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Dokumentenidentifikation DE102006031177A1 10.01.2008
Titel Verfahren und Vorrichtung zur Erzeugung eines Bildes einer dünnen Schicht eines Objekts
Anmelder Carl Zeiss MicroImaging GmbH, 07745 Jena, DE
Erfinder Westphal, Peter, Dr., 07743 Jena, DE;
Bublitz, Daniel, Dr., 07743 Jena, DE
DE-Anmeldedatum 06.07.2006
DE-Aktenzeichen 102006031177
Offenlegungstag 10.01.2008
Veröffentlichungstag im Patentblatt 10.01.2008
IPC-Hauptklasse G02B 21/00(2006.01)A, F, I, 20060706, B, H, DE
IPC-Nebenklasse G01B 11/25(2006.01)A, L, I, 20060706, B, H, DE   
Zusammenfassung Bei einem Verfahren zur Erzeugung eines Bildes einer Schicht eines Objekts (4) mittels einer Weitfeldoptik (5) auf einem ortsauflösenden Detektor (6), wird das Objekt (4) in wenigstens einer Objektebene (3) mit wenigstens zwei binären Beleuchtungsmustern (26, 27; 33, 34) fokussiert beleuchtet und für jedes der Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) werden entsprechende Bilder erfaßt, wobei die Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) jeweils Dunkelbereiche (27; 34) und Hellbereiche (26; 33) aufweisen, von denen die Hellbereiche und/oder die Dunkelbereiche bei Überlagerung der Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) das Objekt (4) vollständig überdecken. Aus den erfaßten Bildern wird ein Schichtbild ermittelt, das Teilsegmente umfaßt, die jeweils einen Teilbereich des Objekts (4) wiedergeben, der so innerhalb eines Hellbereichs eines der verwendeten Beleuchtungsmuster liegt, daß dessen Ränder von den Rändern des Hellbereichs um wenigstens einen vorgegebenen Mindestabstand beabstandet sind und die jeweils unter wenigstens teilweiser Falschlichtkorrektur unter Verwendung von wenigstens zwei Bildern ermittelt sind, die bei jeweils verschiedenen Beleuchtungsmustern erfaßt wurden, in denen der dem jeweiligen Teilsegment entsprechende Teilbereich ganz innerhalb eines Hellbereichs eines ersten der verschiedenen Beleuchtungsmuster bzw. ganz innerhalb eines Dunkelbereichs eines zweiten der verschiedenen Beleuchtungsmuster liegt.

Beschreibung[de]

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Erzeugung eines Bildes einer dünnen Schicht eines Objekts, insbesondere mittels einer Weitfeldoptik, sowie eine entsprechende Vorrichtung.

Biologische Proben oder Materialien werden häufig mikroskopisch untersucht. Insbesondere können entsprechende Objekte zur Erkennung von Strukturen mit Weitfeldoptiken untersucht werden, die das Objekt bzw. eine dünne Schicht, idealerweise eine Ebene, des Objekts auf einen ortsauflösenden Detektor abbilden. Solche abbildenden Untersuchung kann beispielsweise mit normaler Mikroskopie oder Fluoreszenzmikroskopie erfolgen. Die dünne Schicht kann beispielsweise eine fluoreszierende Schicht auf einem Träger wie ein Objektträger oder der Boden einer Titerplatte sein, die immobilisierte Zellen, Gewebeschnitte oder DNA-Felder, vorzugsweise angeordnet in "Microarrays" enthält.

