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Dokumentenidentifikation DE60219472T2 03.01.2008
EP-Veröffentlichungsnummer 0001402265
Titel GLUCOSE SCHWELLENWERT BESTIMMUNG IN URIN
Anmelder Nestec Ltd., Vevey, CH;
Hach Co., Loveland, Col., US
Erfinder DOBLER, Lydia J., Oldsmar, FL 34677, US;
EVTODIENKO, Iouri, Elkhart, IN 46514, US;
EVTODIENKO, Vladimir, Toronto, Ontario M2L2G1, CA;
LEWIS, Ronald A., St. Louis, MO 63146, US;
VAN LENTE, Michael A., Elkhart, IN 46514, US
Vertreter Becker, Kurig, Straus, 80336 München
DE-Aktenzeichen 60219472
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 19.02.2002
EP-Aktenzeichen 027044296
WO-Anmeldetag 19.02.2002
PCT-Aktenzeichen PCT/US02/04721
WO-Veröffentlichungsnummer 2002103353
WO-Veröffentlichungsdatum 27.12.2002
EP-Offenlegungsdatum 31.03.2004
EP date of grant 11.04.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 03.01.2008
IPC-Hauptklasse G01N 33/66(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Trockenchemie-Testeinrichtung für eine Glucose-Erfassung in einer flüssigen Probe. Insbesondere, ist die Erfindung auf eine Testeinrichtung für eine Schwellenwert-Erfassung und -Quantifizierung von Glucose in Urin und auf Verfahren zur Herstellung und Verwendung dergleichen gerichtet.

Die Erfassung von Glucosespiegeln ist bei der Behandlung von Diabetes wichtig. Testeinrichtungen zum Testen auf Glucose des Blutes und Urins von menschlichen Diabetikern, umfassen zahlreiche Trockenchemie-Testeinrichtungen, oder Test-Streifen werden in zahlreichen Veröffentlichungen und Patenten beschrieben. Glucosetests stehen seit mehr als drei Jahrzehnten in einem Format von Trocken-Teststreifen zur Verfügung. Analysen von Blut und Urin unter Verwendung von Teststreifen spielen bei der Diagnose und Behandlung von menschlichem Diabetes eine wichtige Rolle.

Die Geschichte von Trockenchemie-Einweg-Testeinrichtungen für eine Glucose-Erfassung ist in der US-P-3,964,871 und der 5,563,042 zusammengefasst. Eine schnelle und einfache Glucosebestimmung in Körperflüssigkeiten unter Verwendung von Trockenchemie-Testeinrichtungen unter Feldbedingungen ist für die frühe Erfassung, Diagnose und Kontrolle von sowohl Diabetes beim Menschen als auch beim Tier bedeutsam. Die Schlüsselerfordernisse für kolorimetrische Tests der Trockenchemie bestehen darin, Glucose in einem weiten Konzentrationsbereich zu erfassen und einfach unterscheidbare Farbunterschiede bei verschieden definierten Glucosespiegeln zu erreichen.

Zur Erfassung mit Teststreifen von relativ geringen Glucosespiegeln wurden mehrere Reagenzien vorgeschlagen. Die US-P-3,886,045 beschreibt einen nicht-toxischen Indikator, der 4-Aminoantipyren und Phenolverbindungen umfasst, die in der Anwesenheit von Glucose gefärbte Quinone bilden können. In US-P-4,427,770 wird eine ähnliche Formulierung unter Verwendung von 4-Aminoantipyren in einem Format mit zwei Kissen beschrieben, um einen weiten Bereich von Glucosespiegeln zu erfassen. Das US-P-5,824,491 berichtet, dass 4-Aminoantipyren eine schrittweise Konzentrations-/Reflexionsantwort von 0–400 mg/dL bei einer linearen Konzentrations-/Reflexionsantwort in dem Glucosebereich von 150–400 mg/dL erzeugt.

Eine sensitive und stabile Glucosetesteinrichtung wurde in dem US-P-5,183,742 beschrieben. Die Testeinrichtung umfasst einen Träger, der auf einer Oberfläche gedruckte oder beschichtete Erfassungsreagenzienregionen aufweist. Mit einem lediglich peroxidativ aktiven Indikator erwies es sich jedoch als schwierig gut unterscheidbare Farbänderungen über einen breiten Bereich von 20–500 mg/dL zu erhalten.

Das US-P-3,964,871 lehrt ein System Glucoseoxidase und Peroxidase zu verwenden, wobei jeweils in einer getrennten Zone eine Vielzahl von Anzeige-Reagenzien angeordnet sind. Bei diesem digitalen Ansatz zeigt die Anzahl von eine Farbänderung zeigenden Zonen, die in einer Probe vorhandenen Glucosekonzentration an.

Es wurden andere Anzeigetypen zur Erfassung und Quantifizierung relativ hoher Glucosespiegel und relativ breiter Bereiche von Glucosespiegeln verwendet. In den US-P4,303,753 und 4,340,669 wird ein Indikator in Kombination mit einem Polymer (Iodid + Poly(-vinylpyrrolidon) für einem breiten Bereich (500–1000 und 1000–10.000 mg/dL) einer Glucose-Erfassung beschrieben. Iodidsalze wurden in Verbindung mit einem blauen Farbstoff verwendet, der bei der Anwesenheit von Peroxid abnimmt. Siehe beispielsweise US-P-3,814,668. Die zwei Komponenten wirken zusammen, um ein Kontinuum von Indikatorfarbstoffen bereitzustellen.

Ein Schwellenwert-Farbkontrollsystem wurde in der US-P-5,036,000 beschrieben. Das System wurde zur Erfassung von NAD(P)H entwickelt. Analyte reagieren, um NAD(P)H zu bilden, das wiederum durch ein Chromogen oxidiert wird. Nicht-chromogene konkurrierende Verbindungen, wie beispielsweise Fe(III)-Verbindungen werden zugegeben, um eine sichtbare beziehungsweise optische Farbänderung zu verhindern, bis eine bestimmte Menge von NAD(P)H überschritten ist. Wird die bestimmte Menge NAD(P)H überschritten, dann wird eine einzelne, einfach zu unterscheidende Farbänderung erzeugt.

