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Dokumentenidentifikation DE60219517T2 03.01.2008
EP-Veröffentlichungsnummer 0001454177
Titel MEHRFACHSUBSTRAT-BIOCHIP-EINHEIT
Anmelder Autogenomics, Inc., Carlsbad, Calif., US
Erfinder Mahant, Vijay, Murrieta, CA 92562, US;
Kureshy, Fareed, Del Mar, CA 92014, US;
Singh, Shailendra, Saron, MA 02067, US
Vertreter Mitscherlich & Partner, Patent- und Rechtsanwälte, 80331 München
DE-Aktenzeichen 60219517
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 24.01.2002
EP-Aktenzeichen 027174077
WO-Anmeldetag 24.01.2002
PCT-Aktenzeichen PCT/US02/03917
WO-Veröffentlichungsnummer 2003050591
WO-Veröffentlichungsdatum 19.06.2003
EP-Offenlegungsdatum 08.09.2004
EP date of grant 11.04.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 03.01.2008
IPC-Hauptklasse G02B 26/08(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12Q 1/68(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12M 1/36(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   B01L 3/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   G01N 33/543(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Diese Anmeldung ist eine "Continuation-in-part" der anhängigen U.S.-Patentanmeldung Nr. 09/735.402, eingereicht am 12. Dezember 2000, und beansprucht die Priorität der PCT-Anmeldung mit dem Titel "Improved Biochip", eingereicht am 11. Dezember 2001 (die Erfinder sind Vijay K. Mahant und Fareed Kureshy), die hierin durch Bezugnahme umfasst ist.

Gebiet der Erfindung

Das Gebiet der Erfindung sind analytische Vorrichtungen und Verfahren.

Hintergrund der Erfindung

Die Genomik- und Proteomikforschung haben eine enorme Zahl an Nukleotid- und Peptidsequenzen für die Analyse verfügbar gemacht. Infolgedessen hat das Proben-Screening mit hohem Durchsatz nach dem Vorhandensein und/oder der Menge einer enormen Zahl an bekannten Genen oder Polypeptiden in den letzten Jahren beachtliches Interesse erlangt. Es gibt verschiedene nach dem Stand der Technik bekannte Vorrichtungen und Verfahren und viele dieser Vorrichtungen und Verfahren sind auf das Screening von Mehrfachnukleinsäuresequenzen ausgelegt.

Zum Beispiel beschreiben Johann und andere in dem U.S.-Patent Nr. 6.277.628 in einem relativ einfachen Ansatz ein Testsystem, in dem mehrere Trägerstrukturen in einer Kapillare eingeschlossen sind und worin wenigstens einige der Trägerstrukturen (zum Beispiel Glasperlen) kovalent mit einer biomolekularen Sonde beschichtet werden. Das System von Johann verkleinert das Verhältnis von Probenvolumen zur Prüfoberfläche vorteilhaft, wodurch mögliche Verzögerungen auf Grund von kinetischen Effekten verringert werden. Es treten jedoch verschiedene Probleme bei der Verwendung solcher Systeme auf. Unter anderen Nachteilen ist die optische Detektion (zum Beispiel Fluoreszenz) eines Signals von einer hybridisierten Probe wenigstens in gewissem Maße durch unabsichtliche Lichtabsorption (zum Beispiel Erregung und Emission) durch die Kapillare beeinträchtigt. Ferner mindern intrinsische optische Effekte (zum Beispiel Autofluoreszenz) der Kapillare die Empfindlichkeit der Analyse oder des Verfahrens wahrscheinlich weiter. Weiterhin ist die unbeabsichtigte Fokussierung/Diffusion von einfallendem und/oder emittiertem Licht auf Grund der starken Krümmung der Kapillare unvermeidlich. Außerdem ist der Aufbau von Johanns Testsystem relativ mühsam und zeitaufwändig.

In einem anderen Beispiel wird die Hybridisierung von Zielmolekülen von einer Probe auf eine immobilisierte Fängersonde durch elektrophoretische Unterstützung unter Verwendung einer Mikrochipvorrichtung, wie in den U.S.-Patenten Nr. 5.632.957, 5.605.662 und 5.849.486 beschrieben, beschleunigt. Die Verwendung solcher Mikrochipvorrichtungen steigert nicht nur die Geschwindigkeit der molekularen Assoziierung zwischen einem Zielmolekül und einer Fängersonde, sondern ermöglicht ebenfalls die Adressierbarkeit jedes „Pixels" des Testarrays. Ferner kann die Stringenz elektronisch auf eine relativ einfache Weise in einem zur elektrophoretisch unterstützten Hybridisierung umgekehrten Prozess reguliert werden. Die Probendichte solcher Vorrichtungen ist jedoch in vielen kommerziell verfügbaren Systemen üblicherweise auf ungefähr 100 Pixel pro Vorrichtung begrenzt. Außerdem erfordert die elektrophoretisch unterstützte Hybridisierung die Verwendung komplexer und relativ teurer Chips und die Beladung/Hybridisierung und Detektion werden üblich unter Verwendung separater Instrumente ausgeführt, wodurch die Anschaffungs-, Betriebs- und Wartungskosten weiter steigen.

In einem weiteren Beispiel werden Testarrays unter Verwendung eines photolithographischen Verfahrens hergestellt, was eine relativ hohe Dichte der Fängerproben ermöglicht (zum Beispiel größer als 10000 Proben pro Array). Systeme für solche Arrays hoher Dichte sind zum Beispiel in den U.S.-Patenten Nr. 5.599.695, 5.843.655 und 5.631.734 beschrieben. Während Arrays mit hoher Dichte besonders nützlich für die Sequenzierung oder die komplexe Genanalyse sind, gibt es zahlreiche Nachteile. Zum Beispiel ist die kundenspezifische Synthese solcher Arrays hoher Dichte voraussichtlich für jedermann bis auf wenige Einzelpersonen und/oder Organisationen unfinanzierbar. Ferner weisen Arrays hoher Dichte in der routinemäßigen klinischen Diagnostik häufig eingeschränkte Anwendungen auf. Außerdem sind auf Grund der bei der Erstellung solcher Arrays eingesetzten besonderen Chemie Nichtnukleinsäuresonden (zum Beispiel Rezeptoren, Antikörper und andere Polypeptide) schwer, wenn überhaupt, zu realisieren.

