von Endoosmose stattfand. Um zu untersuchen, ob die CTA-Endoosmose spannungsabhängig war, wurde eine Elektrophoresevorrichtung in der Einzelstrom-Konfiguration aufgebaut mit gekühltem TB pH 9,0 im Puffertank und einer Patrone, die aus einer Polyacrylamid (PA)-Begrenzungsmembran und oben einer CTA-Trenn- und, oder volumensteuernden Barrieremembran bestand. 50 mL 1 mg/mL BSA wurden 30 min lang durch die Patrone im Strom 2 der Vorrichtung laufen gelassen. Die Volumenänderung wurde alle 5 min gemessen, und die Konzentration im Anfangs- und Endstrom 2 wurde durch Spektrophotometrie (A280) bestimmt. Der obige experimentelle Aufbau wurde mit 50 V-Inkrementen von 0 V bis 300 V (1A, 300 W) wiederholt.

Die experimentellen Daten zeigten, dass die Geschwindigkeit des Volumenverlustes bei steigender Spannung linear anstieg (7). Die Ergebnisse legten nahe, dass die endoosmotische Geschwindigkeit in Verbindung mit CTA als Volumenkontrollbarriere durch das Verändern der Spannung bei Vorgehensweisen, bei denen die Flüssigkeitsvolumenübertragung ein wichtiger Punkt ist, gesteuert werden kann. Jedoch verringerte sich die Menge des wiedergewonnenen BSA bei steigender Spannung (8). Die verringerte Wiedergewinnung von BSA wurde darauf zurückgeführt, dass die erhöhte Spannung das BSA in die Begrenzungs-PA-Membran zwang.

Endoosmose und Spannung bei Verwendung von PVAI-Membranen

Um zu bestimmen, ob die Endoosmose unter Verwendung von PVAI-Membranen spannungsabhängig war, wurden Experimente unter Verwendung des Verfahrens ausgeführt, das für CTA-Membranen verwendet wurde und das im obigen Abschnitt beschrieben ist.

Die experimentellen Daten zeigten, dass die Geschwindigkeit der Volumenverringerung bei steigender Spannung ebenfalls stieg (9). Jedoch war die Korrelation nicht so linear, wie diejenige, die bei Verwendung von CTA-Membranen erreicht wurde. Ein Vergleich von CTA- und PVAI-Elektroendoosmose-Geschwindigkeiten bei Verwendung von 200 V in einer Vorrichtung mit Einzelstrom-Konfiguration mit BSA ergab im Vergleich zu CTA einen 4-fachen Anstieg der Elektroendoosmose-Geschwindigkeit, wenn PVAI verwendet wurde. Es gab keine Veränderung der Elektroendoosmose-Geschwindigkeit, wenn PA-Membranen verwendet wurden.

Endoosmose und pH bei Verwendung von CTA-Membranen

Um zu bestimmen, ob die Endoosmose pH-abhängig war, wurde eine Reihe von Experimenten verglichen, bei denen die Volumenverringerung aufgrund von Elektroendoosmose stattfand. Um zu untersuchen, ob die CTA-Endoosmose pH-abhängig war, wurde eine Elektrophoresevorrichtung in der Einzelstrom-Konfiguration mit gekühltem TB pH 9,0 im Puffertank und einer Patrone aufgebaut, die aus einer PA-Membranbegrenzung am Boden und oben einer CTA-Trenn- und, oder einer Barrieremembran zur Volumensteuerung bestand. Man ließ 50 ml 1 mg/mL BSA durch die Patrone im Strom 2 der Vorrichtung 30 Min. lang und bei 250 V (1A, 300W) laufen. Die Volumenänderung wurde alle 5 Min. gemessen, und die Konzentration des Anfangs- und Endstroms 2 wurden durch Spektrophotometrie (A280) bestimmt. Der obige experimentelle Aufbau wurde von pH 4,0 bis pH 9,0 mit pH-Inkrementen von 0,5 wiederholt.

Die experimentellen Daten legten nahe, dass die Geschwindigkeit der Volumenverringerung bei steigendem pH stieg (10). Jedoch wies jeder Puffer seine eigenen Schwankungen auf, was nahelegt, dass die pH-abhängigen Endoosmose-Geschwindigkeiten möglicherweise für individuelle Anwendungen und Puffersysteme bestimmt werden müssen.

Endoosmose-Steuerung und Isolierung von Fibrinogen

Um zu überprüfen, ob die endo-osmotische Geschwindigkeit mit einer geladenen Membran gesteuert werden konnte, wurde eine Vorgehensweise mit einer hohen endo-osmotischen Geschwindigkeit untersucht. Die Isolierung von Fibrinogen aus Kryopräzipitat war die Vorgehensweise mit einer hohen endo-osmotischen Geschwindigkeit. Das Isolieren von Fibrinogen aus dem Kryopräzipitat führte typischerweise zu einer Erhöhung des Volumens von Strom 1 um einen Faktor von 5 bis 8, wobei während des Reinigungsvorgangs Flüssigkeit aus dem Strom 2 gezogen. Um die Wirkung der Veränderung der Ansammlung von Flüssigkeit in Strom 1 zu überprüfen, wurde Fibrinogen unter Verwendung von vier verschiedenen Verfahren aus einem Kryopräzipitatvorrat (eine 1:3-Verdünnung der Kryopräzipitatvorratslösung wurde vorbereitet und als Ausgangsmaterial für alle drei Verfahren verwendet) isoliert.

Verfahren 1: Standardisolierung von Fibrinogen unter Verwendung einer Elektrophoresevorrichtung mit einer 700-1500-700 kDa PA-Membran-Patrone bei 250 V (1A, 300W). Der Puffertank enthielt gekühlten TB pH 9,0, 30 mL 1:3-verdünnte Kryopräzipitatvorratslösung wurde in Strom 1 und 10 ml TB pH 9,0 in Strom 2 eingebracht. Die Änderung des Volumens von Strom 1 wurde alle 15 min zusammen mit einer spektrophotometrischen (OD280) Anzeigenwert von Strom 2 festgehalten. Strom 2 wurde alle 30 Minuten geerntet, der Puffer ersetzt und die Spannung 2 Minuten lang umgekehrt (um den Schmutz auf der Membran zu entfernen).