Die vorstehend erwähnten Reagenzien und Testeinrichtungen wurden allgemein zum Testen menschlichen Urins entwickelt. An Diabetes leiden jedoch ebenfalls Tiere. Beispielsweise kommt Katzendiabetes ziemlich häufig vor, beeinträchtigt ungefähr 0,2% bis 1% der Katzenpopulation. Bei diesem Leiden müssen die Glucosespiegel im Blut kontrolliert werden. Wie bei Menschen, die an Diabetes leiden, werden hyperglykämische Katzen mit Insulininjektionen behandelt. Während Insulin die Hyperglykämie behandelt, erfordert ein richtig behandelter Diabetes periodisches Überwachen von Glucosespiegeln. Da erhöhte Glucosespiegel im Blut gewöhnlich zu erhöhten Glucosespiegeln im Urin führen, stellt periodisches Überwachen von Glucosespiegeln im Urin ein notwendiges Überprüfen auf eine geeignete Tierbehandlung bereit.

Obwohl, sowohl Patent- als auch Nicht-Patent-Literatur voll mit Referenzen zu Glucose-Testsystemen und Einrichtungen sind, wurden wenige Trockenchemie-Glucosetests spezifisch zum Testen von Körperflüssigkeiten von Tieren entwickelt. EP-0 060 133 beschreibt ein Verfahren und eine Einrichtung zur nicht enzymatischen Glucose-Erfassung in Körperflüssigkeiten von Tieren. In letzter Zeit wurde ein Teststreifen-Produkt (PetstixTM, Bayer Agricultural Division (Etbbicoke, Ontario, Canada)) zum Testen von Tierurin (einschließlich Glucosetest) in den Markt eingeführt. Bei Petstix 7 werden die gleichen Farbblocker wie in N-MultistixTM SG (Bayer Diagnostics Division (Elkart, Indiana) verwendet, der mit US-P-3,814,668 gekennzeichnet ist.

Beim Testen von Tierurin mit Teststreifen treten einige Beschränkungen und spezifische Erfordernisse auf. Beispielsweise gibt es hervorstechende Unterschiede in der Zusammensetzung zwischen Katzenurin und Menschenurin. Ein derartiger Unterschied besteht darin, dass Katzenurin ein signifikant höheres spezifisches Gewicht aufweist als menschlicher Urin. Aufgrund dieses Unterschieds können falsche Messwerte beziehungsweise Auslesungen erhalten werden, falls für den Menschen entwickelte Teststreifen zur Glucose-Erfassung bei Katzen verwendet werden. Eine andere Beschränkung bezieht die Probleme beim Sammeln einer Urinprobe von dem Tier ein. Bei Verwendung mit tierischen Körperflüssigkeiten ist es ebenfalls vorteilhaft, dass eine Testeinrichtung aufgewiesen wird, worin die Ergebnisse nicht von der aufgetragenen Probenmenge und der Einwirkzeit bei Umgebungsbedingungen vor Aktivierung abhängig sind und worin die Ergebnisse für eine längere Zeitdauer nach Aktivierung stabil sind.

Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren, eine Reagenzienzusammensetzung und eine Trockenchemie-Testeinrichtung zur Schwellenwert-Glucose-Erfassung, insbesondere bei Katzen gerichtet. Die Einrichtung besteht in der Form eines mit Substrat imprägnierten Indikators, der vorzugsweise in Stücke geschnitten wird, die dazu geeignet sind auf Katzenstreu verteilt zu werden. Die Indikator/Substrat-Verbindung ist so gewählt, dass nach Benässen durch den Tierurin das Indikatorergebnis für eine ausreichende Zeitdauer unterscheidbar bleibt, so dass es durch den Haustierbesitzer oder Pfleger beobachtet werden kann. Folglich sollte die bevorzugte Indikatorzusammensetzung nicht nur den Umgebungsbedingungen einer Streubox beziehungsweise -kiste und verlängerter Aussetzung beziehungsweise Einwirkung von diesen Bedingungen bis zur Aktivierung durch Tierurin widerstehen können, sondern sollte ebenfalls gute eine Stabilität sogar nach Aktivierung durch Urin aufweisen. Das Indikatorreagenz sollte vorzugsweise, ebenfalls so ausgewählt werden, dass angezeigt werden kann, ob die Reagenzeinrichtung mit dem Tierurin in Kontakt gebracht wurde, ungeachtet ob abnormale Glucosespiegel vorhanden sind.

Die Reagenzzusammensetzung, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, basiert auf einem Standard-Enzym-Glucosesystem, einschließlich Glucoseoxidase und Peroxidase und einer Kombination von peroxidativ aktiven Indikatoren (Chromogenen). Die Kombination von Chromogenen der vorliegenden Erfindung stellt eine gute Farbunterscheidung bereit, die einer Vielzahl von Glucosekonzentrationen im Urin entspricht. Weiterhin basiert die Glucose-Erfassung im Katzenurin vorzugsweise auf einem bewährten Empfindlichkeits-Schwellenwert oder Konzentrationsschwellenwert. Bei Glucosekonzentrationen, die geringer sind als der Schwellenwert, tritt keine unterscheidbare Farbänderung auf der Testeinrichtung auf. Um den erwünschten Empfindlichkeitsschwellenwert zusätzlich zu der Kombination von Chromogenen zu erreichen, umfasst die Reagenzzusammensetzung einen Fänger von Peroxid/oxidierten Chromogenen. Die Reagenzzusammensetzung macht eine Farbänderung nur durch, wenn sie Urin ausgesetzt wird, der eine Glucosekonzentration bei oder über dem Schwellenwert aufweist, und falls derartiges auftritt, dann zeigen einfach sichtbar unterscheidbare Farbänderungen höhere Glucosekonzentrationen an.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Testeinrichtung unter Verwendung eines Cellulosepapiersubstrat hergestellt, das mit einer Lösung der Reagenzzusammensetzung imprägniert wurde. Das Papier wird dann getrocknet und in kleine, jedoch optisch erfassbare Stücke geschnitten, um eine Einrichtung bereitzustellen, die auf Katzenstreu verteilt werden kann. Die nicht-aktivierte Einrichtung bleibt für mehrere Tage, sogar bei hoher Feuchtigkeit glucoseempfindlich. Nach Kontakt mit Katzenurin entwickelt sich eine Farbe beziehungsweise Färbung, die eine Glucosekonzentration anzeigt und für eine ausreichende Zeitdauer fortbesteht, so dass der Pfleger des Haustiers die Farbentwicklung beobachten kann. Eine Farbstabilität wird dadurch erreicht, dass Stabilisatoren und ausgewählte Chromogene in der Reagenzzusammensetzung inkorporiert sind.