Zur Untersuchung insbesondere biologischer Objekte wird jedoch häufig auch die quantitative Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt. Das Ziel der quantitativen Fluoreszenzmikroskopie besteht in der Regel darin, durch Bestrahlung einer Probe, insbesondere einer dünnen Schicht gegebener Dicke, Fluoreszenzstrahlung anzuregen, deren Intensität von der zu messenden Konzentration von fluoreszierenden Stoffen in der Probe abhängt. Durch Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung ist ein Rückschluß auf die Konzentration der fluoreszierenden Stoffe möglich. Daher kommt es dann weniger auf extreme Bildschärfe als auf eine sehr zuverlässige Erfassung der nur von der dünnen Schicht ausgehenden Strahlung an. Es werden daher häufig statt hochauflösender Mikroskope sogenannte ortsauflösende Fluoreszenzreader verwendet, die als für die quantitative Fluoreszenzmikroskopie optimierte Mikroskope angesehen werden können. Bei den Objekten bzw. Proben kann es sich insbesondere um Biochips handeln, welche auf photolithographischem Wege oder mittels eines Spotters hergestellt wurden.

Um möglichst genaue Meßwerte für die Intensität der in der dünnen Schicht erzeugten Fluoreszenzstrahlung zu erhalten, müssen zwei Bedingungen beachtet werden. Zum einen soll die Fluoreszenzstrahlung aus der dünnen Schicht möglichst umfassend und quantitativ genau erfaßt werden. Zum anderen soll Strahlung, insbesondere Fluoreszenzstrahlung, die nicht aus der dünnen Schicht stammt, möglichst gut unterdrückt werden, d.h. es soll eine guten Tiefenselektion erreicht werden, bei der möglichst nur Strahlung in einer Schicht um die Fokusebene erfaßt wird. Diese zu unterdrückende optische Strahlung wird, obwohl sie nicht unbedingt im sichtbaren Bereich des optischen Spektrums zu liegen braucht, im Folgenden auch als Falschlicht bezeichnet.

Als Quellen für das Falschlicht kommen wenigstens die folgenden Quellen in Betracht. Falschlicht entsteht beispielsweise durch Reflexionen und durch Streulicht an Oberflächen, in Gläsern, z.B. aufgrund von Lufteinschlüssen, durch Eigenfluoreszenz der verwendeten Gläser, an Fassungen oder bei Fluoreszenzmessungen durch nicht unterdrücktes Anregungslicht. Weiterhin kann Falschlicht auch aus Bereichen des Objektes oder der Probe kommen, die außerhalb der vorzugsweise in der dünnen Schicht liegenden Fokusebene liegen, beispielsweise von fluoreszierenden Kontaminationen auf der Rückseite eines Objektträgers oder aus einer an die dünne Schicht angrenzenden Nachbarschicht mit einer fluoreszierenden Flüssigkeit.

Falschlicht kann jedoch auch die Abbildung des Objektes negativ beeinträchtigen, da es den Kontrast der detektierten Intensitätsverteilung verringert oder verfälscht.

Eine Möglichkeit zur Vermeidung von Falschlicht liegt in der Verwendung von konfokalen Laserscannern. Bei einem konfokalen Laserscanner wird stets nur eine kleine Fläche der Probe von wenigen &mgr;m2 beleuchtet und zudem bei der Detektion nur diese kleine Fläche betrachtet. Wird dies mit Hilfe einer gut angepaßten Lochblende konsequent durchgeführt, so wird Falschlicht von vornherein unterdrückt. Laserscanner weisen jedoch gegenüber Mikroskopen mit Weitfeldoptik eine Reihe von Nachteilen auf. Beispielsweise kann bei Fluoreszenzmikroskopie Anregungssättigung und ein starkes Ausbleichen von Fluorophoren auf Grund der hohen Strahlungsintensität im Fokus auftreten. Ferner gibt es deutliche Einschränkungen bei der Wahl der Wellenlänge. Viele bewegliche Komponenten, ein hoher Justieraufwand sowie eine geringe Quanteneffizienz des Detektors, in der Regel ein Photomultiplier, sind weitere Nachteile.

Zur Vermeidung dieser Nachteile sind Verfahren vorgeschlagen, bei den Bilder unter verschiedenen Beleuchtungsmustern erfaßt werden und aus den erfaßten Bildern ein Bild der dünnen Schicht berechnet wird.