Verfahren 2: Ähnlich wie Verfahren 1 mit der Ausnahme, dass die obere Begrenzungsmembran (700 kDa PA-Membran) durch eine 10 kDa-CTA-Volumensteuerungs-Barrieremembran ersetzt war.

Verfahren 3: Zwei membranbasierte Elektrophoresevorrichtungen wurden, mit getrennten Energieversorgungen und, wie in 11 gezeigt, miteinander verbunden, verwendet. Die Vorrichtung 1 wurde vorbereitet und laufen gelassen wie bei Verfahren 1 beschrieben ist (beachte: die 700 kDa-Begrenzungsmembranen waren durch 500 kDa Begrenzungsmembranen ersetzt), jedoch wurde die Vorrichtung 2 mit einer 5 kDa PA-Membran (unten) und einer 10 kDa-CTA-Membran (oben) als ein Einzelstrom konfiguriert. Die Vorrichtung 2 wurde mit dem Strom 1 von Vorrichtung 1 verbunden und fungierte durch das Steuern der endo-osmotischen Geschwindigkeit mit der getrennten Energieversorgung als ein Strom 1-Konzentrator. Mit Hilfe der Daten, die aus den Spannungsabhängigkeitsexperimenten oben erhalten wurden, wurde eine Spannung gewählt, die zu der endo-osmotischen Geschwindigkeit von Verfahren 1 passte. Die Spannung der Vorrichtung 2 betrug 250 V (1A, 300W).

Verfahren 4: Ähnlich wie Verfahren 1, mit der Ausnahme, dass die Begrenzungsmembran oben durch eine PVAI-Membran ersetzt ist.

Es wurde festgestellt, dass die Verwendung von CTA während der Fibrinogenisolierung das Ausmaß der Endoosmose (12) um einen Faktor 2 (Verfahren 2) bis 6 (Verfahren 3) verringert. Unter Verwendung einer getrennten Energieversorgung und einer Vorrichtung mit einer Konzentratorpatrone wurde die Endoosmosegeschwindigkeit von Strom 1 bei einer geringen endo-osmotischen Geschwindigkeit aufrechterhalten, ohne die Spannung zu verändern (die Spannung wurde bei konstanten 250 V eingestellt). Anders als bei Verfahren 3 erforderte das Volumen von Strom 2 bei den Verfahren 1 und 2 eine kontinuierliche Überwachung und ein kontinuierliches Auffüllen.

Mit dem Verfahren 1 wurden aus einem Vorrat an Kryopräzipitatlösung 34,8% Fibrinogen isoliert, wohingegen mit dem Verfahren 2 42,6% Fibrinogen und mit dem Verfahren 3 53,5% Fibrinogen (12) isoliert wurden. Insgesamt schienen die Verfahren 2 und 3 aufgrund der hohen prozentualen Wiedergewinnung und der Verringerung der Endoosmose-Geschwindigkeit kommerziell einsetzbar zu sein.

Die Verwendung von PVAI während einer Fibrinogenisolierung führte zu einer 4-fachen Steigerung der Proteinübertragungsgeschwindigkeit in der Vorrichtung (Tabelle 1). Die Verwendung von PVAI als Begrenzungsmembran oben, um die Elektroendoosmose zu verringern, führte zu einer Steigerung der Proteinübertragung von 44,7% auf 77,3%. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass die Verwendung von PVAI die Wiedergewinnungszeit verringern oder verbessern kann. Wenn PA-Membranen verwendet wurden, wurden 32,5 mg Fibrinogen nach 120 Minuten wiedergewonnen, wohingegen unter Verwendung von PVAI 36,1 mg Fibrinogen in 30 Minuten wiedergewonnen wurden. Die Verwendung von PVAI erlaubte daher, dass in einem Viertel der Zeit mehr Fibrinogen entfernt werden konnte. Tabelle 1: Vergleich der Proteinübertragung während der Fibrinogenisolierung. Die Tabelle vergleicht die Verwendung von PAM und PVAI während der Fibrinogenisolierung. Kontrolle PVAI als obere Membran Ingesamt wiedergewonnenes Protein 24,3% 31,3% Nach 30 Minuten insgesamt wiedergewonnenes Protein 44,7% 77,3% Wiedergewinnung Vergleich 32,5 mg/120 min (0,27 mg/min) 36,1 mg/30 min. (1,20 mg/min) Elektroendoosmose (mL/min) 1,71 0,00

Gleichzeitige Trennung und Konzentrierung von Rinder-Prionenprotein (PrP) aus Rinderhirn-Homogenat unter Verwendung einer PVAI-Membran

Eine andere Anwendung der membranbasierten Elektrophorese stellt die gleichzeitige Trennung und Konzentrierung des Rinder-Prionenproteins (PrP) aus Rinderhirn-Homogenat dar unter Verwendung einer PVAI-Membran als Begrenzungsmembran oben, die den Strom 1 von der ersten Elektrodenzone trennt. Typischerweise verursachte die Elektroendoosmose während der Trennungsexperimente mit PrP eine Erhöhung des Volumens des Ausgangsmaterials. Mit der Einführung von PVAI als Begrenzungsmembran oben wurde die Elektroendoosmose-Geschwindigkeit jedoch verringert.

In 13 ist ein Vergleich einer typischen PrP-Trennung und einer Trennung und Konzentrierung von PrP unter Verwendung von PVAI dargestellt. Teil A von 13, eine SDS-PAGE von den Proben aus den beiden Elektrophoreseexperimenten, zeigt die Übertragung von Protein von dem Strom 1 in den Strom 2. Während Teil B von 13 der entsprechende Western-Blot von mit anti-PrP R029 (Prionics, Schweiz) hybridisierten Proben ist.

Normalerweise wird die Trennung von PrP 3 Stunden lang bei 250 V unter Verwendung einer Patrone mit einer Trennmembran von 200 kDa und zwei Begrenzungsmembranen von 5 kDa unter Verwendung von Tris-Borat-Puffer pH 9,0 (Teil A, Spuren 1–4) ausgeführt, den Bedingungen, unter denen PrP im Strom 1 verbleibt (Teil B, Spuren 1–4). Wenn die gleichen Bedingungen verwendet wurden, aber die Begrenzungsmembran oben durch eine PVAI-Membran ersetzt war, wurde eine gleichzeitige Trennung und Konzentrierung von PrP aus Rinderhirn-Homogenat erreicht.

Die Verwendung von PVAI führte zu einer 5-fachen Verringerung des Volumens von Strom 1 am Ende des Experimentes und somit zu einer klaren Erhöhung der Konzentration von PrP, die durch eine Erhöhung der Intensität der PrP-Bande auf dem Western-Blot (Teil B) nachgewiesen wurde.

SCHLUSSFOLGERUNG

Die höchste endo-osmotische Geschwindigkeit wurde bei beiden Symmetriezuständen unter Verwendung einer Elektrophoresevorrichtung mit Einzelstromkonfiguration und einer 10 kDa-CTA-Membran erreicht. Die Identifizierung der Konfiguration mit der höchsten endoosmotischen Geschwindigkeit erlaubte Experimente, um diese Geschwindigkeit zu steuern. Die Analyse, ob die Endoosmose spannungsabhängig war, zeigte, dass die Geschwindigkeit des Volumenverlustes bei steigender Spannung linear anstieg. Daher kann das Erhöhen der Spannung eines Systems die Wirkung der Endoosmose durch Elektroosmose verringern. Die Beziehung zwischen dem pH und der Endoosmose legt nahe, dass jedes Puffersystem seine eigenen Variablen aufweist, und dass der pH möglicherweise auf der Grundlage einer individuellen Anwendung untersucht werden muss, um eine optimale Trennung und/oder Konzentrierung zu erhalten.

Um zu überprüfen, ob die endo-osmotische Geschwindigkeit mit einer geladenen Membran (CIA) gesteuert werden konnte, wurde eine Prozedur mit einer hohen endo-osmotischen Geschwindigkeit untersucht. Die Isolierung von Fibrinogen aus Kryopräzipitat war die Prozedur mit einer hohen endo-osmotischen Geschwindigkeit. Drei Experimente wurden verwendet, um die Steuerung von Endoosmose zu untersuchen. Das erste Experiment war eine Kontrolle, die die Endoosmose-Geschwindigkeit eines Standard-Fibrinogen-Isolierungslaufs identifizierte. Zum zweiten Experiment gehörte das Verringern der endo-osmotischen Geschwindigkeit durch das Ersetzen der PA-Membranbegrenzung oben durch CTA. Beim letzten Experiment wurde eine zweite Vorrichtung in einer Einzelstrom-Konfiguration (CTA-Membran oben und PA-Membranen am Boden) verwendet, die das Strom 1-Volumen der ersten Vorrichtung steuerte. Jede Vorrichtung besaß ihre eigene Energieversorgung. Daher konnte die Geschwindigkeit der Elektroosmose in der Vorrichtung 2 durch das Verändern der Spannung (passend zur endoosmotischen Geschwindigkeit) gesteuert werden. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigten, dass die endo-osmotische Geschwindigkeit von Strom 1 auf diese Weise gelenkt werden konnte, was die gesamte Wiedergewinnung an Fibrinogen erhöhte und die Reinigung beschleunigte.

Die Steuerung der endo-osmotischen Geschwindigkeit findet auch bei Untersuchungen hinsichtlich PrP Anwendung. Die Verwendung von PVAI zeigt ein Verfahren zur gleichzeitigen Konzentrierung und Trennung von PrP. Dieses Verfahren findet neben dem Prionen-Nachweis und der Prionen-Diagnostik Anwendungen in der Produktreinigung.

Elektroendoosmose-Vorrichtungskonfigurationen für monoklonale Antikörper/rekombinante Reinigungen/Konzentrierung

Die vorliegende Erfindung ist bei der gleichzeitigen Reinigung und Konzentrierung von Proteinen, die rekombinant oder durch Gewebekulturmittel erzeugt werden und in einer verdünnten Form in großen Flüssigkeitsvolumina hergestellt werden, besonders anwendbar. Die Verwendung des Verfahrens und der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung erlaubt zahlreiche Konfigurationen, bei denen eine gleichzeitige Reinigung und Konzentrierung/Volumenkontrolle stattfinden kann.

Reinigungsvorgänge können eine von zwei allgemeine Formen annehmen:

  • – Übertragung des Zielproteins weg von Verunreinigungen, die im Einspeisungsstrom (Probe) verbleiben,
  • – Übertragung von Verunreinigungen weg vom Zielprotein, das in dem Einspeisungsstrom (Probe) verbleibt.

Bei der ersten Form wird die Geschwindigkeit der Übertragung des Zielproteins bei abnehmender Konzentration des Zielproteins ebenfalls fallen, was zu einer langsameren Reinigung führt. Der Beitrag der Endoosmose kann auch das Einspeisungsstromvolumen erhöhen, was die Reinigung weiter verlangsamt. Die Fahigkeit, das Volumen des Einspeisungsstroms zu konzentrieren oder zu steuern, erlaubt, dass die Übertragung des Zielproteins bei der höchstmöglichen Geschwindigkeit aufrechterhalten wird.

Bei der zweiten Form wird sich die Reinigung bei abnehmender Konzentration der Verunreinigungen im Einspeisungsstrom ebenfalls verlangsamen, was die Reinigungszeit verlängert. Die Fähigkeit, den Einspeisungsstrom, wo sich das Produkt ansammelt, zu konzentrieren, wird die Geschwindigkeit der Reinigung durch das Aufrechterhalten der Übertragungsgeschwindigkeit von Verunreinigungen aus dem Zielprotein erhöhen und gleichzeitig ein aufkonzentriertes Zielprotein liefern.

Diese beiden Techniken sind hinsichtlich eines jeden Proteins (oder einer anderen Verbindung) anwendbar, das in geringen Konzentrationen im Einspeisungsstrom vorhanden ist, insbesondere bei rekombinanten und monoklonalen Antikörper (Mab)-Proteinen, die routinemäßig bei Konzentrationen zwischen 5 und 100 &mgr;g/mL im Gewebekulturmedium erzeugt werden.

Mehrere Konfigurationen der membranbasierten Elektrophoresevorrichtung können verwendet werden, um die gleichzeitige Reinigung und Konzentrierung eines Produktes zu bedingen, das bei geringen Konzentrationen in einem großen Volumen vorhanden ist.

ANWENDUNGEN Konfiguration 1 Gleichzeitige Konzentrierung und teilweise Reinigung (Fig. 14).

In einer einzelnen Vorrichtung, die einen Probenstrom (Strom 1) und einen Trennungsstrom (Strom 2) aufweist, wird oben eine Begrenzungsmembran mit Elektroendoosmose-Eigenschaften verwendet, um Wasser aus dem großen Volumen des verdünnten Einspeisungsstroms zu ziehen. Die Bedingungen sind so gewählt, dass einige oder idealerweise alle Verunreinigungen auf den zweiten Strom übertragen werden, während das Zielprotein (und möglicherweise einige verbleibende Verunreinigungen) durch Elektroendoosmose in dem Einspeisungsstrom konzentriert werden.

Bei einem anderen Beispiel dieses Verfahrens wurden 130 ml Einspeisungsstrom in 180 Minuten auf 10 ml (13-fache Konzentration) konzentriert, während erhebliche Mengen der Albumin- und Transferrin-Verunreinigungen aus dem zweiten Strom entfernt wurden. Die Ergebnisse der PAGE-Analyse sind in 15 und 16 gezeigt. Dieses Beispiel lieferte die teilweise Reinigung des Zielmoleküls und eine erhebliche Konzentrierung des Produktes. Das bereitgestellte Beispiel wurde unter Verwendung von Gewebekulturüberstand, der 10% FCS enthielt, ausgeführt. Diese Konfiguration ist für serumfreie Medien, bei denen das Zielprotein einen erheblichen Teil des Gesamtproteins ausmacht, noch geeigneter. Dieses Verfahren konnte mit Veränderungen der Trennmembran und der Pufferbedingungen sowie des Ausschlusses der Elektroendoosmosemembran verbessert werden.

Die Antikörper-Konzentrierung wurde über eine Zeitspanne von 3 Stunden über 10-fach erhöht. Die relative Konzentration von Verunreinigungen wurde während dieser Zeit durch das Übertragen der Verunreinigungen in einen zweiten Strom verringert (16).

Die Daten in 15 und 16 zeigen, dass Verunreinigungen selektiv aus dem Einspeisungsstrom und ohne Verlust des Zielproteins entfernt wurden, was eine teilweise Reinigung des Zielproteins anzeigt.

Konfiguration 2 Gleichzeitige Konzentrierung und Reinigung des Zielproteins unter Abreicherung von Verunreinigungen im Einspeisungsstrom und Elektroendoosmosesteuerung des Einspeisungsstromvolumens (Fig. 17).

Unter Verwendung von zwei Vorrichtungen wurde eine Vorrichtung konfiguriert, um Zielprotein in einen getrennten Produktstrom weg von den Verunreinigungen, die in dem Einspeisungsstrom verblieben, zu übertragen. In einer getrennten Vorrichtung wurde eine Patrone unter Verwendung einer Elektroendoosmose-Begrenzungsmembran oben verwendet, um den Einspeisungsstrom zu konzentrieren und damit die Übertragungsgeschwindigkeit des Zielproteins in der ersten Trenneinheit aufrechtzuerhalten. In dem unten angegebenen Beispiel wurde die zweite Vorrichtung auch so konfiguriert, um die Übertragung von Verunreinigungen aus dem Einspeisungsstrom in den Pufferstrom des zweiten Instrumentes zu erlauben und dadurch die Verunreinigungen im Einspeisungsstrom zu verringern.

In einem Beispiel dieses Verfahrens wurde ein 130 ml Einspeisungsstrom über eine Zeitspanne von 180 Minuten auf 100 ml konzentriert, während Albumin- und Transferrin-Verunreinigungen zu dem Pufferstrom der zweiten Vorrichtung entfernt wurden. Dies lieferte eine hervorragende Reinigung des Zielproteins, eine erhebliche Konzentrierung des Produktes durch das Übertragen des Produktes auf ein kleines Stromvolumen, erlaubte aber auch das Reinigen und Konzentrieren des Einspeisungsstroms, um die Übertragung des Zielproteins zu erhöhen. Das angegebene Beispiel wurde mit dem Überstand aus einer Gewebekultur, der 10% fötales Kalberserum (FCS) enthielt, ausgeführt. Dieses Verfahren könnte durch die Verwendung einer Elektroendoosmosemembran, die zu einer größeren Flüssigkeitsübertragung fähig ist, oder durch die Verwendung einer Elektroendoosmosemembran, die in der Lage ist, Flüssigkeit zu der positiven Elektrode zu ziehen, verbessert werden.

18 zeigt eine PAGE-Analyse von Ergebnissen des obigen Experimentes. Der Einspeisungsstrom wurde im Verlauf des Experimentes konzentriert, aber es wurden auch die Mengen darin enthaltener verunreinigender Proteine verringert. Die Verringerung von Verunreinigungen erhöht durch das Vereinfachen der Inhalte des Einspeisestroms die Übertragung des Zielproteins in den Produktstrom.

19 zeigt eine PAGE der endgültigen Reinigungsergebnisse des obigen Experimentes. Das Zielprotein wurde gereinigt und in den Produktstrom konzentriert. Die Übertragungsgeschwindigkeit in den Produktstrom wurde durch das Konzentrieren des Einspeisungsstroms aufrechterhalten. Wenn die Konzentration des Zielmoleküls im Einspeisungsstrom verringert wurde, verlangsamte sich die Übertragungsgeschwindigkeit, es sei denn, das Einspeisestromvolumen wurde verringert. Diese Volumenverringerung würde eine Störung durch die erhöhte Konzentration von Verunreinigungen bedingen, es sei denn, der Einspeisungsstrom würde auch bezüglich der Verunreinigungen abgereichert.

Alternative Konfigurationen, bei denen die Elektroendoosmose verwendet werden kann, um Zielproteine aus verdünnten Ausgangsmaterialien zu reinigen und zu konzentrieren.

Konfiguration 3

Das Zielmolekül wird in den zweiten Strom übertragen, und der Einspeisungsstrom wird konzentriert.

Eine Einzelvorrichtung, die wie in 20 gezeigt konfiguriert ist, weist einen Probenstrom, (Strom 1), der eine zu behandelnde Probe enthält, und einen Trennstrom (Strom 2) auf, in den eine ausgewählte Verbindung durch Elektrophorese übertragen wird. Eine obere Begrenzungsmembran mit Elektroendoosmose-Eigenschaften wird verwendet, um Wasser aus dem Probenstrom zu ziehen. Die Bedingungen sind so gewählt, dass einige oder idealerweise alle der ausgewählten Verbindungen in den zweiten Strom übertragen werden, während die Probe durch Elektroendoosmose im Einspeisungsstrom konzentriert wird, um die Flussrate des Produktstromes aufrechtzuerhalten.

Konfiguration 4

Übertragung des Produktes in Strom 1, während Strom 2 konzentriert und optional gereinigt wird, wobei Verunreinigungen in den Pufferstrom oder in einen optionalen dritten Strom übertragen werden.

Eine wie in 21 gezeigt konfigurierte Einzelvorrichtung, die einen Probenstrom (Strom 1), der eine zu behandelnde Probe enthält, und einen Trennstrom (Strom 2), in den eine ausgewählte Verbindung durch Elektrophorese übertragen wird, aufweist. Eine obere Begrenzungsmembran mit Elektroendoosmose-Eigenschaften wird verwendet, um Wasser aus dem Probenstrom durch die dritte Membran zu treiben. Die Bedingungen sind so gewählt, dass etwas oder idealerweise alles von einer ausgewählten Verbindung in den zweiten Strom übertragen wird, während die Probe durch Elektroendoosmose im Einspeisungsstrom konzentriert wird, um die Flussrate der Verbindung im Probenstrom aufrechtzuerhalten.

Konfiguration 5

Verwendung einer Elektroendoosmosemembran auf beiden Seiten des Einspeisungsstroms, um die Konzentrierungswirkung zu verstärken, wobei der Molekülmassenausschluss der Elektroendoosmose-membranen so gewählt ist, dass er die Übertragung von Verunreinigungen weg von dem Zielprotein gestattet, das im zentralen Einspeisungsstroms verbleibt und konzentriert wird.

Eine wie in 22 gezeigt konfigurierte Einzelvorrichtung, die einen Probenstrom (Strom 1) aufweist, der eine Probe, die zu konzentrieren und aufzureinigen ist, und einen oberen und unteren Strom (Strom 2 und 3) umfasst, in die Wasser und unerwünschte Verunreinigungen durch Elektrophorese übertragen werden. Zwei Begrenzungsmembranen mit Elektroendoosmose-Eigenschaften bilden den Probenstrom und werden verwendet, um Wasser aus dem Probenstrom durch den oberen und den unteren Strom zu treiben. Die Bedingungen sind so gewählt, dass einige oder idealerweise alle Verunreinigungen auf den zweiten oder dritten Strom übertragen werden, während die Probe durch Elektroendoosmose im Einspeisungsstrom konzentriert wird.

Konfiguration 6 Verwendung von zwei Elektrophoresevorrichtungen für getrennte Konzentrierungs- und Reinigungsfunktionen.

Dieses Beispiel verwendet zwei Vorrichtungen, wie in 23 gezeigt ist. Eine Vorrichtung ist so konfiguriert, dass ein Zielprotein in einen getrennten Produktstrom und weg von den Verunreinigungen, die in dem Probenstrom verblieben sind, übertragen werden. In einer getrennten Vorrichtung entfernen eine Patrone, die oben eine elektro-endo-osmotische Begrenzungsmembran verwendet, und zwei andere Membranen, die zwei Ströme zum Konzentrieren des Probenstroms bilden, Verunreinigungen und halten die Übertragungsgeschwindigkeit des Zielproteins in der ersten Trenneinheit aufrecht.

Konfiguration 7

Eine wie in 24 gezeigt konfigurierte Einzelvorrichtung, die einen Probenstrom (Strom 1) aufweist, der eine zu konzentrierende und zu reinigende Probe enthält. Eine Begrenzungsmembran mit Elektroendoosmose-Eigenschaften wird verwendet, um Wasser aus dem Probenstrom durch eine Elektrodenzone auszutreiben, um eine konzentrierte Probe zu erzeugen.

In Abhängigkeit von dem Zielprotein und den Verunreinigungsprofilen des Einspeisungsstroms sind unter Verwendung von verschiedenen Membranchemien und Pufferkombinationen, die Volumenflüssigkeit in die erforderlichen Richtungen treiben, und von dem Molekülmassenausschluss von Membranen, der auf die optimale Übertragung von Verunreinigungen oder Zielproteinen abgestimmt ist, viele andere Konfigurationen möglich.

Es wird durch Fachleute auf dem Gebiet anerkannt werden, dass zahlreiche Variationen und/oder Modifikationen an der Erfindung, wie sie in den spezifischen Ausführungsformen gezeigt ist, vorgenommen werden können, ohne dass vom Geist oder Umfang der Erfindung, wie er breit beschrieben ist, abgewichen wird. Die vorliegenden Ausführungsformen sind somit in jeder Hinsicht als veranschaulichend und nicht als beschränkend zu verstehen.


Anspruch[de]
Elektrophoresevorrichtung (100) umfassend:

eine erste Elektrode (113) in einer ersten Elektrodenzone (111);

eine zweite Elektrode (114) in einer zweiten Elektrodenzone (112), wobei die erste Elektrode (113) relativ zu der zweiten Elektrode (114) so angeordnet ist, dass sie angepasst ist, um dazwischen ein elektrisches Feld in einem elektrischen Feldbereich nach Anlegen eines elektrischen Potenzials zwischen der ersten und der zweiten Elektrode (113, 114) zu erzeugen;

eine erste Membran (117), die in dem elektrischen Feldbereich angeordnet ist,

eine zweite Membran (118), die zwischen der ersten Elektrodenzone (111) und der ersten Membran (117) so angeordnet ist, um dazwischen ein erstes Zwischenvolumen (116) zu definieren, wobei das erste Zwischenvolumen (116) von der ersten und zweiten Elektrodenzone (111, 112) durch die erste und zweite Membran (117, 118) getrennt ist;

Mittel (119, 120), die angepasst sind, um Flüssigkeit zu der ersten Elektrodenzone (111) und der zweiten Elektrodenzone (112) zu übertragen; und

Mittel (121), die angepasst sind, um einen Probenbestandteil zu dem ersten Zwischenvolumen (116) zu übertragen;

dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Membran eine Barriere in der Form einer induzierbaren elektro-endo-osmotischen Membran ist, die in der Lage ist, eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes zu steuern, wobei die wenigstens eine induzierbare elektro-endo-osmotische Membran entweder

(a) aus Zellulosetriacetat mit einem Molekülmassenausschluss von 5 bis 20 kDa hergestellt ist, oder

(b) aus Polyvinylalkohol hergestellt ist.
Vorrichtung (200) nach Anspruch 1, weiter umfassend:

eine dritte Membran (222), die zwischen einer zweiten Elektrodenzone (212) und der ersten Membran (217) angeordnet ist, um dazwischen ein zweites Zwischenvolumen (226) zu definieren, wobei das erste Zwischenvolumen (216) von der ersten Elektrodenzone (211) durch die zweite Membran (218) getrennt ist, und das zweite Zwischenvolumen (226) von der zweiten Elektrodenzone (212) durch die dritte Membran (222) getrennt ist.
Vorrichtung (300) nach Anspruch 2, weiter umfassend:

eine dritte Elektrode (323) in einer dritten Elektrodenzone (331);

eine vierte Elektrode (324) in einer vierten Elektrodenzone (332), wobei die dritte Elektrode (323) relativ zu der vierten Elektrode (324) so angeordnet ist, dass sie angepasst ist, um dazwischen ein elektrisches Feld in einem zweiten elektrischen Feldbereich nach Anlegen eines zweiten elektrischen Potenzials zwischen der dritten und der vierten Elektrode (323, 324) zu erzeugen;

eine vierte Membran (327), die in dem zweiten elektrischen Feldbereich angeordnet ist;

eine fünfte Membran (328), die zwischen der dritten Elektrodenzone (331) und der vierten Membran (327) angeordnet ist, um dazwischen ein drittes Zwischenvolumen (336) zu definieren, wobei das dritte Zwischenvolumen (336) von der dritten und vierten Elektrodenzone (331, 332) durch die vierte und fünfte Membran (327, 328) getrennt ist, und wobei wenigstens entweder die vierte oder die fünfte Membran (327, 328) eine Barriere ist, die in der Lage ist, eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes zu steuern;

Mittel, die angepasst sind, um Flüssigkeiten zu der dritten Elektrodenzone (331) und der vierten Elektrodenzone (332) zu übertragen; und

Mittel, die angepasst sind, um einen Probenbestandteil aus dem ersten oder zweiten Zwischenvolumen (316, 326) zu einem dritten Zwischenvolumen (336) zu übertragen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, weiter umfassend: Mittel, die angepasst sind zum Entfernen von in der Vorrichtung erzeugten Wärme. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die induzierbare elektro-endoosmotische Membran eine definierte Porengröße aufweist. Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei die induzierbare elektro-endo-osmotische Membran aus Polyvinylalkohol hergestellt ist und eine definierte Porengröße von etwa 5 bis etwa 1000 kDa aufweist. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die induzierbare elektro-endoosmotische Membran benachbart zu einer der Elektrodenzonen ist. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei eine oder mehrere Membranen Elektrophorese-Trennmembranen mit definierten Porengrößen ist/sind. Vorrichtung nach Anspruch 8, wobei die Elektrophorese-Trennmembranen aus Polyacrylamid hergestellt sind. Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei die Elektrophorese-Trennmembranen definierte Porengrößen von etwa 1 bis etwa 2000 kDa aufweisen. Verfahren zum Konzentrieren einer Probe, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Bereitstellen einer Elektrophoresevorrichtung (100) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10;

(b) Hinzugeben von Puffer oder Lösungsmittel zu der ersten und zweiten Elektrodenzone (111, 112);

(c) Hinzugeben von Puffer oder Lösungsmittel zu der dritten und vierten Elektrodenzone, sofern vorhanden;

(d) Hinzugeben der Probe zu dem ersten Zwischenvolumen (116);

(e) Anlegen eines elektrischen Potenzials zwischen den Elektroden (113, 114), was bedingt, dass sich Flüssigkeit in der Probe durch eine Membran in eine benachbarte Elektrodenzone (111, 112) bewegt; und

(i) optional Erhalten der konzentrierten Probe; wobei die Barrierenmembran eine Flüssigkeitsvolumenbewegung aus der Probe heraus erlaubt.
Verfahren zum Bewegen wenigstens eines Bestandteils aus einer Probe heraus, während eine Flüssigkeitsvolumenbewegung gesteuert wird, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Bereitstellen einer Elektrophoresevorrichtung (200) gemäß Anspruch 2 oder einem der Ansprüche 3 bis 10, sofern sie von Anspruch 2 abhängig sind;

(b) Hinzugeben von Puffer oder Lösungsmittel zu der ersten und zweiten Elektrodenzone (211, 212);

(c) Hinzugeben von Puffer oder Lösungsmittel zu der dritten und vierten Elektrodenzone, sofern vorhanden;

(d) Hinzugeben der Probe zu dem ersten Zwischenvolumen (216);

(e) Hinzugeben von Puffer oder Flüssigkeit zu dem zweiten Zwischenvolumen (226);

(f) Anlegen eines elektrischen Potenzials zwischen den Elektroden (213, 214), was bedingt, dass sich wenigstens eine Verbindung aus der Probe durch eine Membran in eine benachbarte Elektrodenzone oder ein Zwischenvolumen bewegt; und

(g) optional Sammeln der aus der Probe heraus bewegten Verbindung;

wobei die Barrieremembran eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung in eines oder mehrere der Zwischenvolumina hinein oder aus einem oder mehreren der Zwischenvolumina heraus steuert.
Verfahren zum Bewegen wenigstens eines Bestandteiles aus einer Probe heraus, während eine Flüssigkeitsvolumenbewegung gesteuert wird, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Bereitstellen einer Elektrophoresevorrichtung (300) gemäß Anspruch 3 oder einem der Ansprüche 4 bis 10, sofern sie von Anspruch 3 abhängig sind;

(b) Hinzugeben von Puffer oder Elektrolyt zu der ersten, zweiten, dritten und vierten Elektrodenzone (311, 312, 331, 332);

(c) Hinzugeben der Probe zu dem ersten Zwischenvolumen (316);

(d) Hinzugeben von Puffer oder Flüssigkeit zu dem zweiten Zwischenvolumen (326);

(e) Anlegen eines ersten elektrischen Potenzials zwischen der ersten und zweiten Elektrode (313, 314), was bedingt, dass sich wenigstens eine Verbindung aus der Probe heraus durch eine Membran in das zweite Zwischenvolumen (326) bewegt;

(f) Überführen einer Probe, die die Verbindung enthält, aus entweder dem ersten oder dem zweiten Zwischenvolumen (316, 326) in das dritte Zwischenvolumen (336);

(g) Anlegen eines zweiten elektrischen Potenzials zwischen der dritten und vierten Elektrode (323, 324), was bedingt, dass sich Flüssigkeit in dem dritten Zwischenvolumen (336) durch eine Membran in eine benachbarte Elektrodenzone (331, 332) bewegt, wodurch die Verbindung in der Probe aufkonzentriert wird; und

(h) optional Sammeln der konzentrierten Probe;

wobei die Barrieremembran eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung in das dritte Zwischenvolumen (336) steuert.
Elektrophoreseverfahren umfassend die Schritte:

(a) Bereitstellen einer Vorrichtung (100) umfassend:

eine erste Elektrode (113) in einer ersten Elektrodenzone (111);

eine zweite Elektrode (114) in einer zweiten Elektrodenzone (112), wobei die erste Elektrode (113) relativ zu der zweiten Elektrode (114) so angeordnet ist, dass sie angepasst ist, um dazwischen ein elektrisches Feld in einem elektrischen Feldbereich nach Anlegen eines elektrischen Potenzials zwischen der ersten und zweiten Elektrode (113, 114) zu erzeugen;

eine ersten Membran (117), die in dem elektrischen Feldbereich angeordnet ist;

eine zweite Membran (118), die zwischen der ersten Elektrodenzone (111) und der ersten Membran (117) angeordnet ist, um dazwischen ein erstes Zwischenvolumen (116) zu definieren, wobei das ersten Zwischenvolumen (116) von der ersten und zweiten Elektrodenzone (111, 112) durch die erste und zweite Membran (117, 118) getrennt ist, und wobei wenigstens eine Membran eine Barriere in der Form einer induzierbaren elektro-endoosmotischen Membran ist, die in der Lage ist, eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes zu steuern;

Mittel (119, 120), die angepasst sind, um Flüssigkeit zu der ersten Elektrodenzone (111) und der zweiten Elektrodenzone (112) zu übertragen; und Mittel (121), die angepasst sind, um einen Probenbestandteil zu dem ersten Zwischenvolumen (116) zu übertragen; und

(b) Steuern einer wesentlichen Flüssigkeitsvolumenbewegung unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes mit der wenigstens einen induzierbaren elektro-endo-osmotischen Membran.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Vorrichtung (200) weiter umfasst:

eine dritte Membran (222), die zwischen einer zweiten Elektrodenzone (212) und der ersten Membran (217) angeordnet ist, um dazwischen ein zweites Zwischenvolumen (226) zu definieren, wobei das erste Zwischenvolumen (216) von der ersten Elektrodenzone (211) durch die zweite Membran (218) getrennt ist, und das zweite Zwischenvolumen (226) von der zweiten Elektrodenzone (212) durch die dritte Membran (222) getrennt ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Vorrichtung (300) weiter umfasst:

eine dritte Elektrode (323) in einer dritten Elektrodenzone (331);

eine vierte Elektrode (324) in einer vierten Elektrodenzone (332), wobei die dritte Elektrode (323) relativ zu der vierten Elektrode (324) so angeordnet ist, dass sie angepasst ist, um dazwischen ein elektrisches Feld in einem zweiten elektrischen Feldbereich nach Anlegen eines zweiten elektrischen Potenzials zwischen der dritten und vierten Elektrode (323, 324) zu erzeugen;

eine vierte Membran (327), die in dem zweiten elektrischen Feldbereich angeordnet ist; eine fünfte Membran (328), die zwischen der dritten Elektrodenzone (331) und der vierten Membran (327) angeordnet ist, um dazwischen ein drittes Zwischenvolumen (336) zu definieren, wobei das dritte Zwischenvolumen (336) von der dritten und vierten Elektrodenzone (331, 332) durch die vierte und fünfte Membran (327, 328) getrennt ist, und wobei wenigstens entweder die vierte oder fünfte Membran (327, 328) eine Barriere ist, die in der Lage ist, eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes zu steuern;

Mittel, die angepasst sind, um Flüssigkeit zu der dritten Elektrodenzone (331) und zur vierten Elektrodenzone (332) zu übertragen; und

Mittel, die angepasst sind, um einen Probenbestandteil aus dem ersten oder zweiten Zwischenvolumen (316, 326) zu dem dritten Zwischenvolumen (336) zu übertragen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei die Vorrichtung weiter umfasst:

Mittel, die angepasst sind zum Abführen von Wärme, die in der Vorrichtung erzeugt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die induzierbare elektro-endoosmotische Membran ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zellulosetriacetat mit einem Molekülmassenausschluss von 5 bis 20 kDa, Polyvinylalkohol und mit Glutaraldehyd quervernetztem Poly(vinylalkohol). Verfahren nach Anspruch 18, wobei die induzierbare elektro-endo-osmotische Membran eine definierte Porengröße aufweist. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die induzierbare elektro-endo-osmotische Membran hergestellt ist aus Polyvinylalkohol oder mit Glutaraldehyd quervernetztem Polyvinylalkohol und eine definierte Porengröße von etwa 5 bis etwa 1000 kDa aufweist. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 20, wobei die induzierbare elektro-endoosmotische Membran benachbart zu einer der Elektrodenzonen ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 21, wobei eine oder mehrere Membranen Elektrophorese-Trennmembranen mit definierten Porengrößen sind. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Elektrophorese-Trennmembranen aus Polyacrylamid hergestellt sind. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Elektrophorese-Trennmembranen definierte Porengrößen von etwa 1 bis etwa 2000 kDa aufweisen. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 21, weiter umfassend die Schritte:

(a) Hinzugeben von Puffer oder Lösungsmittel zu der ersten und zweiten Elektrodenzone (111, 112);

(b) Hinzugeben von Puffer oder Lösungsmittel zu der dritten und vierten Elektrodenzone, sofern vorhanden;

(c) Hinzugeben der Probe zu dem ersten Zwischenvolumen (116);

(d) Anlegen eines elektrischen Potenzials zwischen den Elektroden (113, 114), was bedingt, dass sich Flüssigkeit in der Probe durch eine Membran in eine benachbarte Elektrodenzone (111, 112) bewegt; und

(e) optional Erhalten der konzentrierten Probe; wobei die Barrierenmembran eine Flüssigkeitsvolumenbewegung aus der Probe erlaubt und die Probe konzentriert wird.
Verfahren nach Anspruch 15 oder einem der Ansprüche 16 bis 24, sofern sie von Anspruch 15 abhängig sind, weiter umfassend die Schritte:

(a) Hinzugeben von Puffer oder Lösungsmittel zu der ersten und zweiten Elektrodenzone (211, 212);

(b) Hinzugeben von Puffer oder Lösungsmittel zu der dritten und vierten Elektrodenzone, sofern vorhanden;

(c) Hinzugeben der Probe zu dem ersten Zwischenvolumen (216);

(d) Hinzugeben von Puffer oder Flüssigkeit zu dem zweiten Zwischenvolumen (226);

(e) Anlegen eines elektrischen Potenzials zwischen den Elektroden (213, 214), was bedingt, dass sich wenigstens eine Verbindung aus der Probe durch eine Membran in eine benachbarte Elektrodenzone oder Zwischenvolumen bewegt; und

(f) optional Sammeln der Verbindung, die sich aus der Probe bewegte;

wobei die Barrierenmembran eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung in eines oder mehrere der Zwischenvolumina hinein oder aus einem oder mehreren der Zwischenvolumina heraus steuert, und wobei sich wenigstens ein Bestandteil aus einer Probe bewegt, während eine Flüssigkeitsvolumenbewegung gesteuert wird.
Verfahren nach Anspruch 16, oder einem der Ansprüche 17 bis 24, sofern sie von Anspruch 16 abhängig sind, weiter umfassend die Schritte:

(a) Hinzugeben von Puffer oder Elektrolyt zu der ersten, zweiten, dritten und vierten Elektrodenzone (311, 312, 331, 332);

(b) Hinzugeben der Probe zu dem ersten Zwischenvolumen (316);

(c) Hinzugeben von Puffer oder Flüssigkeit zu dem zweiten Zwischenvolumen (326);

(d) Anlegen eines ersten elektrischen Potenzials zwischen der ersten und zweiten Elektrode (313, 314), was bedingt, das sich wenigstens eine Verbindung aus der Probe durch eine Membran in das zweite Zwischenvolumen (326) bewegt;

(e) Durchführen einer Probe, die die Verbindung enthält, aus entweder dem ersten oder zweiten Zwischenvolumen (316, 326) in das dritte Zwischenvolumen (336);

(f) Anlegen eines zweiten elektrischen Potenzials zwischen der dritten und vierten Elektrode (323, 324), was bedingt, dass sich Flüssigkeit in dem dritten Zwischenvolumen (336) durch eine Membran in eine benachbarte Elektrodenzone (331, 332) bewegt, wodurch die Verbindung in der Probe aufkonzentriert wird; und

(g) optional Sammeln der konzentrierten Probe;

wobei die Barrierenmembran eine wesentliche Flüssigkeitsvolumenbewegung in das dritte Zwischenvolumen (336) steuert; und wobei wenigstens ein Bestandteil einer Probe bewegt wird, während eine Flüssigkeitsvolumenbewegung gesteuert wird.






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