Obwohl somit zahlreiche Multisubstrat-Arrays nach dem Stand der Technik bekannt sind, weisen alle oder beinahe alle einen oder mehrere Nachteile auf (zum Beispiel hohe Kosten, schwierig anzupassen, spezialisierte Chemie usw.). Folglich besteht noch ein Bedarf, verbesserte Multisubstrat-Array-Vorrichtungen und -Verfahren bereitzustellen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf eine analytische Vorrichtung, die ein Gehäuse mit einem Hohlraum beinhaltet, worin ein Multisubstrat-Chip wenigstens teilweise in dem Hohlraum angeordnet ist und worin der Multisubstrat-Chip Referenzmarker und mehrere Substrate an vorgegebenen Positionen aufweist, wobei wenigstens eines der mehreren Substrate mit einem Träger über einen in einer Matrix angeordneten Crosslinker verbunden ist. Besonders bevorzugte Vorrichtungen beinhalten ein Gehäuse, das derart ausgelegt ist, dass der Referenzmarker und die Substrate durch entsprechende Lichtquellen unter verschiedenen Winkeln beleuchtet werden.

In einem Gesichtspunkt des erfinderischen Gegenstands beinhalten die Hohlräume ferner einen Anschluss zur Flüssigkeitshandhabung, wobei der Hohlraum vorzugsweise ein Volumen zwischen 0,01 ml und 1 ml aufweist. Noch weiter bevorzugte Vorrichtungen beinhalten eine Überlaufkammer, die ferner einen Überlaufanschluss zur Flüssigkeitshandhabung beinhalten kann, wobei sich der Hohlraum in Fluid leitender Verbindung mit der Überlaufkammer befindet, wenn der Hohlraum eine Flüssigkeit mit einem Volumen enthält, das größer als ein vorgegebenes Volumen des Hohlraums ist.

In einem anderen Gesichtspunkt des erfinderischen Gegenstands können die Vorrichtungen einen zweiten wenigstens teilweise in dem Hohlraum angeordneten Multisubstrat-Chip oder einen zweiten Hohlraum und einen zweiten Multisubstrat-Chip, der wenigstens teilweise in dem Hohlraum angeordnet ist, umfassen.

In alternativen Gesichtspunkten des erfinderischen Gegenstands wird der Hohlraum durch das Gehäuse und ein Grundelement gebildet, worin der Multisubstrat-Chip mit dem Grundelement (das vorzugsweise ausgelegt ist, thermische Energie und/oder Ultraschallenergie auf den Multisubstrat-Chip und/oder ein Fluid zu übertragen) verbunden ist. In weiteren Gesichtspunkten haben ein oder mehrere Substrate Kontakt mit einem Probenfluid, einem Reagensfluid, einem Waschfluid und/oder einem Detektionsfluid, wenn sich der Multisubstrat-Chip in einer im Wesentlichen horizontalen Position befindet, es ist ferner bevorzugt, dass ebenfalls das Binden eines Analyts an ein Substrat detektiert wird, während sich der Multisubstrat-Chip in einer im Wesentlichen horizontalen Position befindet.

In noch weiteren Gesichtspunkten beinhalten der Multisubstrat-Chip und/oder das Gehäuse einen Referenzmarker, der automatisch lesbar ist, und die Matrizen beinhalten ferner wenigstens ein Zusatzmittel, das aus der Gruppe bestehend aus einem Puffer, einem Befeuchtungsmittel, einem Licht abweisenden Mittel und einem oberflächenaktiven Mittel ausgewählt wird. Geeignete Matrizen können eine einzelne Schicht beinhalten oder die Matrix kann aus wenigstens zwei chemisch unterschiedlichen Schichten gebildet sein. Mehrere der analytischen Vorrichtungen können in einem Magazin untergebracht sein, vorzugsweise derart, dass sich das Grundelement der ersten Vorrichtung über dem Gehäuse der zweiten Vorrichtung befindet.

Verschiedene Ziele, Merkmale, Gesichtspunkte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung zusammen mit den angefügten Zeichnungen ersichtlicher werden.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

1A ist eine Perspektivansicht einer beispielhaften Multisubstrat-Testvorrichtung.

1B ist eine schematische senkrechte Schnittansicht eines Teils der Multisubstrat-Testvorrichtung aus 1A.

2A ist eine schematische Draufsicht einer alternativen Multisubstrat-Testvorrichtung.

2B ist eine schematische Draufsicht einer anderen alternativen Multisubstrat-Testvorrichtung.

3 ist eine schematische Seitenansicht eines Magazins, das mehrere Multisubstrat-Testvorrichtungen beinhaltet.

Ausführliche Beschreibung

Die Erfinder haben herausgefunden, dass eine Multisubstrat-Testvorrichtung auf eine konzeptionell einfache und kostengünstige Weise hergestellt werden kann. Außerdem erlauben insbesondere die betrachteten Multisubstrat-Testvorrichtungen eine einfache Anpassung des Arrays, schnelle Auslesezeiten, erheblich verringerte Fotobleichung der Fluorophore und die Substrate sind nicht auf eine bestimmte Gruppe oder Klasse von Biomolekülen beschränkt.

Der hierin verwendete Begriff „Multisubstrat" bezieht sich auf mehrere chemisch und/oder physikalisch verschiedene Moleküle, wobei die Zahl solcher Moleküle allgemein zwischen zwei und mehreren zehntausend Molekülen beträgt, üblicher zwischen hundert und mehreren tausend und am üblichsten zwischen einhundert und eintausend. Die betrachteten Substrate beinhalten biologische (d.h. natürlich vorkommende) und nichtbiologische (d.h. synthetische) Moleküle, wobei insbesondere die betrachteten biologischen Moleküle Nukleinsäuren (zum Beispiel DNA, mRNA, hnRNA, snRNA usw.), Polypeptide (zum Beispiel Enzyme, Rezeptoren, Antikörper, Cytokine, Strukturproteine usw.), Lipide (Membranlipide, Botenlipide, lipoproteingebundene Lipide usw.), Kohlenhydrate (zum Beispiel Glycocalyx-Kohlenhydrate, Glycogen usw.) und alle Kombinationen und/oder Fragmente davon beinhalten.

Die hierin verwendeten Begriffe „erster Winkel" und „zweiter Winkel" beziehen sich auf einen Winkel, der zwischen der Oberfläche (der Matrix) des Multisubstrat-Chips und dem einfallenden Licht gebildet wird, wobei der einfallende Lichtstrahl entweder fokussiert oder ein Laserstrahl ist. Wo das einfallende Licht diffus oder gebeugt ist, wird der Winkel zwischen einer geraden Linie zwischen der Oberfläche (der Matrix) des Multisubstrat-Chips und dem Teil der Licht emittierenden Vorrichtung, der der Oberfläche (der Matrix) des Multisubstrat-Chips am nächsten ist, gebildet, worin die Licht emittierende Vorrichtung eine Glühlampe, eine Licht emittierende Diode, ein Lichtbogen oder eine elektrolumineszierende Quelle ist.

Beispiele für nichtbiologische Moleküle beinhalten synthetische Nukleinsäuren, die ferner modifizierte Nukleoside oder Nukleotide beinhalten können (zum Beispiel DNA, mRNA, hnRNA, snRNA usw.), natürliche und synthetische Polypeptide, die ferner modifizierte Aminosäuren beinhalten können (zum Beispiel Enzyme, Rezeptoren, Antikörper, Cytokine, Strukturproteine usw.), synthetische Lipide (Membranlipide, Botenlipide, lipoproteingebundene Lipide usw.), synthetische Kohlenhydrate (zum Beispiel Glycocalyx-Kohlenhydrate, Glycogen usw.) und alle Kombinationen und/oder Fragmente davon.

Der hierin verwendete Begriff „Chip" bezieht sich auf einen Träger, der mehrere Substrate in vorgegebenen Positionen aufweist, worin wenigstens eines der Substrate mit dem Träger über einen Crosslinker verbunden ist, der in einer Matrix angeordnet ist. Insbesondere sind die betrachteten Multisubstrat-Chips in der allgemeineigenen und anhängigen U.S.-Patentanmeldung Nr. 09/735.402, eingereicht am 12. Dezember 2000, und der PCT-Prioritätsanmeldung mit dem Titel „Verbesserter Biochip", eingereicht am 11. Dezember 2001 (die Erfinder sind Vijay K. Mahant und Fareed Kureshy), beschrieben, die hierin durch Verweis aufgenommen sind.

Der ferner hierin verwendete Begriff „vorgegebene Position" eines Substrats bezieht sich auf eine bestimmte Position des Substrats auf dem Chip, die durch wenigstens zwei Koordinaten relativ zu einem Referenzpunkt auf dem Chip adressierbar ist und schließt insbesondere eine im Wesentlichen vollständige Beschichtung des Chips mit dem Substrat aus. Daher beinhalten bevorzugte, mehrere vorgegebene Positionen ein Array mit mehreren Substratzeilen, die mehrere Spalten bilden (zum Beispiel weist jedes Substrat eine x-Koordinate und eine y-Koordinate auf, wobei x und y größer als 1 sind).

Eine beispielhafte Multisubstrat-Testvorrichtung 100 ist in 1A veranschaulicht. Die Testvorrichtung 100 weist ein Gehäuse 110 auf, in dem ein Hohlraum 120 gebildet ist. Der Hohlraum 120 weist üblicherweise ein Volumen zwischen ungefähr 0,01 ml und 10 ml auf. Ein Anschluss 122 zur Flüssigkeitshandhabung steht in Fluid leitender Verbindung mit dem Hohlraum 120, und der Hohlraum ist ferner teilweise mit einer Überlaufkammer 124 umgeben, die Flüssigkeit aus dem Hohlraum aufnimmt, wenn der Hohlraum Flüssigkeit mit einem Volumen enthält, das größer ist als das Hohlraumvolumen. Der Überlaufanschluss 125 zur Flüssigkeitshandhabung ist an der gegenüberliegenden Seite des Anschlusses 122 zur Flüssigkeitshandhabung angeordnet und steht in Fluid leitender Verbindung mit der Überlaufkammer 124. Ein Multisubstrat-Chip 130 ist mit dem Grundelement 140 verbunden, das zusammen mit dem Gehäuse 110 den Hohlraum 120 bildet. Das Grundelement 140 beinhaltet ferner ein Führungselement 142 an wenigstens zwei Seiten.

1B veranschaulicht eine schematische senkrechte Querschnittsansicht eines Teils des Multisubstrat-Testchips, auf dem eine Matrix 138 (umfassend eine erste Schicht 138A und eine zweite Schicht 138) auf einem Träger 134 aufgetragen ist.

In die erste Schicht 138A der Matrix 138 sind mehrere Crosslinker 136 eingebettet, mit denen mehrere Substrate 132 verbunden sind (hier: über molekulare Anker (Linien zwischen Crosslinkern und Substraten)). Ebenfalls ist an einer vorgegebenen Position auf der Matrix ein Referenzmarker 150 und 150' angeordnet, die ebenso über einen Crosslinker (und molekulare Anker) mit der ersten Schicht der Matrix verbunden sind.

Bezüglich des Gehäuses 110 ist es allgemein bevorzugt, dass das Gehäuse aus einem transparenten Polyethylen hoher Dichte hergestellt ist. Es ist jedoch zu verstehen, dass sich das Material für das Gehäuse erheblich ändern kann und alternative Materialien natürliche und synthetische Polymere, Metalle, Keramiken, Glas, Presspapier und jede sinnvolle Kombination davon umfassen. Zum Beispiel sind, wo ein Einweggehäuse bevorzugt ist, verschiedene synthetische Polymere und/oder Presspapier als besonders geeignet erachtet. Auf der anderen Seite und insbesondere dort, wo das Gehäuse mehrmals wieder verwendet wird, werden haltbarere Materialien (zum Beispiel Keramik oder Metall) vorteilhaft eingesetzt. Ferner können ebenfalls Materialien beinhaltet sein, um bestimmte Verfahrensschritte zu ermöglichen, die andernfalls das Gehäuse beschädigen würden. Wo zum Beispiel das Gehäuse sterilisiert werden muss (zum Beispiel durch Bestrahlung oder Autoklavierung), kann Glas vorteilhaft als Gehäusematerial eingesetzt werden.