Folglich umfasst eine erfindungsgemäße Ausführungsform einer Trockenchemie-Einrichtung zum Erfassen und Quantifizieren von Glucose im Urin ein chromogenes Indikatorgemisch, das Glucoseoxidase, Peroxidase, eine erste chromogene Indikatorreagenzzusammensetzung umfasst, die eine Farbentwicklung durchmachen kann, um die Anwesenheit einer geringeren Konzentration an Glucose anzuzeigen und eine zweite chromogene Indikatorreagenzzusammensetzung, die ein Farbentwicklung durchmachen kann, um die Anwesenheit einer höheren Glucosekonzentration anzuzeigen, wobei der erste chromogene Indikator eine Farbentwicklung des zweiten chromogenen Indikator verhindert, mit der Maßgabe, das eine höhere beziehungsweise größere Glucosekonzentration im Urin vorhanden ist, einen Fänger, der ein Farbentwicklung der ersten Indikatorreagenzzusammensetzung verhindert, mit der Maßgabe, dass eine Schwellenwertkonzentration von Glucose vorhanden ist und eine Matrix, die mit dem chromogenen Indikatorgemisch imprägniert ist.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in einem Verfahren zum Bestimmen einer Glucosekonzentration von Urin in einem Tier, umfassend die Schritte, Auswählen einer Testeinrichtung nach Anspruch 1, Anordnen der Testeinrichtung, um einen zufälligen Kontakt mit dem Tierurin zu erleichtern, Ablesen einer entwickelten Indikatorfarbe nachdem die Einrichtung mit Urin benässt wurde, und Vergleichen der entwickelten Farbe mit einem Standard-Farbschaubild, und Bestimmen der Urin-Glucosekonzentration des Tieres.

Eine andere Ausführungsform dieser Erfindung besteht in einem Test-Kit zum Bestimmen der Glucosekonzentration, die in einer Probe eines Tierurins vorhanden ist, welcher Test-Kit umfasst, die Testeinrichtung nach Anspruch 1, und ein Farbschaubild, das die Urin-Glucosekonzentrationen anzeigt, die einer Vielzahl unterscheidbarer Farben entsprechen.

Zusätzliche Merkmale der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann aus der folgenden ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen offensichtlich werden, die den besten Modus zum Ausführen der Erfindung, wie er gegenwärtig wahrgenommen beziehungsweise erfasst wird, beispielhaft darstellen.

Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren, eine Reagenzzusammensetzung, und eine Trockenchemie-Testeinrichtung zum Erfassen von Glucose gerichtet. Während die Erfindung allgemein zur Glucoseerfassung von Urin geeignet ist, ist sie, insbesondere, zur Urin-Glucoseerfassung bei Katzen geeignet. Vorzugsweise wird die Einrichtung zur Erfassung von Glucosekonzentrationen oberhalb eines spezifischen Schwellenwertespiegels verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Testeinrichtung als Konfettiartiges Material ausgebildet vor, das als Streukistenzusatz verwendet wird. Die Probleme, die mit dem Probensammeln von Katzenurin verbunden sind und das relativ hohe spezifische Gewicht von Katzenurin stellen in Bezug auf ähnliche Teststreifen, die zum Testen menschlichen Diabetes verwendet werden, einzigartige Ausführungserfordernisse an die vorliegende Testeinrichtung dar.

Die Testeinrichtung umfasst eine Indikatorgemisch-Zusammensetzung und eine Trägermatrix für die Indikatorzusammensetzung. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Trägermatrix ein Stück Filterpapier, das mit der Indikatorzusammensetzung imprägniert wurde, worin das Filterpapier eine ausreichende Porosität und Kapillaraffinität aufweist, so dass eine Urinprobe von dem Tier in die Matrix wandern und mit dem Indikator Wechselwirken kann. Die Matrix kann ein gewebtes oder ein nicht-gewebtes Material sein und kann, ist jedoch nicht beschränkt auf cellulose-artige natürliche Fasermaterialien des Typs, die normalerweise verwendet werden, um Filetpapier herzustellen. Alternativ können organische Polymermaterialien verwendet werden. Andere, entweder gewebte oder nicht-gewebte, natürlich vorkommende oder synthetische Fasermatrixmaterialien, können ebenfalls verwendet werden.

Vorzugsweise entwickelt die Reagenzien-Indikator-Zusammensetzung der Testeinrichtung eine Schwellenwert-Farbantwort, wobei eine nicht unterscheidbare Farbänderung erzeugt wird, mit der Maßgabe, dass die Menge an Glucose in der Urinprobe eine bestimmte Konzentration übersteigt. Dadurch kann der Besitzer eines Tiers oder Pfleger die Anwesenheit einer Farbänderung beobachten, die ein mögliches Problem einer Hyperglykämie anzeigt. Lediglich wenn die Schwellenwertkonzentration überstiegen wird, müsste der alarmierte Pfleger die Schwere des hyperglykämischen Zustands weiter untersuchen.

Ebenfalls wird für die Farbdifferenzierung bevorzugt, dass sie ausreichend stark ist, so dass eine verlässliche Farberfassung und Interpretation unmittelbar auf der Katzenstreuoberfläche gemacht werden kann. Weiterhin sollte die Testeinrichtung für mindestens mehrere Tage, sogar bei hoher Feuchtigkeit, nachdem sie auf die Katzenstreuoberfläche aufgebracht wurde, Glucose empfindlich bleiben. Außerdem sollte das Farbsignal der durch Urin aktivierten Einrichtung für mindestens mehrere Stunden nach Einwirken von Katzenurin stabil sein. Andere bevorzugte Merkmale der erfindungsgemäßen Testeinrichtungen umfassen, dass die Farbe des aktivierten Indikatorreagenzes nicht unter den Bedingungen einer normalen Verwendung auf die Katzenstreu auslaugen beziehungsweise ausgewaschen werden sollte, wobei die beobachtete Testfarbe nicht von der Menge des aufgebrachten Urins abhängig sein sollte.

In einer Ausführungsform kann die mit der Indikatorzusammensetzung imprägnierte Matrix in kleine Konfetti-artige Stücke geschnitten werden, um auf Streu gestreut oder darin vermischt werden. Die kleinen Stücke können unterschiedliche geometrische Formen und gewöhnlich 0,01 bis 1,0 Zoll (0,025 bis 2,5 cm) in deren längsten Dimension, noch typischer 0,1 bis 0,5 Zoll (0,25 bis 1,3 cm) in deren längsten Dimension und am typischsten Quadrate oder Diamanten von 0,2 Zoll (0,5 cm) an einer Seite aufweisen. Es sollte jedoch klar sein, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung mit Katzen beschränkt ist, wobei andere Formen und Größen für eine Verwendung durch Menschen oder zur Verwendung durch andere Tiere geeignet sein können. Beispielsweise können viel größere beziehungsweise umfangreichere Test-Blätter beziehungsweise -Folien (1,0 bis 2,0 Zoll (2,5 bis 5,0 cm) in der längsten Dimension) für die Verwendung mit Papier-trainierten (paper-trained) Hunden geeignet sein. Die größeren Blätter können ebenfalls unter Streumaterial in einer Katzenstreukiste oder unter ähnliches Material bei der Verwendung mit anderen Tieren angeordnet werden. Die Testeinrichtung kann versiegelt sein, beispielsweise in einer Folienpackung, um die Haltbarkeit des Produkts zur Distribution, zum Verkauf und zur Verwendung zu verlängern.

Die Reagenzien der vorliegenden Erfindung basieren auf Formulierungen, die Glucoseoxidase, Peroxidase und chromogene Redox-Indikatoren als Schlüssel-Komponenten aufweisen. Glucose wird in einer spezifischen von der Glucoseoxidase katalysierten Reaktion durch atmosphärischen Sauerstoff zu Gluconsäure oxidiert, die als Nebenprodukt Wasserstoffperoxid proportional zu der Glucosemenge bildet:

In verschiedenen Reaktionen, die durch Peroxidase katalysiert werden reagiert Wasserstoffperoxid mit der farblosen Form der Indikator-Reagenz-Zusammensetzung, um Wasser und eine oxidierte, gefärbte Form des Indikators zu erzeugen. Die oxidierte Form des Indikators selbst kann eine gefärbte Entität sein oder reagiert besonders mit einer anderen Verbindung, um ein gefärbtes Produkt bereitzustellen, das irgendeinen Konzentrationsbereich von Glucose in der getesteten Probe anzeigt. In dem Indikatorgemisch der vorliegenden Erfindung werden zwei unterschiedliche Indikatorreagenzien verwendet, eines, um niedrige/mittlere Glucosespiegel (Ind1) über Reaktion 1 und einen anderen, um ein unterschiedlich gefärbtes Signal bei hohen Glucosespiegeln (Ind2) über Reaktion 2 zu erfassen.

In Reaktion 1 wird eine Indikator-Reagenzzusammensetzung (Ind1) verwendet, die eine relativ schnelle Empfindlichkeit beziehungsweise Anfälligkeit gegenüber einer Oxidation durch Peroxidase aufweist. Folglich weist Reaktion 1 verglichen mit Reaktion 2 eine hohe Reaktionsgeschwindigkeit auf. In der Anwesenheit von niedrigen/mittleren Glucosespiegeln, (vorzugsweise 150–300 mg/dL) wird eine Komponente von Ind1 oxidiert, wobei entsprechende Farben (beispielsweise Rose oder Rot, falls Ind1 AAP/HBS ist) entwickelt werden. Die Einrichtung erfasst niedrige/mittlere Glucosespiegel hauptsächlich auf der Basis von Reaktion 1:

Reaktion 1

Geeignete Zusammensetzungen für Ind1 umfassen 4-Aminoantipyren (AAP) oder ein Salz davon, und phenolische Verbindungen, wie beispielsweise 2-Hydroxy-3,5-dichlorbenzensulfonat (HBS), 3-Methylcatechol, 4-Hydroxybenzensulfonsäure und 2,6-Dimethylphenol. Andere phenolische und Anilin-Verbindungen, die eine farbige Verbindung mit AAP bilden können, sind im Stand der Technik bekannt und liegen im Umfang dieser Erfindung. Siehe beispielsweise US-P-3,886,045 und 4,427,770. Andere chromogene aromatische Verbindungen können an die Stelle von AAP werden. Beispielsweise kann 3-Methylbenzothiazolinon-hydrazon-Hydrochlorid (MBTH) verwendet werden. Die Kombination von 1,3-Phenylendiamin und MBTH erzeugt, falls sie mit Wasserstoffperoxid aktiviert wird, eine intensive matt rote Farbe.

In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst Ind2 ein Iodidsalz. Während Kaliumiodid bevorzugt wird, können andere Iodidsalze, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Natriumiodid und Ammoniumiodid verwendet werden. Dass bei Reaktion 2 freigesetzte Iod, bildet, wie im Stand der Technik bekannt, mit Stärke und andere Substanzen einen gefärbten Komplex. Siehe beispielsweise US-P-3,886,045. Substanzen, die mit Iod einen gefärbten Komplex bilden können, umfassen Stärke, Stärkekomponenten wie beispielsweise Amylose oder Amylopektin, Polyethylenglycol, Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol. Man muss jedoch, abhängig von der Verwendung, bei der Wahl einer geeigneten Substanz vorsichtig sein, da andererseits manche geeigneten Substanzen toxisch sein können. Stärke wird bevorzugt, da Stärke relativ kostengünstig, nicht-toxisch ist und eine gute Farbe bereitstellt. Folglich verläuft Reaktion 2 unter Verwendung von Iodid/Stärke wie folgt:

Reaktion 2

In der Abwesenheit irgendeines anderen Indikators erzeugt Iodid/Stärke eine charakteristische blaue Färbung in dem Bereich von 50–300 mg/dL, wobei die blaue Färbung mit steigender Glucosekonzentration zunimmt.

Es wurde beobachtet, dass Reaktion 2 viel langsamer abläuft als Reaktion 1. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die gesamte stöchiometrische Menge von Ind1 in der Reagenzienzusammensetzung gleich zu oder geringfügig größere als ein niedriger/mittlerer Glucosespiegel. In der Anwesenheit von niedrigen/mittleren Glucosespiegeln wird von Ind1 das verfügbare Peroxid schnell verbraucht, wobei Reaktion 2 nicht abläuft. Wird AAP/Phenol verwendet, dann wird bei niedrigeren Konzentrationen lediglich aufgrund von AAP/Phenol eine Farbänderung beobachtet. Eine ähnliche Fängerwirkung wird mit MBTH/1,3-Phenylendiamin gesehen. Bei hohen Glucosespiegeln (vorzugsweise über 300 mg/dL) wird das gesamte Ind1 verbraucht und Ind2 wechselwirkt mit H2O2/Peroxidase. Als ein Ergebnis wird eine für Ind2 (beispielsweise dunkel braunschwarz oder dunkel blau, falls Ind2 als Stärke/Iodid vorliegt) spezifische Färbung entwickelt. Folglich wird Ind2 hauptsächlich verwendet, um hohe Glucosespiegel zu erfassen.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird zusätzlich zu der vorstehend beschriebenen Doppel-Indikatorzusammensetzung ein Fänger verwendet, um einen Schwellenwert-Detektionsspiegel für die Einrichtung bereitzustellen, worin bei Glucosespiegeln unterhalb der Schwellenwertkonzentration keine Farbänderung beobachtet wird. In dieser bevorzugten Ausführungsform wird ein Fänger verwendet, um eine Farbänderung bei sehr geringen Glucosespiegeln, wie in Reaktion 3 gezeigt, zu verhindern:

Reaktion 3

In der Anwesenheit von sehr geringen Glucosespiegeln (vorzugsweise weniger als 50 mg/dL) kann von Ind1 die gefärbte (oxidierte) Form erzeugt werden. Ein Fänger kann jedoch so gewählt werden, dass unter Bedingungen einer geringen Glucosekonzentration der Fänger mit oxidiertem Ind1 reagiert und es zu der farblosen reduzierten Form zurückführt. Folglich erfolgt unter diesen Bedingungen keine Farbentwicklung, wobei lediglich eine Färbung des Hintergrunds gesehen werden kann. Alternativ, kann ein Fänger verwendet werden, der den Ind1-Indikator durch Konkurrenz verdrängt, wodurch Reaktion 1 bei niedrigen Glucosespiegeln daran gehindert wird abzulaufen. In beiden Fällen entspricht die bestimmte Menge des Fängers in der Formulierung einem sehr niedrigen Glucosespiegel. In der Anwesenheit von Glucosespiegeln, die größer sind als die Kapazität des Fängers (vorzugsweise 50 mg/dL oder mehr) übersteigt die Konzentration des oxidierten Ind1 die Konzentration des Fängers, Ind1 verbleibt in dessen oxidierten Form und Glucose wird erfasst. Abhängig von der Anwendung umfassen geeignete Fänger Zinnchlorid, Thiosulfate und Mercaptane. Einen bevorzugten Fänger stellt Cystein dar, da es nicht toxisch ist.

Urin von diabetischen Katzen, die eine Insulintherapie durchmachen beziehungsweise erdulden, sollte etwas restliche Uringlucose aufweisen. Folglich wird bevorzugt, dass die Testeinrichtung einen Spiegel von 50 mg/dL anzeigt, um eine Überdosis zu erfassen oder zu verhindern. Dieser Schwellenwertspiegel kann für verschiedene Anwendungen beim Tier oder Menschen variiert werden.

Die vorstehend beschriebene Kombination von Indikatoren und Fängern stellt eine Schwellenwert-Glucoseerfassung bereit, als auch verschiedene Indikatorfarben bei dem Konzentrationsbereich von niedrig-hoher Uringlucose, der bei Katzen mit Diabetes verbunden ist. Es sollte erwähnt werden, dass die Schwellenwert-Farbänderung für individuelle Anwendungen, wie benötigt, insbesondere in dem 50–1000 mg/dL Glucosebereich, verschoben werden kann. Geeignete Mengen von Ind1 und Fänger können so gewählt werden, dass eine Schwellenwertfarbe und eine Ind1/Ind2-Farbänderung bei wünschenswerten Glucosespiegeln erzeugt werden.

Vorzugsweise weist die Testeinrichtung eine gute Stabilität auf und kann Umgebungsbedingungen einer Streukiste und einer verlängerten Einwirkung dieser Bedingungen bis zu dessen Aktivierung durch Benetzen mit Tierurin widerstehen. Ebenfalls wird bevorzugt, dass die so erhaltene auf Aktivierung durch den Tierurin erzeugte Färbung für eine signifikante Zeitdauer unverändert erhalten bleibt. Diesbezüglich spielt der in der Reagenzienformulierung umfasste Fänger (beispielsweise Cystein) eine Doppelrolle. Der Fänger fördert nicht nur die Farbunterscheidung zwischen sehr geringen und geringen Glucosespiegeln, sondern stellt ebenfalls eine antioxidante Funktion bereit, um die Indikatoren vor spontaner Oxidation während der Reagenzienherstellung, Lagerung und Anwendung zu schützen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Reagenzienzusammensetzung so formuliert, dass sie ein Polysaccharid, wie beispielsweise Dextran, DEAE-Dextran oder Alginat beinhaltet, um die Enzymstabilität zu verbessern und eine geeignete Testleistung der Testeinrichtung während einer verlängerten Einwirkung gegenüber Umgebungsbedingungen auf Katzenspreu aufrechtzuerhalten. Weiterhin kann ein Film-Bildendes Polymer, wie beispielsweise Poly(-vinylalkohol) in der Reagenzienzusammensetzung verwendet werden, um den Indikator am Auslaugen beziehungsweise Auswaschen aus dem Reagenz zu hindern, wenn es mit Katzenurin aktiviert wird.

Die folgenden Beispiele werden dargelegt, um die Prinzipien und Praktiken der vorliegenden Erfindung einem Fachmann zu erläutern. Sie sind nicht vorgesehen die Erfindung zu beschränken, sondern sie lediglich zu erläutern.

Beispiel 1

Tabelle 1: Reagenz-Formulierung Nr. 1 Subgemisch 1 für erstes Eintauchen/Beschichtung Komponenten Menge, g/L destilliertes Wasser Stärke 6,0
Subgemisch 2 für zweites Eintauchen/Beschichtung Komponenten Menge, g/L destilliertes Wasser Glucoseoxidase 43 ku/L Peroxidase 36 ku/L Kaliumiodid 10,2 4-Aminoantipyren 1,86 2-Hydroxy-3,5-dichlorbenzensulfanat Na-Salz 0,8 Tartrazin (saures Gelb) 0,05 L-Cystein 0,2 Zitronensäure 2,3 Zitrat, Na-Salz 11,2 Poly(-vinylalkohol) 20,0 Dextran 10,0

Cellulosepapier wurde mit Subgemisch 1 imprägniert und getrocknet. Das so erhaltene Papier wurde mit Subgemisch 2 imprägniert und erneut getrocknet. Das mit dem vollständigen Satz der Komponenten imprägnierte Testpapier wurde in kleine Konfetti-artige Stücke geschnitten, um schließlich eine Testeinrichtung zu erhalten.

Die Testeinrichtungsstücke wurden auf der Oberfläche von Katzenstreu verteilt und Proben von 60 Mikrolitern Katzenurin mit unterschiedlichen Glucosekonzentrationen wurden auf die Stücke aufgebracht. Die Farbentwicklung wurde optisch analysiert und instrumentell durch Reflexionsspektralphotometrie. Tabelle 2. Optische und instrumentelle Farbbewertungen Glucosespiegel mg/dL Teststück Farben Farbunterschied gegenüber nicht-aktiviertem Teststück Nicht-aktiviert (nicht durch Katzenurin benetzt) Gelb ---- Aktiviert durch 50 mg/dL oder weniger Hell Braun 9,37 (50 mg/dL) 150 Rose 19,78 300 Rot 42,13 600 Dunkel Braunschwarz 56,30

Urin mit einem spezifischen Gewicht von 1,030 wurde verwendet und eine Stunde nach Aktivierung beobachtet. Die Farbunterschiede werden in CIELAB-Einheiten angegeben und basieren auf einer Reflexionserfassung des Instruments. Die Farbunterschied-Einheiten stellen die relative Unterscheidung durch einen normalen Betrachter der Farbe bei der angezeigten Konzentration verglichen zu der gelben (nicht aktivierten) Farbe dar.

Beispiel 2

Tabelle 3. Reagenz-Formulierung Nr. 2 Komponenten Menge, g/L oder Aktivierungseinheiten Glucoseoxidase 104,3 Kiloeinheiten Peroxidase 56,9 Kiloeinheiten Kaliumiodid 9,92 Stärke 6,40 4-Aminoantipyren 2,42 3-Methylcatechol 1,48 L-Cystein 1,7 Zitronensäure 38,4 Imidazol 1,0 Alginsäure 5,0 Triton X-100 2,5

Filterpapier wurde in diese Lösung eingetaucht und getrocknet. Das Papier wurde anschließend in Stücke geschnitten. Für die Reagenz-Formulierung Nr. 2 war das Farbschaubild wie folgt: Glucosekonzentration (mg/dL) Teststück-Farbe 50 Helles Gelb 150 Sehr helles Oliv 300 Braunoliv 600 Braun

Die so erhaltene Testeinrichtung wurde mit Katzenurin getestet, der Glucosekonzentrationsspiegel von 50, 150, 300 und 600 mg/dL beinhaltete. Vor dem Aufbringen auf die Testeinrichtung wurde das spezifische Gewicht von jeder der Katzenurinproben mit Wasser eine von beiden 1,020 und 1,050 eingestellt. Bei dem niedrigeren spezifischen Gewicht der Urinproben entwickelten sich die Farben innerhalb von einigen Minuten, wobei die Farbe dem Glucosespiegel in der Probe entspricht. Die Geschwindigkeit der Farbentwicklung bei dem höheren spezifischen Gewicht der Urinproben war langsamer als die der Proben mit dem geringeren spezifischen Gewicht. Nach zehn Minuten jedoch schienen die Farben der Reihe mit höherem spezifischen Gewicht ähnlich der Reihe mit geringerem spezifischen Gewicht zu sein. Folglich war die Geschwindigkeit der Farbentwicklung bei höherem spezifischem Gewicht verlangsamt, wobei jedoch die erhaltene Färbung ausreichend unterschiedlich war, um die unterschiedlichen Glucosespiegel zu identifizieren.

Beispiel 3 Stabilität des Reagenzes nach Aktivierung durch Katzenurin:

Unter Verwendung der Reagenz-Formulierung Nr. 1 gemäß Beispiel 1, wurden Testmesswerte zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Aktivierung mit dem Katzenurin (spezifisches Gewicht 1,030) ausgeführt. Die erhaltene Färbung wurde optisch ausgelesen und die Glucosekonzentration durch Farbvergleich mit einem bestimmten Farbschaubild bestimmt. Wie in Tabelle 4 gezeigt, sind die Testmesswerte über mindestens 8 Stunden nach Aktivierung mit Katzenurin stabil. Tabelle 4 Stunden nach Reagenz-Aktivierung mit Katzenurin Aktueller Glucose-Urinspiegel, mg/dL 0 150 300 600 Erfasster Glucose-Urinspiegel, mg/dL 1 0 155 320 600 4 0 157 310 600 8 0 150 310 600

Wirkung des Spezifischen Gewichts des Katzenurins

Unter Verwendung der Reagenz-Formulierung Nr.1 gemäß Beispiel 1 wurden Testmesswerte vier Stunden nach Aktivierung mit Katzenurin mit unterschiedlichen spezifischen Gewichten ausgeführt. Die erhaltene Färbung wurde optisch ausgelesen und die Glucosemenge wurde durch Farbvergleich mit einem bestimmten Farbschaubild ausgewertet. Tabelle 5 Spezifisches Gewicht Aktueller Glucose-Urinspiegel, mg/dL 150 300 600 Erfasster Glucose-Urinspiegel, mg/dL 1,020 160 310 600 1,040 135 290 585 1,050 127 275 555

Wirkung der aufgebrachten Urinquantität:

Unter Verwendung der Reagenz-Formulierung Nr. 1 gemäß Beispiel 1 wurden Testmesswerte eine Stunde nach Aktivierung mit unterschiedlichen Mengen von Katzenurin (spezifisches Gewicht von 1,030) ausgeführt. Die erhaltene Färbung wurde optisch ausgelesen und die Glucosekonzentration wurde durch Farbvergleich mit einem bestimmten Farbschaubild bestimmt. Wie in Tabelle 6 gezeigt, beeinflusst die in dem Bereich von 60–150 Mikrolitern aufgebrachte Menge von Urin die Testmesswerte nicht signifikant. Ebenfalls ist anzumerken, dass größere Volumen von Urin scheinbar kein signifikantes Auslaugen von Indikatoren aus dem Teststück bewirken. Tabelle 6 Mikroliter aufgebracht auf das Teststück von 1 cm2 Aktueller Glucose-Urinspiegel, mg/dL 150 300 600 Erfasste Glucose-Urinspiegel, mg/dL 30 112 250 525 60 150 300 600 90 150 300 600 120 150 320 600 150 150 320 600


Anspruch[de]
Trockenchemie-Einrichtung zur Glucose-Erfassung und -Quantifizierung im Urin, welches ein chromogenes Indikator-Gemisch umfasst, enthaltend,

Glucoseoxidase,

Peroxidase,

einen ersten Indikator, der Farbentwicklung zeigen kann, um die Anwesenheit einer niedrigen bis mittleren Konzentration an Glucose anzuzeigen,

einen zweiten Indikator, der Farbentwicklung zeigen kann, um die Anwesenheit einer grösseren Konzentration an Glucose anzuzeigen, wobei der erste Indikator die Farbentwicklung des zweiten Indikators verhindert, mit der Maßgabe, dass eine größere Konzentration an Glucose im Urin vorhanden ist,

einen nicht-chromogenen Fänger, der die Farbentwicklung des ersten Indikators stört, wenn der Glucosespiegel unter einer Schwellenwert-Konzentration von Glucose liegt, und

einen Träger, der mit dem chromogenen Indikator-Gemisch imprägniert ist.
Einrichtung nach Anspruch 1, worin der nicht-chromogene Fänger Cystein umfaßt. Einrichtung nach Anspruch 1, worin der nicht chromogene Fänger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Thiosulfaten und Mercaptanen. Einrichtung nach Anspruch 1, worin die Grenzwert-Glucose-Konzentration etwa 50 mg/dl beträgt. Einrichtung nach Anspruch 4, worin die niedrige bis mittlere Konzentration an Glucose im Bereich von 150–300 mg/dl liegt. Einrichtung nach Anspruch 5, worin die höhere Konzentration an Glucose 300 mg/dl beträgt und der zweite Indikator eine Farbentwicklung durchlaufen kann, um Glucose-Konzentrationen im Bereich von 300–600 mg/dl anzuzeigen. Einrichtung nach Anspruch 1, worin der erste Indikator 4-Aminoantipyren und eine Phenolverbindung umfaßt. Einrichtung nach Anspruch 7, worin die Phenolverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2-Hydroxy-3,5-dichlorbenzolsulfonat, 3-Methlycatechol, 4-Hydroxybenzolsulfonsäure und 2,6-Dimethylphenol. Einrichtung nach Anspruch 1, worin der zweite Indikator ein Iodidsalz umfaßt. Einrichtung nach Anspruch 9, worin das Iodidsalz Kaliumiodid ist und der zweite Indikator weiter Stärke umfaßt. Einrichtung nach Anspruch 1, worin das chromogene Indikator-Gemisch weiter einen Stabilisator umfaßt, der einen Verlust der Fähigkeit zur Farbentwicklung für mindestens 24 Stunden bei hoher Feuchtigkeit verhindert. Einrichtung nach Anspruch 11, worin der Stabilisator ein Polysaccharid ist. Einrichtung nach Anspruch 1, worin die Farbentwicklung für mindestens acht Stunden nach Aktivierung stabil bleibt. Einrichtung nach Anspruch 1, worin die Matrix ein Cellulosepapier ist. Einrichtung nach Anspruch 14, worin das Cellulosepapier in kleine Konfetti-artige Stücke ausgebildet ist. Einrichtung nach Anspruch 1, worin das chromogene Indikator-Gemisch weiter Polyvinylalkohol und Dextran umfaßt, und worin eine aus der Farbentwicklung erhaltene Farbe unabhängig ist von dem spezifischen Gewicht des Urins. Einrichtung nach Anspruch 1, worin der erste Indikator eine chromogene Indikatorreagens-Kombination ist, wobei der zweite Indikator eine chromogene Indikatorreagens-Kombination ist und wobei der Träger eine Matrix ist. Einrichtung nach Anspruch 17, worin die Matrix 15 in Konfetti-artige Stücke gebildet ist, welche zur Anwendung in einer Einstreu-Kiste geeignet sind. Verfahren zur Bestimmung der Glucose-Konzentration im Urin eines Tiers, welches die Schritte umfaßt,

Wählen einer Test-Einrichtung, welche eine Matrix umfaßt, die mit einem chromogenen Indikator-Gemisch imprägniert ist, welches Glucoseoxidase, Peroxidase, eine erste chromogene Indikator-Reagens-Kombination, die Farbentwicklung zeigen kann, um die Anwesenheit einer geringeren Konzentration an Glucose anzuzeigen, eine zweite Indikator-Reagens-Kombination, die Farbentwicklung zeigen kann, um die Anwesenheit einer grösseren Konzentration an Glucose anzuzeigen, wobei die erste chromogene Indikator-Reagens-Kombination die Farbentwicklung des zweiten Indikators verhindert, mit der Maßgabe, dass eine größere Konzentration an Glucose vorhanden ist, und einen Fänger, der die Farbentwicklung der ersten Indikator-Reagens-Kombination verhindert, mit der Maßgabe, dass eine Schwellenwert-Konzentration an Glucose vorhanden ist,

Anordnen der Test-Einrichtung, um einen zufälligen Kontakt mit dem Tierurin zu fördern,

Ablesen einer entwickelten Indikatorfarbe nach Benetzung der Einrichtung mit Urin, und

Vergleichen der entwickelten Farbe mit einem Standard-Farbschaubild, und Bestimmen der Urin-Glucose-Konzentration des Tiers.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Tier eine Katze ist, wobei die Test-Einrichtung in Konfetti-artigen Stücken bereitgestellt wird, und wobei der Anordnungsschritt umfaßt, Verteilen der Konfetti-artigen Stücke auf der Oberfläche des Katzenstreus. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Test-Einrichtung vor Aktivierung für mehrere Stunden auf dem Katzenstreu verbleibt. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Vergleich-Schritt mehrere Tage nach Aktivierung erfolgt. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Test-Einrichtung in einer großen Lage bereitgestellt wird und der Anordnungs-Schritt umfaßt, Anordnen der Lage auf dem Boden. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Test-Einrichtung in einer großen Lage bereit gestellt wird und der Anordnungsschritt umfaßt, Anordnen der Lage unter dem Eintreu-Material. Reagens-Zusammensetzung zur Verwendung bei der Erfassung und Quantifizierung von Glucose im Urin, umfassend:

Glucoseoxidase,

Peroxidase,

eine erste chromogene Indikator-Reagens-Kombination, die Farbentwicklung zeigen kann, um die Anwesenheit einer geringeren Konzentration an Glucose anzuzeigen,

eine zweite chromogene Indikator-Reagens-Kombination, die Farbentwicklung zeigen kann, um die Anwesenheit einer grösseren Konzentration an Glucose anzuzeigen, wobei der erste chromogene Indikator die Farbentwicklung des zweiten chromogenen Indikators verhindert, mit der Maßgabe, dass eine größere Konzentration an Glucose vorhanden ist,

einen Fänger, der die Farbentwicklung des ersten Indikator-Reagens-Kombination stört, mit der Maßgabe, dass eine Schwellenwert-Konzentration von Glucose liegt.
Test-Kit zur Bestimmung der Konzentration an Glucose, die in einer Probe eines Tierurins vorhanden ist, umfassend,

ein Substrat, das mit einem chromogenen Indikator-Gemisch imprägniert ist, umfassend,

Glucoseoxidase,

Peroxidase,

einen ersten Indikator, der Farbentwicklung zeigen kann, um die Anwesenheit einer geringeren Konzentration an Glucose anzuzeigen,

einen zweiten Indikator, der Farbentwicklung zeigen kann, um die Anwesenheit einer grösseren Konzentration an Glucose anzuzeigen, wobei der erste Indikator die Farbentwicklung des zweiten Indikators verhindert, mit der Maßgabe, dass eine größere Konzentration an Glucose in der Urin-Probe vorhanden ist,

einen Fänger, der die Farbentwicklung des ersten Indikators verhindert, mit der Maßgabe, dass in der Urin-Probe eine größere Konzentration an Glucose vorhanden ist, und

ein Farbschaubild, das Urin-Glucose-Konzentrationen entsprechend der mehreren unterscheidbaren Farben anzeigt.
Test-Kit nach Anspruch 26, worin das Farb-Schaubild Farben liefert, entsprechend Urin-Glucose-Konzentrationen von 0, 50, 150, 300 und 600 mg/dl. Test-Kit nach Anspruch 27, worin das Substrat in Konfetti-artige Stücke geformt ist. Test-Kit nach Anspruch 26, worin das Substrat in einer versiegelten Folienpackung bereitgestellt wird.






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