So ist in EP 972220 B1 ein Verfahren beschrieben, bei dem drei Bilder des Objekts mit der dünnen Schicht erfaßt werden, die bei auf die dünnen Schicht fokussierter Beleuchtung mit räumlich sinusförmigen, jeweils um eine Drittelperiode gegeneinander verschobenen Intensitätsprofilen erfaßt werden. Aus den erfaßten Bildern wird ein Bild der dünnen Schicht errechnet.

In der DE 199 30 816 A1 sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Tiefenselektion von Mikroskopbildern beschrieben, bei denen ein eindimensional periodisches Gitter, z.B. ein Streifengitter, zur Beleuchtung verwendet wird. Dabei werden mindestens n (n > 2) CCD- Kameraaufnahmen gemacht, wobei die Struktur der Beleuchtung um jeweils 1/n der Gitterkonstanten verschoben wird. Aus den mindestens drei Aufnahmen wird anschließend ein konfokaler Schnitt der Probe berechnet. Dieses Verfahren ist anfällig für Artefakte, wenn das Gitter keine sinusförmige Beleuchtungsintensität auf der Probe erzeugt.

Die WO 98/45745 A1 (DE 698 02 514 T2) beschreibt ein Abbildungssystem und -verfahren für Mikroskope, bei denen eine strukturierte Beleuchtung mittels Überlagerung zweier kohärenter Lichtstrahlen vorgesehen ist. Das Verfahren verfolgt ebenso wie das oben beschriebene Verfahren gemäß der DE 199 30 816 A1 hauptsächlich das Ziel, optische Schnitte in verschiedenen Objektebenen analog einem Laser-Scanning-Mikroskop zu generieren.

Beide Verfahren verfolgen das Ziel, eine Tiefenauflösung von dicken Proben zu erhalten. Sie dienen dazu, mit einer Weitfeldoptik konfokale Schnitte einer im Vergleich zur Tiefenschärfe dicken Probe oder eines Objektes zu erhalten. In beiden Fällen ist der Rechenaufwand relativ groß, weil trigonometrische Gleichungen gelöst werden müssen.

In der unveröffentlichten deutschen Patentanmeldung P 103 30 716.8 ist eine Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens zur Eliminierung von Falschlicht bei der Abbildung von heterogenen, leuchtenden oder beleuchteten flächenhaften Objekten beschrieben. Diese umfaßt eine Strahlungsquelle mit nachgeordneter, die Strahlung homogenisierender Beleuchtungsoptik zur homogenen Ausleuchtung einer nachgeordneten Feldblendenebene, in welcher eine strukturierte Feldblende zur Erzeugung einer dem Objekt oder der Probe überlagerten Beleuchtungsstruktur angeordnet ist. Diese Beleuchtungsstruktur wird durch erste optische Mittel auf die Probe abgebildet, wobei diese ersten optischen Mittel einen Beleuchtungstubus, gegebenenfalls einen Farbteiler, und ein Objektiv umfassen können. Es sind ferner zweite optische Mittel zur Abbildung der Probe zusammen mit der überlagerten Beleuchtungsstruktur auf einen ortsauflösenden Detektor, insbesondere für optische Strahlung, vorgesehen. Die Anordnung enthält ferner Einstellmittel, mit denen die Beleuchtungsstruktur in der Objektebene auf dem Objekt oder der Probe definiert positionierbar ist. Der Detektor ist mit einer Auswerteeinrichtung zur Ermittlung und Eliminierung des Falschlichtes verbunden. Es wird eine strukturierte Hellfeldbeleuchtung mit wenigstens zwei verschiedenen Beleuchtungsmustern verwendet, bei der sich dunkle Bereiche nicht überschneiden. Aus entsprechenden Bildern kann dann ein Dunkelbild und ein Hellbild ermittelt werden. Durch Subtraktion des Dunkelbildes von dem Hellbild kann ein resultierendes Bild erhalten werden.

Die bei dieser Vorrichtung vorgesehene strukturierte Hellfeldbeleuchtung, bei welcher die Objektbeleuchtung und die Abbildung des Objektes zusammen mit der aufbelichteten Feldblendenstruktur durch ein einziges Objektiv erfolgen, kann das Anregungslicht im Objektiv das Auftreten von Falschlicht, insbesondere durch Eigenfluoreszenz der verwendeten Gläser, hervorrufen. Weiterhin wird die Rückseite eines Objekts, z.B. eines Biochips, mit nahezu der gleichen Anregungsintensität bestrahlt wie die Fokusebene. Daher kann auch die durch die Kontamination der Rückseite bedingte Fluoreszenzintensität entsprechend hoch sein und zu Meßfehlern Anlaß geben. Es wurde daher vorgeschlagen, bei einem zweiten Verfahren zur Vermeidung dieser Nachteile statt der Hellfeldbeleuchtung eine strukturierte Dunkelfeldbeleuchtung zu verwenden.

Bei beiden Verfahren ist es notwendig, eine Interpolation zwischen nicht beleuchteten Bereichen durchzuführen, um ein vollständiges Dunkel- bzw. Falschlichtbild zu erhalten.

Alle genannten Verfahren zeigen jedoch für die quantitative Fluoreszenzmikroskopie den Nachteil, daß die Genauigkeit der Messung der Konzentration von fluoreszierendem Material in der dünnen Schicht noch verbesserungsfähig ist, obwohl eine Tiefenselektion erreicht werden kann und Falschlicht aus an die dünne Schicht angrenzenden Bereichen wenigstens teilweise unterdrückt werden kann.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Erzeugung eines Bildes einer, insbesondere auch dünnen, Schicht eines Objekts zu schaffen, das gleichzeitig eine gute Tiefenselektion und eine hohe quantitative Genauigkeit bei Fluoreszenzmessungen erlaubt, sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens bereitzustellen.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Erzeugung eines Bildes einer Schicht eines Objekts mittels einer Weitfeldoptik auf einem ortsauflösenden Detektor, bei dem das Objekt in wenigstens einer Objektebene mit wenigstens zwei binären Beleuchtungsmustern fokussiert beleuchtet wird und für jedes der Beleuchtungsmuster entsprechende Bilder erfaßt werden, wobei die Beleuchtungsmuster jeweils Dunkelbereiche und Hellbereiche aufweisen, von denen die Hellbereiche und/oder die Dunkelbereiche bei Überlagerung der Beleuchtungsmuster das Objekt vollständig überdecken, und aus den erfaßten Bildern ein Schichtbild ermittelt wird, das Teilsegmente umfaßt, die jeweils einen Teilbereich des Objekts wiedergeben, der so innerhalb eines Hellbereichs wenigstens eines der verwendeten Beleuchtungsmuster liegt, daß dessen Ränder von den Rändern des Hellbereichs um wenigstens einen vorgegebenen Mindestabstand beabstandet sind, und die jeweils unter wenigstens teilweiser Falschlichtkorrektur unter Verwendung von wenigstens zwei Bildern ermittelt sind, die bei jeweils verschiedenen Beleuchtungsmustern erfaßt wurden, in denen der dem jeweiligen Teilsegment entsprechende Teilbereich ganz innerhalb eines Hellbereichs eines ersten der verschiedenen Beleuchtungsmuster bzw. ganz innerhalb eines Dunkelbereichs eines zweiten der verschiedenen Beleuchtungsmuster liegt.

Die Aufgabe wird weiter gelöst durch eine Vorrichtung zur Erzeugung eines Bildes einer Schicht eines Objekts, mit einer Beleuchtungseinrichtung zur fokussierten Beleuchtung des Objekts in einer Objektebene, einer Einrichtung zur Erzeugung wenigstens zweier vorgegebener Beleuchtungsmuster zur Beleuchtung des Objekts in der Objektebene mit einem im Strahlengang nach der Beleuchtungseinrichtung angeordneten als strukturierte Blende wirkenden Element, wobei die Beleuchtungsmuster jeweils Dunkelbereiche und Hellbereiche aufweisen, von denen die Hellbereiche und/oder die Dunkelbereiche bei Überlagerung der Beleuchtungsmuster das Objekt vollständig überdecken, einer, vorzugsweise als Weitfeldoptik, ausgebildeten Abbildungsoptik zur Abbildung der Objektebene auf eine Bildebene, einem in der Bildebene angeordneten ortsauflösenden Detektor zur Detektion der von dem Objekt ausgehenden optischen Strahlung, und einer Auswerteeinrichtung zur Auswertung von Detektionssignalen des Detektors, die dazu ausgebildet ist, auf der Basis der Detektionssignale Bilder zu erfassen und die der Bilderfassung folgenden Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens auszuführen und insbesondere aus den erfaßten Bildern ein Schichtbild zu ermitteln, das Teilsegmente umfaßt, die jeweils einen Teilbereich des Objekts wiedergeben, der so innerhalb eines Hellbereichs wenigstens eines der verwendeten Beleuchtungsmuster liegt, daß dessen Ränder von den Rändern des Hellbereichs um wenigstens einen vorgegebenen Mindestabstand beabstandet sind, und die jeweils unter wenigstens teilweiser Falschlichtkorrektur unter Verwendung von wenigstens zwei Bildern ermittelt sind, die bei jeweils verschiedenen Beleuchtungsmustern erfaßt wurden, in denen der dem jeweiligen Teilsegment entsprechende Teilbereich ganz innerhalb eines Hellbereichs eines ersten der verschiedenen Beleuchtungsmuster bzw. ganz innerhalb eines Dunkelbereichs eines zweiten der verschiedenen Beleuchtungsmuster liegt.

Das Verfahren, das mit der Vorrichtung durchführbar ist, dient zur Erzeugung eines Bildes einer Schicht eines Objekts, vorzugsweise eines flächenhaften Objekts, insbesondere eines heterogenen, leuchtenden oder beleuchteten Objekts. Insbesondere kann es sich bei diesem Verfahren um ein Mikroskopieverfahren, vorzugsweise ein quantitatives Fluoreszenzmikroskopieverfahren oder ein Verfahren unter Verwendung eines Fluoreszenzreaders handeln.

Bei dem Verfahren braucht die Schicht nicht unbedingt dünn zu sein; vielmehr kann die Schicht insbesondere eine ganze Schicht, und nicht nur eine Ebene sein, in die die Beleuchtungsstrahlung fokussiert wird.

Bei dem Verfahren wird die Schicht des Objekt, unter dem im Rahmen der Erfindung je nach Größe des abbildbaren Bereichs in der Objektebene eine ganze Probe oder ein ganzer Gegenstand oder nur ein zu untersuchender bzw. abbildbarer Teilbereich einer ganzen Probe oder eines ganzen Gegenstands verstanden wird, mit wenigstens zwei strukturierten, binären Beleuchtungsmustern beleuchtet. Unter einem binären Beleuchtungsmuster wird hierbei ein Beleuchtungsmuster verstanden, in dem, beispielsweise im Unterschied zu Beleuchtungsmustern mit einem Intensitätprofil in Form eines Sinusprofils, die für das Verfahren wesentliche Strukturierung dadurch erzielt wird, daß in die Dunkelbereiche, zumindest im Rahmen der geometrischen Optik, im wesentlichen keine Beleuchtungsstrahlung gelangt und der Übergang von Dunkelbereichen zu Hellbereichen im Vergleich zu der Ausdehnung dieser Bereiche sehr schmal ist (BITTE QUANTITATIVE GRENZE ANGEBEN, WENN MÖGLICH). Die Hell- bzw. Dunkelbereiche des Objekts sind diejenigen Bereiche des Objekts, die bei Beleuchtung mit einem jeweiligen Beleuchtungsmuster in den Hell- bzw. Dunkelbereichen des Beleuchtungsmusters liegen.

Zur Erzeugung der strukturierten Beleuchtung sind bei der Vorrichtung die Beleuchtungseinrichtung zur Abgabe von Beleuchtungslicht, unter dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung neben sichtbarer auch infrarote oder ultraviolette Strahlung verstanden wird, und die Einrichtung zur Erzeugung wenigstens zweier vorgegebener Beleuchtungsmuster zur fokussierten, insbesondere auch strukturierten Beleuchtung des Objekts wenigstens in der abzubildenden Objektschicht vorgesehen. Die Einrichtung zur Erzeugung der binären Beleuchtungsmuster weist hierzu insbesondere ein als Blende wirkendes Element auf, das vorzugsweise als Feldblende wirkt. Das Element verfügt über lichtdurchlässige bzw. transparente und lichtundurchlässige bzw. opake Bereiche, denen in den Beleuchtungsmustern jeweils Hell- und Dunkelbereiche entsprechen, die benachbart sind. Dementsprechend treten in bzw. auf dem Objekt bzw. dem untersuchten Bereich mit Beleuchtungslicht beleuchtete und unbeleuchtete Bereiche auf.

Bei dem Verfahren wird das Objekt nacheinander mit jeweils einem anderen der Beleuchtungsmuster beleuchtet. Die bei dem Verfahren verwendeten Beleuchtungsmuster sind dabei so gewählt, daß deren Dunkelbereiche und/oder deren Hellbereiche bei einer vorgestellten bzw. fiktiven gleichzeitigen Überlagerung der Beleuchtungsmuster das Objekt vollständig überdecken.

Das mit dem jeweiligen Beleuchtungsmuster beleuchtete Objekt wird dann mittels der Abbildungsoptik, die insbesondere ein Objektiv umfassen kann, auf den ortsauflösenden Detektor abgebildet, der zur Erfassung der Bilder des Objekts dient. Als ortsauflösender Detektor kann vorzugsweise eine CCD- oder CMOS-Matrix eingesetzt werden.

Die Signale des ortsauflösenden Detektors werden von der Auswerteeinrichtung, beispielsweise einer Datenverarbeitungseinrichtung mit einer Videoschnittstelle, einem Speicher, in dem wenigstens ein Computerprogramm zur Durchführung der Auswertung und insbesondere der Verfahrensschritte nach der Beleuchtung des Objekts gespeichert sind, und einem Prozessor zur Ausführung des Computerprogramms, zu Bildern verarbeitet.

Die Erfindung geht unter anderem auf folgende Beobachtung zurück: Bei Fokussierung von strukturierter Beleuchtungsstrahlung wie beispielsweise Beleuchtungsstrahlung mit einem quer zur Strahlrichtung sinusförmigen Intensitätsprofil, in eine Ebene des Objekts ergibt sich entlang der Strahlrichtung nur eine durch die Eigenschaften der zur Fokussierung verwendeten Optik bestimmte Verteilung der Beleuchtungsintensität, die zwar ihr Maximum in der Ebene haben kann, jedoch vom Punkt des Maximums aus parall zur Strahlrichtung abfällt. Bei Abbildung der Ebene auf den Detektor durch eine Abbildungsoptik tritt ein analoges Phänomen auf, so daß eine für das jeweilige Beleuchtungsmuster definierte Tiefenresponse-Funktion, die die von dem Detektor empfangene Intensität als Funktion des Abstands der Quelle von der Ebene in Strahlrichtung angibt, ebenfalls ein Maximum in der Ebene aufweist; im Bereich des Maximums ist die Tiefenresponse-Funktion aber auch gekrümmt, so daß die empfangene Intensität für eine gegebene Beleuchtungsintensität mit zunehmendem Abstand von der Fokusebene abfällt. Dieser Abfall bedeutet eine reduzierte Empfindlichkeit nahe der Fokusebene, so daß die aus der beleuchteten Schicht ausgehende Strahlung nicht vollständig erfaßt wird.

Darüber hinaus werden bei beliebigen Beleuchtungsmustern in jedem erfaßten Bild von den beleuchteten Bereichen des Objekts, die mit Hellbereichen des jeweiligen Beleuchtungsmusters beleuchtet sind, soweit vorhanden, dem Falschlicht entsprechende Lichtanteile in die Bereiche des Bildes des Objekts gelenkt, die den Dunkelbereichen des jeweiligen Beleuchtungsmusters auf bzw. in dem Objekt, d.h. unbeleuchteten Bereichen des Objekts, entsprechen. In diesen Bereichen des Bildes werden die Anteile dann als Falschlicht detektiert.

Zur Erhöhung der Empfindlichkeit in der Schicht und der Reduktion der Einflüsse von Falschlicht wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, zum einen binäre Beleuchtungsmuster zu verwenden und zum anderen solche Bereiche in den erfaßten Bildern zur Korrektur von Falschlicht zu kombinieren, die innerhalb von Hell- oder Dunkelbereichen der zur Erfassung der Bilder verwendeten Beleuchtungsmuster liegen und deren Ränder überdies einen vorgegebenen Mindestabstand von den Übergängen zwischen den Hell- und Dunkelbereichen aufweisen. Damit werden Einflüsse der Übergänge zwischen Hell- und Dunkelbereich stark reduziert und es ergibt sich überraschenderweise eine Tiefenresponse-Funktion mit eine Plateau nahe dem Maximum, so daß über die Breite des Plateaus eine im wesentlichen konstante Empfindlichkeit vorliegt.

Darüber hinaus zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren durch seine Einfachheit aus, da nur einfache Summenbildungen und Auswahlen von Intensitätswerten durchzuführen sind. Diese Schritte sind mit Computern, aber auch einfacheren Prozessoren oder sogar nicht programmierten Schaltungen wesentlich schneller durchführbar als trigonometrische Operationen. Dementsprechend kann die erfindungsgemäße Vorrichtung auch sehr einfach aufgebaut sein.

Prinzipiell können bei dem Verfahren schmale Bereiche zwischen den Teilsegmenten auftreten, in denen die Helligkeitswerte durch Interpolation zwischen den Werten der benachbarten Teilsegmente ermittelt werden können. Es ist jedoch bei dem Verfahren bevorzugt, daß die Teilsegmente lückenlos aneinander anschließen oder sich überlappen. Die Vorrichtung ist dazu vorzugsweise so ausgebildet, daß die Teilsegmente lückenlos aneinander anschließen oder sich überlappen. Hierzu ist keine Interpolation zwischen den Teilsegmenten notwendig, was die Durchführung des Verfahrens deutlich beschleunigt und die Genauigkeit des resultierenden Schichtbildes erhöht. Insbesondere kann, da die Dunkelbereiche der Beleuchtungsmuster das Objekt bei Überlagerung der Beleuchtungsmuster vollständig überdecken, aus den Dunkelbereichen der Bilder ohne Interpolation ein Dunkelbild bzw. Falschlichtbild des gesamten Objekts erhalten werden, das alle zu eliminierenden Falschlichtanteile enthält. In dem Fall, daß sich Teilsegmente bzw. diesen entsprechende Teilbereich des Objekts überlappen, kann über die redundanten Teilbereiche der verschiedenen Bildern Bemittelt werden. Beispielsweise kann bei einer Summierung der Abbilder der Hellbereiche eine Renormierung in den Überlappungsbereichen durchgeführt werden, um Effekte einer doppelten Erfassung in diesen Bereichen zu korrigieren. Überlappen sich die Teilsegmente der Beleuchtungsmuster, kann vorzugsweise über die redundanten Teilbereiche der Bilder der Dunkelbereiche aus verschiedenen Bildern gemittelt werden.

Bei dem Verfahren ist es dann besonders bevorzugt, daß sich die Teilsegmente weniger als 10% der minimalen Ausdehnung überlappen. Dazu ist die Vorrichtung vorzugsweise so ausgebildet, daß die Teilsegmente sich weniger als 10% der minimalen Ausdehnung überlappen. Auf diese Weise braucht nur eine geringe Anzahl von Beleuchtungsmustern verwendet zu werden.

Grundsätzlich können die Mindestabstände beliebig gewählt werden. Es ist jedoch bei dem Verfahren bevorzugt, daß die Mindestabstände größer als 1/5 des geringsten Abstands benachbarter Grenzen eines Hell- oder Dunkelbereichs sind. Die Vorrichtung ist dann bevorzugt so ausgebildet, daß die Mindestabstände größer als 1/5 des geringsten Abstands benachbarter Grenzen eines Hell- oder Dunkelbereichs sind. Diese Weiterbildung hat den Vorteil, daß so die Intensität von aus einer Schicht um die Fokusebene kommenden Strahlung besonders vollständig erfaßt werden kann.

Die Teilsegmente können auf unterschiedliche Art und Weise gebildet werden. Bei einer Variante des Verfahrens kann zur Ermittlung des Schichtbildes zunächst aus den erfaßten Bildern ein Hell- und ein Dunkelbild gebildet werden, wobei jeweils Bereiche des Objekts wiedergebende Teilsegmente der erfaßten Bilder verwendet werden, die in einem Hell- bzw. Dunkelbereich eines bei der Erfassung des jeweiligen Bildes verwendeten Beleuchtungsmusters liegenden Bereich des Objekts wiedergeben und deren Rand den Mindestabstand von den Übergängen zwischen den Hell- und Dunkelbereichen des Beleuchtungsmusters aufweist. Durch Differenzbildung aus dem Hell- und dem Dunkelbild kann dann ein wenigstens teilweise korrigiertes Schichtbild erzeugt werden. Bei der Vorrichtung ist dann vorzugsweise die Auswerteeinrichtung dazu ausgebildet, zur Ermittlung des Schichtbildes zunächst aus den erfaßten Bildern ein Hell- und ein Dunkelbild zu bilden, wobei jeweils Bereiche des Objekts wiedergebende Teilsegmente der erfaßten Bilder verwendet werden, die in einem Hell- bzw. Dunkelbereich eines bei der Erfassung des jeweiligen Bildes verwendeten Beleuchtungsmusters liegenden Bereich des Objekts wiedergeben und deren Rand den Mindestabstand von den Übergängen zwischen den Hell- und Dunkelbereichen des Beleuchtungsmusters aufweist, und durch Differenzbildung aus dem Hell- und dem Dunkelbild ein wenigstens teilweise korrigiertes Schichtbild zu erzeugen. Diese Variante hat den Vorteil, daß eine Glättung der Hell- und/oder Dunkelbilder einfach durchgeführt werden kann.

Bei einer anderen Variante des Verfahrens kann eine gerade Anzahl von Beleuchtungsmustern verwendet werden. Es können dann zunächst wenigstens teilweise falschlichtkorrigierte Bilder durch Bildung eines Differenzbildes aus erfaßten Bildern ermittelt werden, bei denen die jeweils verwendeten Beleuchtungsmuster zueinander komplementär sind, und aus den wenigstens teilweise falschlichtkorrigierten Bildern kann das Schichtbild ermittelt werden. Die Vorrichtung ist dann vorzugsweise so ausgebildet, daß eine gerade Anzahl von Beleuchtungsmustern verwendet wird, und die Auswerteeinrichtung ist dazu ausgebildet, zunächst wenigstens teilweise falschlichtkorrigierte Bilder durch Bildung eines Differenzbildes aus erfaßten Bildern zu ermitteln, bei denen die jeweils verwendeten Beleuchtungsmuster zueinander komplementär sind, und aus den wenigstens teilweise falschlichtkorrigierten Bildern das Schichtbild zu ermitteln. Diese Variante hat den Vorteil, daß ein Zusammenfügen von Teilsegmenten einfacher erfolgen kann. Unter einem Zusammenfügen wird dabei auch verstanden, daß sich die Segmente teilweise überlappen können. Das Zusammenfügen der Teilsegmente kann auch als Bildmontage aufgefaßt werden. