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Dokumentenidentifikation DE60219468T2 03.01.2008
EP-Veröffentlichungsnummer 0001395825
Titel VERFAHREN ZUM NACHWEIS VON RHEUMATOIDEN POLYARTHRITIS-SPEZIFISCHEN AUTOANTIKÖRPERN
Anmelder Biomerieux, Marcy-L'Etoile, FR
Erfinder INCAURGARAT, Brigitte, F-69210 Lentilly, FR;
JOLIVET, Michel, F-69720 Saint Bonnet de Mure, FR;
LETOURNEUR, Odile, F-69110 Sainte Foy les Lyon, FR;
NOGUEIRA, Maria Leonor, F-31000 Toulouse, FR;
SEBBAG, Mireille, F-31500 Toulouse, FR;
SERRE, Guy, F-31100 Toulouse, FR;
VINCENT, Christian, F-31650 Lauzerville, FR
Vertreter Loesenbeck und Kollegen, 33602 Bielefeld
DE-Aktenzeichen 60219468
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, TR
Sprache des Dokument FR
EP-Anmeldetag 13.06.2002
EP-Aktenzeichen 027455260
WO-Anmeldetag 13.06.2002
PCT-Aktenzeichen PCT/FR02/02032
WO-Veröffentlichungsnummer 2002101390
WO-Veröffentlichungsdatum 19.12.2002
EP-Offenlegungsdatum 10.03.2004
EP date of grant 11.04.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 03.01.2008
IPC-Hauptklasse G01N 33/564(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse G01N 33/68(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Bei der rheumatoiden Polyarthritis (RP) handelt es sich um die am häufigsten auftretende Art von chronischem entzündlichen Rheumatismus. Es handelt sich um eine systemische Autoimmunkrankheit, die durch eine Entzündung der Gelenke gekennzeichnet ist und an der in Frankreich mehr als 500 000 Patienten und in den Vereinigten Staaten mehr als 2 Millionen Patienten leiden. Das Serum der betreffenden Patienten enthält Antikörper, von denen manche spezifisch sind und einen Marker für die Krankheit darstellen können, mit dem diese selbst im Frühstadium diagnostiziert werden kann.

Autoantikörper, die spezifisch bei RP-Patienten vorliegen und die mit einem Ratten-Ösophagusepithel-Antigen reagieren, wurden erstmals von B. J. J. Young et al., in Br. Med. J. 2:97–99 (1979) beschrieben. Damals wurden diese Autoantikörper "anti-Keratin-Antikörper" (AKA) genannt, es wurde jedoch anschließend gezeigt, daß es sich bei diesen Antikörpern tatsächlich um anti-Filaggrin-Autoantikörper (AFA) handelte. Ihre Antigene sind die sauer-neutralen Formen der Filaggrine (Simon et al., J. Clin. Invest., 92, 1387, (1993)).

Filaggrin entsteht aus Profilaggrin, bei dem es sich um ein phosphoryliertes Polyprotein der Keratohyalinkörner der Epidermis handelt. Profilaggrin weist ein höheres Molekulargewicht auf (ungefähr 400 000 beim Menschen) und ist in Gegenwart von hohen Salz- oder Harn-Konzentrationen löslich. Es weist einen starken Gehalt an basischen Aminosäuren (Arginin und Histidin) sowie an Glycin, Serin und Glutaminsäure auf. Es ist arm an unpolaren Aminosäuren und enthält weder Methionin noch Cystein noch Tryptophan. Es ist an den Serinresten stark phosphoryliert, was ihm einen isoelektrischen Punkt um den Neutralitätspunkt herum verleiht.

Profilaggrin wird während eines komplexen Reifungsvorgangs, an dem eine Dephosphorylierung beteiligt ist, und anschließend durch Spaltung mit Proteasen an den Abschnitten zwischen den Domänen in Filaggrineinheiten gespalten. Aus dieser Spaltung gehen zuerst Fragmente mit einer mittleren Größe und anschließend die funktionellen Filaggrinmoleküle hervor.

Die durch die Dephosphorylierung und Spaltung des Profilaggrins entstandenen Filaggrine sind basische Proteine, deren Aminosäuregehalt dem der Profilaggrine ähnlich ist. Sie nehmen am Aufbau der Keratinfilamente teil und machen eine progressive Reifung durch, während der die basischen Argininreste durch Einwirkung der Peptidylarginindesaminase in neutrale Citrullinreste umgewandelt werden (Harding C.R. und Scott I. R., J. Mol. Biol. 170, S. 651–673 (1983)). Dies führt zu einer Verringerung ihrer Affinität für die Keratine, von denen sie sich ablösen; sie werden nun durch Einwirkung von verschiedenen Proteasen vollständig abgebaut.

Die Eigenschaften der Filaggrine und Profilaggrine wurden besonders gut an der Ratte, an der Maus und am Menschen untersucht. Die Größe der Profilaggrine schwankt je nach Art von 300 bis 400 kD und die Größe der Filaggrine von 27 bis 64 kD.

Das Gen, das für Profilaggrin codiert, besteht aus wiederholten Untereinheiten, von denen jede für ein Filaggrinmolekül codiert und die durch Abschnitte, die für die Peptidsegmente zwischen den Domänen codieren, getrennt sind. Alle wiederholten Einheiten, die für jedes der menschlichen Filaggrine codieren, weisen dieselbe Länge auf (972 Basenpaare beim Menschen); beim Menschen werden jedoch zwischen den einzelnen Untereinheiten starke Sequenzvariationen beobachtet (10–15%). Obwohl die meisten dieser Variationen konservativ sind, führen manche dieser Variationen zu Aminosäuremodifikationen und in gewissen Fällen zu Modifikationen der elektrischen Ladung des Proteins. So bilden die menschlichen Filaggrine unabhängig von dem posttranskriptionellen Modifikationen eine heterogene Population von Molekülen mit ähnlicher Größe, jedoch unterschiedlichen Sequenzen und Ladungen (pHi 8,3 ± 1,1) (Gan et al., Biochem. 29, S. 9432–9440 (1990)).

Der beim Menschen zwischen den Filaggrineinheiten innerhalb ein- und desselben Profilaggringens beobachtete Polymorphismus wird bei der Ratte und bei der Maus nicht beobachtet. Außerdem weisen die Filaggrine eine große Sequenzvariabilität zwischen und innerhalb der Spezies auf. Diese Variabilität beeinflußt jedoch nicht ihre funktionellen Eigenschaften oder ihre Aminosäurezusammensetzung insgesamt, sowie ihre biochemischen Eigenschaften. Ebenso sind die Vorkommen von Profilaggrin und der Filaggrine in den Geweben bei den verschiedenen untersuchten Säugetieren identisch.

Die Autoantikörper (AFA) stehen mit klinischen und biologischen Parametern in Zusammenhang, die die aktivsten und schwersten Formen der Krankheit definieren und die vor dem Erscheinen von klinischen Symptomen auftreten. Ihr Nachweis bildet daher einen wesentlichen Schritt in der RP-Diagnose.

Gemäß der an die Anmelderin ausgegebenen Schrift WO-A-98/08946 wurde nun ein Verfahren zum Nachweisen von AFA in einer biologischen Probe entwickelt, das auf der Entdeckung beruht, daß die Citrullinisierung des Filaggrins für den Nachweis der AFA, die in Seren von RP-Patienten vorliegen, erforderlich ist, wobei diese Citrullinisierung Epitope erzeugt, die von den AFA erkannt werden. Dieses Verfahren umfaßt die folgenden Schritte:

man bringt die untersuchte biologische Probe mit einem rekombinanten citrullinisierten Filaggrin oder einem Fragment davon unter Bedingungen, die sich für die Bildung von Immunkomplexen mit den AFA eignen, in Kontakt, und

man weist die Bindung der schließlich mit dem AFA gebildeten Immunkomplexe nach.

Die Ergebnisse zeigen, daß das Verfahren sehr empfindlich ist, wobei ein Großteil der Sera von RP-Patienten das rekombinante citrullinisierte Filaggrin erkennt.

Man hat jedoch während Schritten der RP-Diagnose bei Patienten, deren Sera in diesem Verfahren positiv waren, bemerkt, daß es sich nicht bei allen um RP-Fälle handelte. Dieses Verfahren führt nämlich zum Nachweis von Falsch-Positiven, wie dies in den folgenden Beispielen erläutert werden wird, und kann daher aufgrund unzureichender Spezifität nicht verläßlich verwendet werden.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nun einen neuen ELISA-Test für die Diagnose von RP bei Patienten entwickelt, der hoch spezifisch ist und trotzdem die hohe Empfindlichkeit des genannten Verfahrens aufweist.

Gemäß diesem Verfahren weist man Autoantikörper (AFA), die für die rheumatoide Polyarthritis (RP) spezifisch sind, in einer biologischen Probe nach, die diese Antikörper (AFA) sowie andere, nicht für die RP spezifische Antikörper enthalten kann, wobei man folgendermaßen vorgeht:

man verfügt erstens über ein Filaggrin (NCF) oder über ein Filaggrin (NCF)-Derivat oder über ein Filaggrinpeptid (NCFP), wobei dieses Peptid nach Citrullinisierung über einen Epitop des Filaggrins verfügt, sowie zweitens über dieses citrullinisierte Filaggrin (CF) oder ein Derivat dieses citrullinisierten Filaggrins (CF) oder dieses citrullinisierten Peptids (CFP), wobei die Citrullinisierung darin besteht, daß ein oder mehrere Argininrest(e) in Citrullin umgewandelt wurde(n),

man bringt diese biologische Probe erstens mit dem Filaggrin (NCF) oder dem Filaggrin (NCF)-Derivat oder dem Peptid (NCFP) und zweitens dem citrullinisierten Filaggrin (CF) oder dem Derivat des citrullinisierten Filaggrins (CF) oder dem citrullinisierten Peptid (CFP) unter Bedingungen, die sich für die Bildung von Immunkomplexen mit den Autoantikörpern (AFA) eignen, in Kontakt,

man weist die Bildung von Immunkomplexen, die zwischen den Autoantikörpern (AFA) oder anderen Antikörpern, die in der Probe vorliegen, und erstens dem Filaggrin (NCF) oder dem Filaggrin (NCF)-Derivat oder dem Peptid (NCFP) und zweitens dem citrullinisierten Filaggrin (CF) oder dem Derivat dieses citrullinisierten Filaggrins (CF) oder dem citrullinisierten Peptid (CFP) gebildet werden, nach und bestimmt diese quantitativ, wobei die quantitative Bestimmung durch einen Wert XCN bzw. XC ausgedrückt wird,

man subtrahiert den Wert XCN von XC.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Filaggrin (NCF) oder das Filaggrin (NCF)-Derivat oder das Peptid (NCFP) auf einem festen Träger immobilisiert und das Filaggrin (CF) oder ein Filaggrin (CF)-Derivat oder das Peptid (CFP) wird auf einem anderen festen Träger immobilisiert. Es kann sich unter anderem um zwei Näpfchen einer Mikrotiterplatte oder um zwei kegelförmige Vertiefungen des Vidas-Geräts (eingetragenes Warenzeichen), das von der Anmelderin vertrieben wird, handeln, jedoch auch um Streifchen oder einen sonstigen geeigneten Träger.

Bevor die Erfindung nun detaillierter beschrieben wird und ihre bevorzugten Varianten vorgestellt werden, werden einige in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendeten Begriffe definiert.

Bei der Citrullinisierung handelt es sich um die Überführung eines Argininrests in einen Citrullinrest, und zwar durch Umwandlung der -C(NH)NH2-Gruppe des Arginins in -CONH2. Die Reaktion wird vorteilhaft in vitro durch das Enzym Peptidylarginindesaminase (PAD) durchgeführt. Bei diesem Enzym kann es sich um eine Kaninchenmuskel-PAD handeln; es bleibt jedoch dem Fachmann überlassen, eine andere geeignete PAD auszuwählen. Es ist natürlich jede andere Art der Citrullinisierung wie chemische Reaktionen oder Mikroorganismen denkbar.

Erfindungsgemäß versteht man unter einem citrullinisierten Filaggrin, daß ein Teil von ungefähr mindestens 20% der Argininreste in Citrullinreste umgewandelt worden ist, wobei diese Umwandlung zufallsmäßig erfolgt. Vorzugsweise beträgt dieser Prozentsatz mindestens 30%, vorteilhaft mindestens 50%. Es wurde beobachtet, daß die Immunreaktivität eines citrullinisierten Filaggrins, dessen Citrullinisierungsgrad ungefähr 80% beträgt, der Immunreaktivität eines Filaggrins, dessen Citrullinisierungsgrad ungefähr 50% beträgt, ähnlich ist. Unter diesen Bedingungen ist es daher nicht zweckdienlich, zu versuchen, höhere Citrullinisierungsgrade zu erzielen.

Wird die Citrullinisierung nicht zufallsmäßig durchgeführt, sondern regelspezifisch, und insbesondere, wenn man die Umwandlungsreaktion auf einen Argininrest beschränken kann, der nach der Citrullinisierung zu einem Filaggrin-Epitop gehört, so kann der Citrullinisierungsgrad unter den oben genannten Werten liegen, ohne daß dadurch die Immunreaktivität des so citrullinisierten Filaggrins beeinträchtigt wird.

Unter einem Filaggrin (NCF)-Derivat oder einem entsprechenden citrullinisierten Derivat versteht man ein chimäres Filaggrin, das aus einer Kombination von (einem) Fragment(en) von Sequenzen des menschlichen Filaggrins und des Ratten-Filaggrins und/oder einer Kombination von (einem) Fragment(en) von Sequenzen des menschlichen Filaggrins und/oder des Ratten-Filaggrins und (einem) Konsensus-Peptid(en) besteht.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens stammt das Filaggrin vorzugsweise aus der Reihe menschliches Filaggrin und Filaggrin tierischen Ursprungs. Es besteht vorzugsweise aus einem rekombinanten Ratten-Filaggrin mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1.

Statt dem Filaggrin kann man ein Filaggrin-Peptid (NCFP), dessen Sequenz mindestens einen Argininrest aufweist, und das entsprechende citrullinisierte Peptid (CFP), bei dem dieser Argininrest von mindestens dem PFNC in einen Citrullinrest umgewandelt worden ist, wählen. Gemäß einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt das Peptid einen Filaggrin-Epitop nach Citrullinisierung. So kann ein Peptid (NCFP) insbesondere aus der Reihe der folgenden Peptide stammen:

  • – das Peptid S47S, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist und das den Aminosäuren 71 bis 119 der Sequenz einer Einheit von Human-Filaggrin entspricht und das sechs Argininreste enthält,
  • – das Peptid E12H, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist, wie sie durch Vergleich mit Nukleotidsequenzen des Gens für das menschliche Profilaggrin gemäß Gan S.Q. et al. (Biochemistry, 29: 9432–9440, (1990)) bestimmt wurde und das 1 Argininrest enthält,
  • – das Peptid E12D, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 4 dargestellt ist, wie sie durch Vergleich mit Nukleotidsequenzen des Gens für das menschliche Profilaggrin gemäß Gan S.Q. et al. (Biochemistry, 29: 9432–9440, (1990)) bestimmt wurde und das 3 Argininreste enthält,
  • – das Peptid G22Q, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 5 dargestellt ist und das einer Konsensus-Sequenz einer Einheit des Ratten-Filaggrins, das 4 Argininreste enthält, entspricht,
  • – das Peptid G26E, dessen Sequenz in SEQ ID Nr. 6 dargestellt ist und das einer Konsensus-Sequenz einer Einheit des Ratten-Filaggrins, das 10 Argininreste enthält, entspricht.

Wie oben erwähnt, weist, wenn man für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens über ein Filaggrin (NCF) verfügt, das verwendete citrullinisierte Filaggrin (CF) die Peptidsequenz des Filaggrins (NCF) auf, in der mindestens 20%, vorzugsweise mindestens 30% und noch besser mindestens 50% der Argininreste des NCF citrullinisiert sind.

Die Autoantikörper (AFA) sind zirkulierende Autoantikörper, und eine biologische Probe, die es gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zu analysieren gilt, kann aus der Reihe Blut, Plasma und Serum stammen.

Nachweis und Quantifizierung der gebildeten Immunkomplexe erfolgen nach beliebigen fachbekannten Techniken, insbesondere durch Verwendung eines Enzyms für den Nachweis und seines colorimetrischen oder fluoreszierenden Substrats für die Quantifizierung (zum Beispiel: alkalische Phosphatase/4-Methylumbelliferylphosphat, Peroxidase/ortho-Phenylendiamin).

Wie dies in den Beispielen erläutert werden wird, kann man also die gebildeten Immunkomplexe mit einem Konjugat in Kontakt bringen, das aus einem markierten Antikörper gegen Human-Immunglobuline besteht, und zwar unter Bedingungen, die sich für die Bildung von markierten Immunkomplexen eignen, wonach man die markierten Immunkomplexe nachweist und quantitativ bestimmt.

Bei dem Konjugat handelt es sich vorteilhaft um einen vollständigen oder in Fragmente geteilten Antikörper gegen Human-Immunglobulin (zum Beispiel Fab'-, Fab'2-Fragmente), der mit Peroxidase oder mit alkalischer Phosphatase markiert ist, wonach man die Bildung von markierten Immunkomplexen colorimetrisch oder fluorimetrisch nachweist und quantitativ bestimmt, wobei die quantitative Bestimmung durch einen Wert XNC bzw. XC für die optische Dichte oder die Fluoreszenz ausgedrückt wird.

Ein positiver Test, mit dem das Vorliegen von für RP spezifischen Autoantikörpern (AFA) in der analysierten Probe nachgewiesen wird, ist dadurch gekennzeichnet, daß der XC-Wert größer als der XNC-Wert ist.

Die Erfindung wird im folgenden erläutert und ihre Eigenschaften und Vorteile werden dargestellt.

Beispiel 1: Herstellung eines rekombinanten RattenFilaggrins A) Klonierung des Ratten-Profilaggrin-Gens

Die Arbeiten von Haydock und Dale, 1986 (J. Biol. Chem., 261, 12520–12525) und Rothnagel et al., 1987 (J. Biol. Chem., 262, 15643–15648) haben gezeigt, daß das Ratten-Profilaggrin-Gen aus 20 ± 2 wiederholten Einheiten mit ungefähr 1 200 Basenpaaren (Bp) besteht und über kein Intron in seiner Codierregion verfügt, wobei jede Profilaggrineinheit aus eine Filaggrindomäne und einer Bindesequenz besteht.

Außerdem wurde die Codiersequenz für zwei unvollständige Profilaggrin-Einheiten von Haydock und Dale, 1990 (DNA Cell Biol., 9, 251–261) veröffentlicht.

Ausgehend von diesen Daten wurden nun Oligonukleotide für die PCR-Amplifikation der Codiersequenz für eine vollständige Ratten-Profilaggrin-Einheit entwickelt.

Die genomische DNA-Matrix der Ratte wurde aus Vollblut einer Wistar-Ratte hergestellt. Mit drei unterschiedlichen Oligonukleotidpaaren gelangte man zu drei verschiedenen PCR-Produkten. Diese PCR-Produkte wurden in einen pCAPs-Vektor (PCR-Klonierkit, Boehringer) kloniert und sequenziert. Sie weisen eine starke Homologie zueinander (mehr als 99%) sowie eine Homologie von 95 bzw. 98% mit den beiden von Haydock und Dale, 1990, veröffentlichten unvollständigen Profilaggrin-Einheiten auf.

Diese Werte bestätigen die Art der erhaltenen DNA und legen nahe, daß die verfügbaren Sequenzen für existierende Ratten-Filaggrindomänen typisch sind, wobei eine gewisse Variabilität innerhalb und zwischen den einzelnen Tieren erwartet wird.

Eine der erhaltenen Sequenzen wurde in einen pMR-Expressionsvektor (Cheynet et al., 1993, Prot. Exp. Purif., 4, 367–372) kloniert, und zwar in Fusion mit einer Codiersequenz für sechs Histidine am 5'-Ende. Mit diesem Konstrukt, das die Bezeichnung pOL041 trägt, wurden E. coli-Bakterien transformiert. Das Konstrukt codiert für ein Protein mit 399 Aminosäuren und einem theoretischen Molekulargewicht von 42 210, das die Sequenz SEQ ID Nr. 1 aufweist.

B) Expression und Aufreinigung von rekombinantem Ratten-Filaggrin Kultur:

Für die Kultivierung des transformierten E. coli-Stamms (BL21 oder DH5&agr;) wird eine Vereinzelung der bei –80°C aufbewahrten Stammkultur auf Agarmedium mit 0,1 mg/ml Ampicillin durchgeführt.

Ausgehend von einer isolierten Kolonie wird eine Vorkultur im Flüssigmedium (Hefeextrakt, 2% Glucose und 0,1 mg/ml Ampicillin) in Erlenmeyer-Kolben bei +37°C und unter kreisförmigem Schütteln (280 U/min) hergestellt.

Mit dieser Vorkultur werden anschließend Kultur-5-Liter-Erlenmeyer-Kolben inokuliert, die jeweils 1 l desselben Mediums enthalten, das gegebenenfalls mit PMSF auf einen Endgehalt von 0,5 mM vervollständigt wurde. Diese Erlenmeyer-Kolben werden bei +37°C unter Bewegen bei 280 U/min so lange kultiviert, bis man zu einer OD600nm von 0,8 gelangt. Ab diesem OD-Wert wird noch drei Stunden lang weiter kultiviert.

Diese Kultur wird nun gestoppt und 25 Minuten lang bei 6 000 g zentrifugiert. Die Bakterien-Pellets werden nun gewonnen und bei –25°C aufbewahrt.

Aufreinigung:

Das Bakterien-Pellet wird durch Einwirkung von Lysozym in Gegenwart von Protease-Hemmern in einem Puffer aus 0,1 M NaH2PO4/0,6 M NaCl/0,2% Tween/1 mM Natriumazid/6 mM Imidazol, pH 7,3, sowie Ultraschallbehandlung lysiert. Dieses Lysat wird nun 30 Minuten lang bei 23 700 g geklärt und der Überstand wird aufbewahrt.

Das rekombinante Filaggrin wird chromatographisch durch Metallchelation (Nickel) bei +4°C aufgereinigt.

Kurz nachdem das Gel erneut im Lysepuffer äquilibrieren gelassen wurde, wird der Lyse-Überstand auf die Säule aufgetragen, wonach sich ein Waschen mit dem Puffer 0,1 M NaH2PO4/0,6 M NaCl/1 mM Natriumazid/6 mM Imidazol, pH 7,3 (und ein UV-Nachweis des Signals bei 280 nm) anschließt, bis das UV-Nachweissignal bei 280 nm wieder auf die "Base Line" zurückkehrt.

Das rekombinante Filaggrin (rFlg), das auf das Gel adsorbiert wurde, wird mit dem Puffer 0,1 M NaH2PO4/0,6 M NaCl/1 mM Natriumazid/0,5 M Imidazol, pH 7,15, eluiert.

Die so erhaltene Fraktion wird auf einer 10-kDa-Membran konzentriert.

Der letzte Aufreinigungsschritt erfolgt durch Gelfiltrationschromatographie auf einem Superdex-200-Träger in einem Puffer aus 20 mM Tris/0,3 M NaCl, pH 11. Das Konzentrat wird auf die Säule aufgetragen und die Fraktionen werden durch Verfolgen des UV-Signals bei 280 nm und 214 nm aufgefangen. Mit diesem Schritt kann man das immunologisch aktive rekombinante Filaggrin von Interesse im zweiten Elutions-Peak isolieren und gewinnen (MG ≈ 42 000).

Beispiel 2: Citrullinisierung des rekombinanten Filaggrins

Nach dem Gesamtprotein-Assay nach dem Verfahren von Bradford (Recktanten von Biorad) wird die Citrullinisierung durchgeführt, und zwar durch vierstündige Einwirkung der Peptidylarginindeiminase bei +37°C unter Rühren mit dem Magnetrührer, mit 4 Enzymeinheiten/mg Gesamtproteine sowie in Gegenwart von 0,1 M EDTA/1 M DTT/0,5 M CaCl2. Der Gesamtproteingehalt wird nun erneut im Assay bestimmt, und zwar an der deiminierten Fraktion.

Das citrullinisierte Filaggrin wird mittels Ni-NTA-Chromatographie gereinigt und anschließend mittels Gelfiltrationschromatographie.

Der nachgewiesene Citrullinisierungsgrad beträgt 53%.

Beispiele 3 und 4 unten erläutern die RP-Diagnose bei einem Nachweisverfahren des Standes der Technik und einem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren, um diese vergleichen zu können.

Das Nachweisverfahren des Standes der Technik besteht aus einem ELISA-Test, wie er in der Schrift WO-98/08946, die an die Anmelderin ausgegeben wurde, beschrieben ist, wobei citrullinisiertes Filaggrin verwendet wird, und wobei der Test auf dem Nachweis der zwischen den AFA-Antikörpern, die gegebenen falls in der Probe vorhanden sind, und dem citrullinisierten Filaggrin gebildeten Immunkomplexe beruht.

Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren ist ein ELISA-Test, bei dem citrullinisiertes Filaggrin und nichtcitrullinisiertes Filaggrin eingesetzt werden und der auf dem parallelen Nachweis von Immunkomplexen, die einerseits mit dem citrullinisierten Filaggrin und andererseits mit dem nichtcitrullinisierten Filaggrin gebildet werden sowie auf dem Unterschied der Werte zwischen beiden beruht.

Beispiel 3: A) Proben

Die Tests wurden an den folgenden Proben durchgeführt:

63 Kontrollsera mit den folgenden Pathologien:

Algodystrophie, Gicht, maligne Hämatopathie, Morbus Paget, Neuralgie, mechanische Pathologie, Periarteritis nodosa, Polymyositis, Lupusrheumatismus, Psoriasisrheumatismus, Sklerodermie, Spondylarthritis ankylopoetica, Spondylarthropathie, Goujerot-Syndrom, Sharp-Syndrom, Vaskulitis.

65 Sera von Patienten mit klinisch diagnostizierter rheumatoider Polyarthritis.

B) Material

  • Platte: Nunc Maxisorp 468667
  • Ofen bei 35–39°C
  • Axia-Mikroplattenwaschgerät U4402
  • Biotek (Handelsbezeichnung) Plattenlesegerät

C) Vorschrift

  • Auftragen in die Näpfchen: pro Näpfchen 100 &mgr;l 2,5 &mgr;g/ml Filaggrin, zwei Stunden bei 37°C in PBS-Puffer, pH 7,2

    dreimal Waschen mit 300 &mgr;l PBS/0,05% Tween-Puffer, pH 7,2, pro Näpfchen

    eine Stunde Passivieren bei 37°C mit 250 &mgr;l PBS/1% BSA Puffer, pH 7,2, pro Näpfchen

    dreimal Waschen mit 300 &mgr;l PBS/0,05% Tween-Puffer, pH 7,2, pro Näpfchen

    einstündiges Inkubieren bei 37°C mit 100 &mgr;l 1/100verdünntem Serum in dem folgenden Puffer: 10 mM Tris, 350 mM NaCl, 1% Triton × 100, 1% BSA, 10% Kaninchenserum, pH 7,6, pro Näpfchen

    dreimal Waschen mit 300 &mgr;l PBS/0,05% Tween-Puffer, pH 7,2, pro Näpfchen

Inkubation eines anti-human-IgG-Konjugats, das mit dem folgenden Puffer verdünnt wurde: 10 mM Tris, 350 mM NaCl, 1% Triton × 100, 1% BSA, 10% Kaninchenserum, pH 7,6; 100 &mgr;l pro Näpfchen

dreimal Waschen mit 300 &mgr;l PBS/0,05% Tween-Puffer, pH 7,2, pro Näpfchen

Enzymentwicklung:

  • – 100 &mgr;l ortho-Phenylendiamin (OPD) pro Näpfchen
  • – 10 min Inkubation bei 18–25°C
  • – Blockieren mit 100 &mgr;l H2SO4
  • – Abblesen bei 492 nm

Der Assay der Proben wird parallel auf einer mit nichtcitrullinisiertem Filaggrin beschichteten Platte und einer anderen, mit citrullinisiertem Filaggrin beschichteten Platte durchgeführt.

Der Assay der Proben wird in einfacher Wiederholung durchgeführt.

Die Ergebnisse werden als optische Dichte ausgedrückt.

Die Signale, deren, optische Dichte als 3 angegeben wird, sind gleich oder größer 3.

D) Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 unten zusammengefaßt.

Mit den an citrullinisiertem Filaggrin gemäß WO-A-98/08946 erhaltenen Ergebnissen (Tabelle 1) erzielt man die folgenden Leistungen: 100% Spezifität Schwelle bei 1,337 34% Empfindlichkeit (22/65) 98% Spezifität Schwelle bei 0,937 38% Empfindlichkeit (22/65) 95% Spezifität Schwelle bei 0,335 61,5% Empfindlichkeit (40/65)

Mit den an citrullinisiertem Filaggrin/nichtcitrullinisiertem Filaggrin erfindungsgemäß erhaltenen Ergebnissen (Tabelle 2) erzielt man die folgenden Leistungen: 100% Spezifität Schwelle bei 0,731 38% Empfindlichkeit (25/65) 98% Spezifität Schwelle bei 0,009 69% Empfindlichkeit (45/65) 95% Spezifität Schwelle bei –0,004 77% Empfindlichkeit (50/65)

In beiden Fällen sind bei 95% Spezifität 3 Sera falschpositiv.

Bei allen Proben, bei denen der Nachweis an der citrullinisierten Filaggrinphase erfolgt, erfolgt der Nachweis mit dem Differentialsystem bei 100% und 98% Spezifität. Bei dem Differentialsystem erfolgt der Nachweis bei nur einem Serum mehr. Bei 95% Spezifität erfolgt mit dem Differentialsystem der Nachweis bei sieben Proben mehr.

Das Differentialsystem ist an dieser Population mit 69% Empfindlichkeit bei 98% Spezifität leistungsfähiger als die citrullinisierte Filaggrinphase.

Bei dieser Population wurde mit den üblicherweise verwendeten Tests die folgende Leistung erzielt: GIFOR (Immunfluoreszenz an Ratten-Ösophagusschnitt) 98% Spezifität Schwelle bei 2 49% Empfindlichkeit (32/65)
Gblot 98% Spezifität Schwelle bei 2,25 58% Empfindlichkeit (38/65)

Die mit ELISA an Ratten-Filaggrin erzielte Leistung übertrifft die derzeit verwendeten Techniken, nämlich GIFOR und Gblot. Tabelle 1 OD492 nm-Ergebnisse vom ELISA-Test an citrullinisiertem Filaggrin (CF) negative Kontrolle CF RP-Sera CF 58 0.050 78 0.051 57 0.056 76 0.059 10 0.058 72 0.077 33 0.060 74 0.077 51 0.062 81 0.079 53 0.062 79 0.088 44 0.064 73 0.091 54 0.066 71 0.098 47 0.069 80 0.102 49 0.069 75 0.109 38 0.070 65 0.113 39 0.070 86 0.121 40 0.071 66 0.124 50 0.072 83 0.132 29 0.073 69 0.141 45 0.073 77 0.147 25 0.076 84 0.151 55 0.076 85 0.156 28 0.079 90 0.157 42 0.083 67 0.158 46 0.083 68 0.158 60 0.085 70 0.202 43 0.087 89 0.207 31 0.088 88 0.276 34 0.088 92 0.299 37 0.090 93 0.387 41 0.090 87 0.409 16 0.092 64 0.434 35 0.092 82 0.472 48 0.092 95 0.496 26 0.093 98 0.499 52 0.093 96 0.524 17 0.097 94 0.535 61 0.098 100 0.611 27 0.111 99 0.659 19 0.113 91 0.667 20 0.113 103 0.726 4 0.116 101 0.729 22 0.116 102 0.801 36 0.123 97 0.853 18 0.124 104 0.939 24 0.124 105 1.203 14 0.128 106 1.240 12 0.129 107 1.526 23 0.130 108 1.694 7 0.133 109 1.900 5 0.134 110 2.076 9 0.135 111 2.387 30 0.142 114 2.593
Tabelle 1 (Fortsetzung) negative Kontrolle CF RP-Sera CF 59 0.146 112 2.610 6 0.158 113 3.000 21 0.159 115 3.000 11 0.166 116 3.000 32 0.167 117 3.000 15 0.169 118 3.000 62 0.193 119 3.000 56 0.222 120 3.000 3 0.253 121 3.000 13 0.269 122 3.000 1 0.335 123 3.000 8 0.369 124 3.000 63 0.937 125 3.000 2 1.337 126 3.000 127 3.000 128 3.000
Tabelle 2 OD492nm-Ergebnisse vom ELISA-Test an citrullinisiertem Filaggrin (CF) und nichtcitrullinisiertem Filaggrin (NCF) negative Kontrollen NCF CF CF-NCF RP-Sera NCF CF CF-NCF 1 0.780 0.335 –0.445 64 0.777 0.434 –0.343 2 1.747 1.337 –0.410 65 0.202 0.113 –0.089 3 0.433 0.253 –0.180 66 0.204 0.124 –0.080 4 0.268 0.116 –0.152 67 0.222 0.158 –0.064 5 0.271 0.134 –0.137 68 0.221 0.158 –0.063 6 0.294 0.158 –0.136 69 0.195 0.141 –0.054 7 0.262 0.133 –0.129 70 0.255 0.202 –0.053 8 0.492 0.369 –0.123 71 0.131 0.098 –0.033 9 0.231 0.135 –0.096 72 0.109 0.077 –0.032 10 0.149 0.058 –0.091 73 0.115 0.091 –0.024 11 0.256 0.166 –0.090 74 0.099 0.077 –0.022 12 0.218 0.129 –0.089 75 0.131 0.109 –0.022 13 0.351 0.269 –0.082 76 0.072 0.059 –0.013 14 0.209 0.128 –0.081 77 0.157 0.147 –0.010 15 0.248 0.169 –0.079 78 0.055 0.051 –0.004 16 0.158 0.092 –0.066 79 0.090 0.088 –0.002 17 0.162 0.097 –0.065 80 0.104 0.102 –0.002 18 0.188 0.124 –0.064 81 0.079 0.079 0.000 19 0.174 0.113 –0.061 82 0.466 0.472 0.006 20 0.173 0.113 –0.060 83 0.124 0.132 0.008 21 0.219 0.159 –0.060 84 0.137 0.151 0.014 22 0.171 0.116 –0.055 85 0.137 0.156 0.019 23 0.179 0.130 –0.049 86 0.101 0.121 0.020 24 0.172 0.124 –0.048 87 0.372 0.409 0.037 25 0.123 0.076 –0.047 88 0.236 0.276 0.040 26 0.139 0.093 –0.046 89 0.137 0.207 0.070 27 0.153 0.111 –0.042 90 0.057 0.157 0.100 28 0.120 0.079 –0.041 91 0.514 0.667 0.153 29 0.113 0.073 –0.040 92 0.058 0.299 0.241 30 0.181 0.142 –0.039 93 0.134 0.387 0.253 31 0.126 0.088 –0.038 94 0.240 0.535 0.295 32 0.204 0.167 –0.037 95 0.156 0.496 0.340 33 0.096 0.060 –0.036 96 0.122 0.524 0.402 34 0.122 0.088 –0.034 97 0.424 0.853 0.429 35 0.125 0.092 –0.033 98 0.063 0.499 0.436 36 0.156 0.123 –0.033 99 0.208 0.659 0.451 37 0.122 0.090 –0.032 100 0.117 0.611 0.494 38 0.101 0.070 –0.031 101 0.207 0.729 0.522 39 0.101 0.070 –0.031 102 0.165 0.801 0.636 40 0.098 0.071 –0.027 103 0.072 0.726 0.654 41 0.117 0.090 –0.027 104 0.142 0.939 0.797 42 0.110 0.083 –0.027 105 0.231 1.203 0.972 43 0.112 0.087 –0.025 106 0.087 1.240 1.153 44 0.089 0.064 –0.025 107 0.118 1.526 1.408 45 0.097 0.073 –0.024 108 0.268 1.694 1.426 46 0.107 0.083 –0.024 109 0.136 1.900 1.764 47 0.092 0.069 –0.023 110 0.095 2.076 1.981 48 0.113 0.092 –0.021 111 0.127 2.387 2.260 49 0.089 0.069 –0.020 112 0.256 2.610 2.354 50 0.091 0.072 –0.019 113 0.555 3.000 2.445
Tabelle 2 (Fortsetzung) negative Kontrontrollen CF NCF CF-NCF RP-Sera NCF CF CF-NCF 51 0.081 0.062 –0.019 114 0.128 2.593 2.465 52 0.112 0.093 –0.019 115 0.518 3.000 2.482 53 0.081 0.062 –0.019 116 0.338 3.000 2.662 54 0.083 0.066 –0.017 117 0.315 3.000 2.685 55 0.092 0.076 –0.016 118 0.295 3.000 2.705 56 0.233 0.222 –0.011 119 0.224 3.000 2.776 57 0.065 0.056 –0.009 120 0.184 3.000 2.816 58 0.058 0.050 –0.008 121 0.184 3.000 2.816 59 0.153 0.146 –0.007 122 0.181 3.000 2.819 60 0.089 0.085 –0.004 123 0.171 3.000 2.829 61 0.095 0.098 0.003 124 0.160 3.000 2.840 62 0.184 0.193 0.009 125 0.145 3.000 2.855 63 0.206 0.937 0.731 126 0.081 3.000 2.919 127 0.062 3.000 2.938 128 0.056 3.000 2.944

Beispiel 4:

Mit diesem Beispiel läßt sich ein erfindungsgemäßer Diagnostik-Test, nämlich der ArFa-ELISA-Test, und mehrere Diagnostik-Tests des Standes der Technik, die im Handel erhältlich sind oder bei denen bekannte Verfahren eingesetzt werden, nämlich der Immunfluoreszenz-AKA-Test, der AhFA-IB-Test, der AhFA-ELISA-Test und der CCP-ELISA-Test, verglichen werden.

A) Proben

Die Tests wurden an 711 Sera durchgeführt, von denen 240 von Patienten mit rheumatoider Polyarthritis (RP) stammten und 471 von Nicht-RP-Patienten stammten. Unter den Nicht-RP-Patienten litten 157 an einer entzündlichen Krankheit aus der Reihe progressiver Lupus erythematosus (21), generalisierter Sklerodermie (9), Psioriosis rheumatismus (43), Spondylarthritis ankylopoetica (40) und anderen Entzündungskrankheiten (44), während 314 an einer Nicht-Entzündungskrankheit aus der Reihe Arthrose (104), kompressiver Neuropathie (25), Morbus Paget (68), sympathischer Reflexdystrophie (29), schweren Knochenerkrankungen (49) und anderen Nicht-Entzündungskrankheiten (39) litten.

Bei dem Filaggrin handelt es sich um ein rekombinates Ratten-Filaggrin; das nichtcitrullinisierte Filaggrin wird gemäß Beispiel 1 erhalten und das citrullinisierte Filaggrin wird durch Citrullinisierung (Citrullinisierungsgrad der Argininreste: 40%) von nichtcitrullinisiertem Filaggrin gemäß Beispiel 2 erhalten.

B) Vorschrift

Der Nachweis von Antikörpern im AKA-Immunfluoreszenztest und im AhFA-IB-Test wurde nach den bei C. Vincent et al., Ann. Rheum. Dis. (1989) 48, 712–722, und C. Vincent et al., J. Rheumatol. (1998) 25, 838–846 beschriebenen Verfahren durchgeführt.

Der AhFA-Elisa-Test wird nach dem von L. Nogueira et al., Ann. Rheum. Dis (2001) 60, 882–887 beschriebenen Verfahren eingesetzt.

Der CCP-Elisa-Test wird mit dem Material ImmunoscanTM RA (Euro-diagnostica, Arnheim, Niederlande) durchgeführt, welches nach den Empfehlungen des Herstellers eingesetzt wird.

Der erfindungsgemäße ArFA-ELISA-Test wurde gemäß Vorschrift C), die in Beispiel 3 beschrieben wurde, eingesetzt, nur daß in dem vorliegenden Beispiel der Assay der Proben in viermaliger Wiederholung durchgeführt wurde. Die mittlere Variation zwischen den Tests betrug bei ein- und derselben Probe weniger als 6%.

Die für jeden Test erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 unten dargestellt. Tabelle 3 95% Spezifität 98,5% Spezifität 99% Spezifität 'AKA' 0,52

(0,45–0,58)
0,45

(0,38–0,51)
0,40

(0,34–0,46)
AhFA-IB 0,59

(0,53–0,65)
0,48

(0,42–0,55)
0,37

(0,31–0,43)
AhFA-ELISA 0,53

(0,46–0,59)
0,38

(0,32–0,44)
0,37

(0,31–0,43)
CCP-ELISA nb 0,58

(0,52–0,65)
0,50

(0,44–0,57)
ArFA-ELISA 0,76

(0,70–0,81)
0,67

(0,60–0,73)
0,65

(0,59–0,71)

Aus dieser Tabelle geht hervor, daß es sich bei dem erfindungsgemäßen Test um den zuverlässigsten Test der für den Nachweis von RP geprüften Tests handelt.

SEQUENZPROTOKOLL


Anspruch[de]
Verfahren zum Nachweisen von für rheumatoide Polyarthritis (RP) spezifischen Autoantikörpern (AFA) in einer biologischen Probe, die diese Autoantikörper (AFA) sowie andere, nicht für die RP spezifische Antikörper enthalten kann, bei dem man folgendermaßen vorgeht:

man verfügt erstens über ein Filaggrin (NCF) oder über ein Filaggrin (NCF)-Derivat oder über ein Filaggrinpeptid (NCFP), wobei dieses Peptid nach Citrullinisierung über einen Epitop des Filaggrins verfügt, sowie zweitens über dieses citrullinisierte Filaggrin (CF) oder ein Derivat dieses citrullinisierten Filaggrins (CF) oder dieses citrullinisierten Peptids (CFP), wobei die Citrullinisierung darin besteht, daß ein oder mehrere Argininrest(e) in Citrullin umgewandelt wurde(n),

man bringt diese biologische Probe erstens mit dem Filaggrin (NCF) oder dem Filaggrin (NCF)-Derivat oder dem Peptid (NCFP) und zweitens dem citrullinisierten Filaggrin (CF) oder dem Derivat des citrullinisierten Filaggrins (CF) oder dem citrullinisierten Peptid (CFP) unter Bedingungen, die sich für die Bildung von Immunkomplexen mit den Autoantikörpern (AFA) eignen, in Kontakt,

man weist die Bildung von Immunkomplexen, die zwischen den Autoantikörpern (AFA) oder anderen Antikörpern, die in der Probe vorliegen, und erstens dem Filaggrin (NCF) oder dem Filaggrin (NCF)-Derivat oder dem Peptid (NCFP) und zweitens dem citrullinisierten Filaggrin (CF) oder dem Derivat dieses citrullinisierten Filaggrins (CF) oder dem citrullinisierten Peptid (CFP) gebildet werden, nach und bestimmt diese quantitativ, wobei die quantitative Bestimmung durch einen Wert XCN bzw. XC ausgedrückt wird,

man subtrahiert den Wert XCN von XC.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Filaggrin aus der Reihe Human-Filaggrin und Ratten-Filaggrin stammt. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Filaggrin um ein rekombinantes Ratten-Filaggrin mit der Sequenz SEQ ID NR: 1 handelt. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid eine Peptidsequenz aus der Reihe SEQ ID NR: 2 bis SEQ ID NR: 6 enthält. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das citrullinisierte Filaggrin (CF) oder das citrullinisierte Peptid (CFP) durch Einwirkung der Peptidylarginindeiminase erhalten wird. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß man über ein Filaggrin (NCF) verfügt und das mindestens 20% der Argininreste des NCF citrullinisiert werden, um zu dem citrullinisierten Filaggrin (CF) zu gelangen. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß mindestes 30%, vorzugsweise mindestens 50%, der Argininreste des NCF citrullinisiert werden. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe aus der Reihe Blut, Plasma und Serum stammt. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die gebildeten Immunkomplexe mit einem Konjugat, das aus einem markierten Antikörper gegen Human-Immunglobuline besteht, unter Bedingungen, die zur Bildung von markierten Immunkomplexen geeignet sind, in Kontakt bringt und man die markierten Immunkomplexe anschließend nachweist und quantitativ bestimmt. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Konjugat um einen mit alkalischer Phosphatase oder mit Peroxidase markierten Antikörper gegen Human-Immunglobulin handelt und daß man anschließend die Bildung von markierten Immunkomplexen kolorimetrisch oder fluorimetrisch nachweist und quantitativ bestimmt, wobei die quantitative Bestimmung durch die Werte XCN und XC für die optische Dichte oder die Fluoreszenz ausgedrückt wird. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß, wenn der Wert XC größer als der Wert XCN ist, für RP spezifische Autoantikörper (AFA) in dieser Probe nachgewiesen und quantitativ bestimmt worden sind.






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