Auf ähnliche Weise müssen optische Eigenschaften nicht notwendigerweise auf ein transparentes Material beschränkt sein. Wo es zum Beispiel erwünscht ist, kann ein reflektierendes oder Licht absorbierendes Material eingesetzt werden, um die Analyseempfindlichkeit zu verbessern. Ferner kann das Gehäuse (an sich oder in Verbindung mit dem Grundelement) eingesetzt werden, Energie zu und von der Probe zu übertragen. Zum Beispiel kann das Unterteil des Gehäuses als ein Wandler für Ultraschallenergie eingesetzt werden, während der Rest des Gehäuses ausgelegt sein kann, die in dem Gehäuse angeordnete Probe zu erwärmen und/oder zu kühlen.

Es ist jedoch besonders bevorzugt, dass wenigstens ein Teil des Gehäuses einen klaren, halbtransparenten oder lichtdurchlässigen (d.h. lichtpermeablen) Teil umfasst, der es erlaubt, dass einfallendes Licht durch das Gehäuse fällt. Solche Gehäuse sind besonders dort wünschenswert, wo der Multisubstrat-Chip einen Referenzmarker und wenigstens ein Lichtsubstrat beinhaltet. Folglich umfassen besonders bevorzugte Vorrichtungen ein Gehäuse, das wenigstens teilweise einen Multisubstrat-Chip umhüllt, der einen Referenzmarker und mehrere Substrate an vorgegebenen Positionen beinhaltet, worin der Referenzmarker durch eine erste Lichtquelle in einem ersten Winkel beleuchtet wird und worin wenigstens eines der mehreren Substrate durch eine zweite Lichtquelle in einem zweiten Winkel beleuchtetet wird und worin das Gehäuse derart ausgelegt ist, dass der erste Winkel und der zweite Winkel nicht identisch sind.

Es ist insbesondere zu verstehen, dass die getrennte Beleuchtung eines Referenzmarkers und eines Substrats zahlreiche Vorteile aufweist. Zum Beispiel erfordern bekannte optisch analysierte Mikroarrays üblicherweise, dass die Fokusebene oder der Brennpunkt zur Detektion eines gekennzeichneten Analyts unabhängig für jedes gekennzeichnete, an das Mikroarray gebundene Analyt bestimmt werden müssen, was nahezu immer die Beleuchtung des fluoreszierenden Analytmarkers erfordert. Folglich und insbesondere dort, wo die Einstellung auf die optimale Fokusebene oder den Brennpunkt relativ langsam ist (üblicherweise bis zu ungefähr einer Minute pro Stelle), ist die Fotobleichung (und gleichzeitig der Verlust des eigentlichen Signals) der Fluorophore praktisch unvermeidbar. Außerdem neigen die individuellen Fokuseinstellungen dazu, die Analysezeit drastisch zu erhöhen, insbesondere dort, wo die Dichte der gekennzeichneten Analyte relativ hoch ist.

Demgegenüber setzen die betrachten Vorrichtungen eine Lichtquelle ein, die eine oder mehrere Referenzstellen durch das Gehäuse beleuchtet, worin sich das Beleuchtungslicht vorzugsweise wenigstens 20 nm von dem Beleuchtungslicht der Substrate unterscheidet. Insbesondere stellen die betrachteten Anordnungen eine Dunkelfeldbeleuchtung der Referenzstellen bereit. Somit kann die Intensität des Beleuchtungslichts der Referenzstellen erheblich verringert werden, wodurch die Wahrscheinlichkeit der Fotobleichung der gekennzeichneten, an die Substrate gebundenen Analyte verringert wird.

Außerdem kann, wo sich der (die) Referenzmarker an vorgegebener Position relativ zu den Substraten befinden, die Beleuchtung der Referenzmarker eingesetzt werden, den Multisubstrat-Chip in die Fokusebene eines optischen Instruments zu leiten, das die optischen Signale der gekennzeichneten, mit den Substraten auf dem Multisubstrat-Chip verbundenen Analyte erfasst. Folglich wird erwartet, dass das Neufokussieren für jedes der folgenden Pixel in dem Multisubstrat-Chip teilweise, wenn nicht völlig, vermieden werden kann, was die Messzeit für den gesamten Multisubstrat-Chip erheblich verringert. Die Bestimmung der richtigen Fokusebene kann durch Erfassen mehr als eines Referenzmarkers bereitgestellt werden, und es wird insbesondere erwartet, dass jeder Multisubstrat-Chip wenigstens vier Referenzmarker beinhaltet.

Während es allgemein bevorzugt ist, dass das gesamte Gehäuse vollständig lichtpermeabel ist, ist ebenfalls zu verstehen, dass nur Teile (zum Beispiel Kanäle durch das Gehäuse mit oder ohne Linsen) für die Beleuchtung der Referenzmarker lichtpermeabel sein können. Alternativ und insbesondere dort, wo das Gehäuse lichtpermeabel ist, wird erwartet, dass die Referenzmarker mit herkömmlicher Dunkelfeldbeleuchtung beleuchtet werden oder bei einer Beleuchtung, bei der der Referenzmarker durch eine erste Lichtquelle in einem ersten Winkel beleuchtet wird und worin wenigstens eines der mehreren Substrate durch eine zweite Lichtquelle in einem zweiten Winkel (vorzugsweise mit einer Winkeldifferenz größer als 45 Grad) beleuchtet wird.

Geeignete Referenzmarker beinhalten alle bekannten Moleküle oder Zusammensetzungen, die bei der Beleuchtung ein optisch detektierbares Signal erzeugen (d.h. Lichtemission oder Lichtabsorption). Deshalb werden insbesondere alle bekannten Chromophoren und Fluorophoren betrachtet. Ferner ist zu verstehen, dass der Referenzmarker ebenfalls einen chemilumineszierenden Teil beinhalten kann, der ein optisch detektierbares Signal unter vorgegebenen Reaktionsbedingungen emittiert. Solche Reaktionsbedingungen können zum Beispiel durch Zugabe geeigneter Reagenzien in den Hohlraum der Vorrichtung erzeugt werden und sind einem Fachmann wohl bekannt.

Besonders bevorzugte Lichtquellen beinhalten verschiedene Laser, es wird jedoch allgemein erwartet, dass alle für die Photonenanregung bekannten Lichtquellen (zum Beispiel Fluoreszenz, Phosphoreszenz) für die Verwendung hierin geeignet sind. Es gibt zahlreiche geeignete, nach dem Stand der Technik bekannte Lichtquellen und eine beispielhafte Sammlung solcher Quellen kann in „Fluorescence Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology)" von Dan Sackett (Humana Press; ISBN: 0896035441) oder „Fluorescence Microscopy and Fluorescent Probes" von Jan Slavik (Plenum Pub Corp; ISBN 0306460211) gefunden werden. Es ist jedoch insbesondere bevorzugt, dass, wo Laser eingesetzt werden, der Unterschied in der Wellenlänge zwischen dem ersten und dem zweiten Laser (zur Beleuchtung des Referenzmarkers und des Substrats) wenigstens 20 nm beträgt.

Weiterhin können geeignete Gehäuse und/oder Multisubstrat-Chips einen oder mehrere Registrierungsmarker, Strichcodes und/oder Normierungen beinhalten, die manuell oder automatisch gelesen werden können. Zum Beispiel wird erwartet, dass manuell lesbare Marker aufgedruckte oder ansonsten befestigte Seriennummern, Art der Substrate auf dem Chip, Telefonnummer des Lieferanten usw. beinhalten. Automatisch lesbare Referenzmarker können Strichcodes oder ein oder mehrere farbige oder fluoreszierende Etiketten beinhalten, die einen bestimmten Informationsteil kodieren.

Bezüglich der Gehäusegröße wird erwartet, dass eine bestimmte Größe nicht einschränkend auf den erfinderischen Gegenstand wirkt. Bevorzugte Größen sind jedoch üblicherweise Größen, bei denen das längste Maß des Gehäuses weniger als 10 Zoll beträgt, bevorzugter weniger als 5 Zoll, noch bevorzugter weniger als 2 Zoll und am meisten bevorzugt 1 Zoll und noch weniger.

Folglich wird erwartet, dass das Volumen geeigneter Hohlräume erheblich variieren kann. Bevorzugte Hohlräume weisen jedoch ein Volumen von weniger als 20 ml auf, bevorzugter zwischen 0,01 ml und 1 ml und am meisten bevorzugt zwischen 0,01 ml und 1 ml. Bezüglich der Form geeigneter Hohlräume wird erwartet, dass jede sinnvolle Form geeignet ist, solange solch eine Form den Multisubstrat-Chip wenigstens zum Teil aufnimmt. Zum Beispiel können geeignete Hohlräume eine runde, elliptische oder quadratische Form aufweisen. Ähnlich können die Wände des Hohlraums senkrecht oder in einem Winkel (vorzugsweise zwischen 45 Grad und 89 Grad) zur Oberfläche des Multisubstrat-Chips stehen. Daher wird abhängig von der Größe und der Gestaltung des Hohlraums, der Wand/Wände und des Multisubstrat-Chips erwartet, dass der Multisubstrat-Chip an verschiedenen Positionen des Hohlraums angeordnet sein kann. Es ist jedoch allgemein bevorzugt, dass der Multisubstrat-Chip auf dem Boden des Gehäuses angeordnet ist (der ein Grundelement sein kann oder nicht). Alternativ kann der Multisubstrat-Chip jedoch auch an dem Gehäuse derart befestigt sein, dass sich der Multisubstrat-Chip an einer Position außer dem Boden des Hohlraums befindet (zum Beispiel an den Wänden des Hohlraums aufgehängt).

Es wird weiterhin erwartet, dass sich der Hohlraum in Fluid leitender Verbindung mit einem oder mehreren Anschlüssen zur Flüssigkeitshandhabung befindet, wobei solche Anschlüsse ausgelegt sein können, eine Pipettenspitze zum Hinzufügen und/oder zur Entnahme von Fluids aufzunehmen. Alternativ können die betrachteten Anschlüsse zur Flüssigkeitshandhabung ebenfalls Kanäle oder Durchgangslöcher in dem Gehäuse sein, um ein Fluid hinzuzufügen und/oder abzulassen. Obwohl nicht besonders bevorzugt, können die betrachteten Anschlüsse zur Flüssigkeitshandhabung ferner Reservoirs beinhalten, die Reagenzien oder andere testbezogene Fluids aufbewahren, oder Strukturen bereitstellen, um den nichtlinearen Fluss einer Flüssigkeit zu erhöhen/senken oder Strukturen, um den Fluss einer Flüssigkeit zu beschleunigen/verlangsamen oder Strukturen, um ein Fluid mit einem anderen Fluid zu mischen.

In einem weiter bevorzugten Gesichtspunkt der betrachteten Vorrichtungen steht der Hohlraum in Fluid leitender Verbindung mit einer Überlaufkammer und es ist insbesondere bevorzugt, dass der Hohlraum lediglich in Fluid leitender Verbindung mit einer Überlaufkammer steht, wenn der Hohlraum Flüssigkeit mit einem Volumen enthält, das größer ist als das vorgegebene Volumen des Hohlraums. Somit können die betrachteten Überlaufkammern einen Kanal oder ein Durchgangsloch umfassen, das derart angeordnet ist, dass das Fluid nur von dem Hohlraum aufgenommen wird, wenn der Fluidpegel eine vorgegebene Höhe erreicht. Zusätzlich können geeignete Überlaufkammern einen oder weitere Anschlüsse zur Flüssigkeitshandhabung beinhalten und dieselben Erwägungen gelten für den Anschluss/die Anschlüsse zur Flüssigkeitshandhabung wie oben beschrieben für die betrachteten Überlaufanschlüsse zur Flüssigkeitshandhabung. In einem besonders bevorzugten Gesichtspunkt ist die Überlaufkammer ein Kanal, der wenigstens teilweise den Hohlraum umgibt und wenigstens einen Überlaufanschluss zur Flüssigkeitshandhabung beinhaltet.

In einem weiteren besonders bevorzugten Gesichtspunkt des erfinderischen Gegenstands ist der Multisubstrat-Chip an oder nahe dem Boden des Hohlraums angeordnet und der Hohlraum steht lediglich in Fluid leitender Verbindung mit einer Überlaufkammer, wenn der Hohlraum Flüssigkeit mit einem Volumen enthält, das größer ist als das vorgegebene Volumen des Hohlraums. Aus einem anderen Blickwinkel betrachtet, ist besonders zu erkennen, dass in solchen Vorrichtungen das Volumen eines Fluids in dem Hohlraum auf einem konstanten Wert ohne vorherige Bestimmung der Fluidmenge, die sich bereits in dem Hohlraum befindet, gehalten werden kann. Ein konstantes Fluidvolumen ist besonders wünschenswert, wo die Beleuchtung einer Probe oder die Detektion eines optischen Signals von dem Multisubstrat-Chip durch eine Fluidschicht ausgeführt wird, da die Höhe der Fluidschicht vorbestimmt und im Wesentlichen in solchen Hohlräumen konstant ist (d.h. sie ändert sich üblicherweise weniger als +/–5%, üblicher weniger als +/–2%).

4 veranschaulicht einige Vorteile der betrachteten Hohlräume, die in Fluid leitender Verbindung mit einer Überlaufkammer stehen. Hier weist eine Multisubstrat-Testvorrichtung 400 einen Hohlraum 410 auf, der in Fluid leitender Verbindung mit der Überlaufkammer 420 steht (wenn das Fluidvolumen in dem Hohlraum das Volumen des Hohlraums übersteigt). Der Laserstrahl 432 aus dem Laser 430 (üblich aus einem konfokalen Mikroskop; nicht dargestellt) wird an der Fluidoberfläche 412 abgelenkt. Der Ablenkwinkel wird vorwiegend durch den Brechungsindex des Fluids und den Winkel des Laserstrahls 342 relativ zur Oberfläche 432 bestimmt. Ungeachtet des Winkels ist jedoch zu verstehen, dass die horizontale Abweichung D1 und D2 unter anderem durch die Länge des Wegs, den das Licht durch das Fluid zurücklegt, bestimmt ist. Folglich verringert, wenn es sie nicht vollständig beseitigt, ein vorgegebenes Volumen des Hohlraums (und damit eine vorgegebene Höhe des Fluids) die Fehlbeleuchtung von Positionen auf dem Multisubstrat-Chip erheblich. Außerdem verhindert das Bereitstellen eines konstanten Fluidvolumens über dem Multisubstrat-Chip die meisten Probleme bei den Versuchen, das Fluid vor der Detektion eines optischen Signals zu entfernen (zum Beispiel unvollständiges Ablassen, eingeschlossene Luftblasen usw.).

In einem weiteren bevorzugten Gesichtspunkt der betrachteten Vorrichtungen ist der Hohlraum wenigstens zum Teil durch das Gehäuse und ein Grundelement gebildet und es wird insbesondere erwartet, dass das Gehäuse und das Grundelement entfernbar miteinander verbunden sind (zum Beispiel über Stifte, Schrauben usw.). In alternativen Gesichtspunkten kann das Gehäuse jedoch dauerhaft mit dem Grundelement verbunden sein. Folglich kann der Multisubstrat-Chip wenigstens in einigen der bevorzugten Vorrichtungen (direkt oder indirekt) mit dem Grundelement verbunden sein. Direkte Verbindung bedeutet, dass der Träger des Multisubstrat-Chips an dem Grundelement befestigt ist, wohingegen indirekte Verbindung bedeutet, dass sich wenigstens eine zusätzliche Schicht zwischen dem Multisubstrat-Chip und dem Grundelement befindet.

In noch weiteren bevorzugten Gesichtspunkten ist der Hohlraum ein offener Hohlraum, wobei der hierin verwendete Begriff „offener Hohlraum" sich auf einen Hohlraum in dem Gehäuse bezieht, der von einem Punkt außerhalb des Gehäuses zugänglich ist, ohne durch eine Wand des Gehäuses oder einen Kanal, der den Hohlraum mit der Außenseite des Gehäuses verbindet, zu gehen.

Bezüglich des Materials für das Grundelement wird erwartet, dass jedes Material, das (a) zum Tragen des Multisubstrat-Chips geeignet ist und (b) das Grundelement an dem Gehäuse befestigt, für die Verwendung hierin als geeignet betrachtet ist. Es ist jedoch allgemein bevorzugt, dass das Grundelement ein Material umfasst (und ausgelegt ist), thermische und/oder Ultraschallenergie auf den Multisubstrat-Chip und/oder ein Fluid in dem Hohlraum zu übertragen. Folglich beinhalten besonders bevorzugte Materialien Metalle (zum Beispiel Aluminium), Keramiken und synthetische Polymere.

Obwohl nicht einschränkend auf den erfinderischen Gegenstand, ist es allgemein bevorzugt, dass das Grundelement wenigstens ein, bevorzugter zwei, Führungselemente aufweist, die bei der automatischen Handhabung der analytischen Verrichtungen behilflich sind. Zum Beispiel beinhalten die betrachteten Führungselemente Vertiefungen oder Vorsprünge aus dem Grundelement, können jedoch auch Magnetflecken oder Elemente beinhalten, die mit einem Aktor in Eingriff stehen (zum Beispiel Haken, Ösen usw.). Somit können die betrachteten Vorrichtungen ein Gehäuse mit einer ersten Breite und ein Grundelement mit einer zweiten Breite umfassen, wobei die erste Breite kleiner ist als die zweite Breite.

In noch einem weiteren alternativen Aufbau können geeignete analytische Vorrichtung mehr als einen Multisubstrat-Chip beinhalten (wobei wenigstens ein Chip wenigstens teilweise in dem Hohlraum angeordnet ist). Wo zum Beispiel Zellextrakte in solchen Vorrichtungen analysiert werden, kann ein erster Multisubstrat-Chip eingesetzt werden, eine Nukleinsäurepopulation zu analysieren, während ein zweiter Multisubstrat-Chip eingesetzt werden kann, eine Polypeptidpopulation zu analysieren (siehe 2B). Alternativ und insbesondere wo sich Hybridisierungsbedingungen zwischen mehrfachen Multisubstrat-Chips und mehrfachen Hohlräumen ändern, können mehrfache Multisubstrat-Chips eingesetzt werden (zum Beispiel mit einem Chip pro Hohlraum), wobei wenigstens einer der Chips wenigstens teilweise in dem entsprechenden Hohlraum angeordnet ist (siehe 2A).

Bevorzugte Matrizen sind Multifunktionsmatrizen, die zusätzlich zu dem Crosslinker wenigstens ein weiteres Zusatzmittel beinhalten, das spezifisch für einen besonderen Aufbau oder eine Testbedingung ist. Geeignete Zusatzmittel können ausgewählte Eigenschaften verleihen und insbesondere die betrachteten Zusatzmittel beinhalten einen Puffer (zum Beispiel um die Stringenz auf ein bestimmtes Niveau einzustellen, den pH auf einen bestimmten Wert zu ändern usw.), ein Befeuchtungsmittel (zum Beispiel um die Matrixhydratation zu erhalten oder anzupassen), ein Licht abweisendes Mittel (zum Beispiel um die Trägerautofluoreszenz zu unterdrücken) oder ein oberflächenaktives Mittel (zum Beispiel um die Matrixhaftung an dem Träger zu verbessern).

Ferner können geeignete Matrizen mehrere Schichten beinhalten, die vorzugsweise chemisch unterschiedliche Schichten sind. Zum Beispiel kann eine erste Schicht ein Reinigungsmittel beinhalten, um die Haftung an dem Träger zu verbessern, während eine zweite Schicht ein Licht abweisendes Mittel beinhalten kann, um die Trägerautofluoreszenz zu verringern und eine dritte Schicht beinhaltet den Crosslinker, der eingesetzt wird, um das Substrat mit dem Träger zu verbinden. Es wird allgemein erwartet, dass jeder Crosslinker geeignet ist, der ein modifiziertes oder nicht modifiziertes Substrat (kovalent oder nichtkovalent) halten kann, es ist besonders bevorzugt, dass der Crosslinker ein Molekül umfasst, dass Biotin mit KD von nicht mehr als 10–5M. Somit umfassen geeignete Crosslinker Avidin, Streptavidin und Antikörper gegen Biotin. Ferner wird erwartet, dass geeignete Crosslinker in der Matrix eingesetzt werden können, um einen Referenzmarker oder eine Referenzsubstanz zu binden, gegen deren Position oder deren optisch detektierter Signalmenge gerechnet werden kann.

Außerdem ist insbesondere zu verstehen, dass in den bevorzugten Gesichtspunkten die Matrix (zum Beispiel Agarose, Gelatin oder Polyacrylamid) auf den Träger durch nach dem Stand der Technik wohl bekannte Verfahren aufgetragen wird. Daher werden in Verbindung mit unebenen Trägeroberflächen stehende Probleme allgemein vermieden. Ferner kann durch Zugabe von Zusatzmitteln unerwünschte Signalinterferenz von dem Träger im Wesentlichen verringert, wenn nicht eliminiert werden.

In noch einem weiteren Gesichtspunkt des erfinderischen Gegenstands, ist zu verstehen, dass mehrere der betrachteten Vorrichtung in einem Magazin beinhaltet sein können, um das Beladen eines Analysators mit einer Anzahl an Multisubstrat-Chips zu ermöglichen. Während sich die Anordnung der analytischen Vorrichtungen in dem Magazin erheblich ändern kann (zum Beispiel linear als ein Vorrichtungsband oder eine Vorrichtungskette, zweidimensional als Vorrichtungs-Array oder dreidimensional als eine Vorrichtungsrolle), ist es allgemein bevorzugt, dass die betrachteten Vorrichtungen derart gestapelt sind, dass ein Grundelement einer ersten Vorrichtung über einem Gehäuse einer zweiten Vorrichtung angeordnet ist. Eine Führung in einem Magazin kann mit einem Führungselement der betrachteten Vorrichtungen in Eingriff stehen und ein Gewicht oder eine Feder oberhalb der Vorrichtungen kann die mechanische Kraft bereitstellen, um die Vorrichtungen der Reihe nach zum Boden des Magazins zu befördern. Ein beispielhaftes Magazin ist in 3 veranschaulicht, in der das Magazin 300 mehrere analytische Vorrichtungen 300A beinhaltet.

In Betrieb wird eine analytische Vorrichtung gemäß dem erfinderischen Gegenstand bereitgestellt (zum Beispiel in einem Magazin oder manuell in einen Analysator eingeführt) und in einem Schritt werden die mehreren Substrate in Kontakt mit wenigstens einem aus der Gruppe bestehend aus einem Probenfluid (zum Beispiel Vollblut, Zellextrakt usw.), einem Reagensfluid (zum Beispiel Fluid mit hohem Salzgehalt zur Anpassung der Stringenz), einem Waschfluid (zum Beispiel Wasser), einer gekennzeichneten Probe (zum Beispiel Nukleinsäure oder Antikörper) und/oder einem Detektionsfluid (zum Beispiel kolorimetrische oder luminogene Substrate) ausgewählten Fluid gebracht, vorzugsweise wenn sich der Multisubstrat-Chip in einer im Wesentlichen horizontalen Position befindet (d.h. nicht mehr als ± 15 Grad von der Horizontalen, üblicher nicht mehr als ± 8 Grad von der Horizontalen und am üblichsten nicht mehr als ± 3 Grad von der Horizontalen). In einem weiteren Schritt wird erwartet, dass wenigstens eines der mehreren Substrate ein Analyt aus dem Fluid (zum Beispiel Probenfluid) bindet, worin das Binden des Analyts in einer im Wesentlichen horizontalen Position detektiert wird.

Daher beinhalten in besonders betrachteten Gesichtspunkten des erfinderischen Gegenstands die bevorzugten Vorrichtung eine erste Lichtquelle, die einen oder mehrere Referenzmarker beleuchtet, wobei die Beleuchtung der Referenzmarker eingesetzt wird, um die Fokusebene der optischen Vorrichtung zu bestimmen (üblicherweise ein konfokales Mikroskop), das den Multisubstrat-Chip analysiert. Nachdem die richtige Fokusebene bestimmt wurde, kann die Analyse der Sonden, Proben oder anderer Moleküle auf dem Multisubstrat-Chip ohne weiteres Fokussieren durch Verwenden einer zweiten Lichtquelle (üblicherweise aus dem konfokalen Mikroskop) fortgesetzt werden. Solch eine Vorausbestimmung der Fokusebene ist besonders dort vorteilhaft, wo eine relativ große Anzahl an individuellen Messungen eingesetzt wird. Somit ist zu erkennen, dass die Analyse mehrerer Substrate auf einem Multisubstrat-Chip erheblich schneller ausgeführt werden kann als mit bekannten Vorrichtungen, da das Neufokussieren von einem Substrat zu dem nächsten zur Optimierung der Signalstärke ausgelassen werden kann. Außerdem ist zu erkennen, dass die Bestimmung der Fokusebene unter Verwendung von Referenzmarkern auf dem Multisubstrat-Chip (unter bevorzugter Verwendung einer anderen Beleuchtungswellenlänge als die Wellenlänge zur Beleuchtung des Substrats) die Fotobleichung der Fluorophore vorteilhaft verringert, wenn nicht beseitigt. Während es allgemein bevorzugt ist, dass die Beleuchtung des (der) Referenzmarker(s) mit einer Licht emittierenden Diode durchgeführt wird, werden andere Lichtquellen (weißglühend oder fluoreszierend) ebenso als geeignet betrachtet. Ferner können, wo angebracht, die erste und zweite Lichtquelle identisch sein.

Somit wurden spezifische Ausführungsformen und Anwendungen verbesserter Substrat-Chipvorrichtungen offenbart. Es ist jedoch jenen Fachleuten offensichtlich, dass viele weitere Modifikationen neben den bereits beschriebenen möglich sind, ohne von dem erfinderischen Gedanken hierin abzurücken. Der erfinderische Gegenstand wird deshalb nicht eingeschränkt, außer in dem Sinn der angefügten Ansprüche. Außerdem sind bei der Interpretation sowohl der Patentschrift als auch der Ansprüche alle Begriffe in der am weitesten möglichen Weise in Übereinstimmung mit dem Kontext zu interpretieren. Insbesondere sind die Begriffe „umfasst" und „umfassend" als Bezug nehmend auf Elemente, Komponenten oder Schritte in einer nicht ausschließenden Weise zu interpretieren, die besagt, dass die verwiesenen Elemente, Komponenten oder Schritte vorhanden sein, angewendet oder mit anderen Elementen, Komponenten oder Schritten, auf die nicht ausdrücklich verwiesen wird, kombiniert werden können.


Anspruch[de]
Analytische Vorrichtung, umfassend:

ein Gehäuse (110), das wenigstens teilweise einen Mehrfachsubstrat-Chip (130) umhüllt, der einen Referenzmarker (150) und mehrere Substrate (132) an vorgegebenen Positionen beinhaltet;

dadurch gekennzeichnet, dass

der Referenzmarker (150) durch eine erste Lichtquelle (180) in einem ersten Winkel beleuchtet wird, und dass wenigstens eines der mehreren Substrate (132) durch eine zweite Lichtquelle (170) in einem zweiten Winkel beleuchtet wird; und

das Gehäuse (110) so ausgelegt ist, dass der erste Winkel und der zweite Winkel nicht identisch sind.
Analytische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, worin wenigstens ein Abschnitt des Gehäuses (110) lichtdurchlässig ist. Analytische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, worin der Referenzmarker (150) sich an einer vorgegebenen Position relativ zu wenigstens einem der mehreren Substrate (132) befindet. Analytische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, worin der Referenzmarker (150) in einem Dunkelfeld beleuchtet wird. Analytische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, worin die Beleuchtung des Referenzmarkers (150) vorgenommen wird, um den Mehrfachsubstrat-Chip (130) in eine Fokusebene eines optischen Instruments zu lenken. Analytische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, ferner umfassend einen zweiten Referenzmarker (150'). Analytische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, worin eine Differenz zwischen dem ersten Winkel und dem zweiten Winkel wenigstens 45 Grad beträgt. Analytische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, ferner umfassend wenigstens einen Strichcode, eine Normierung und einen Registrierungsmarker. Analytische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, worin der Referenzmarker (150) einen chemilumineszierenden Marker oder einen fluoreszierenden Marker aufweist. Analytische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, worin die erste Lichtquelle (180) eine Licht emittierende Diode, die Licht mit einer ersten Wellenlänge emittiert aufweist, und worin die zweite Lichtquelle (170) einen Laser aufweist, der Licht mit einer zweiten Wellenlänge emittiert, und worin die erste und zweite Wellenlänge um wenigstens 20 nm auseinander liegen. Analytische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, worin der Mehrfachsubstrat-Chip (130) in einem Hohlraum (120) angeordnet ist, der wenigstens teilweise durch das Gehäuse (110) gebildet wird, und worin der Hohlraum (120) ein vorgegebenes Volumen zwischen 0,01 ml und 10 ml aufweist. Analytische Vorrichtung gemäß Anspruch 11, worin der Hohlraum (120) in Fluid leitender Verbindung mit einer Überlaufkammer (124) steht, wenn der Hohlraum (120) eine Flüssigkeit mit einem Volumen enthält, das größer als das vorgegebene Volumen ist. Analytische Vorrichtung gemäß Anspruch 12, worin das Gehäuse (110) ein Grundelement (140) beinhaltet, das so ausgelegt ist, dass wenigstens eine Energie aus thermischer Energie und Ultraschallenergie auf den Mehrfachsubstrat-Chip (130) und/oder ein Fluid, das sich in dem Hohlraum (120) befindet, übertragen wird. Analytische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, worin wenigstens eines der mehreren Substrate (132) ein Analyt aus einem Probenfluid bindet, und worin die Bindung des Analyts detektiert wird, wenn sich der Mehrfachsubstrat-Chip (130) in einer im Wesentlichen horizontalen Position befindet.






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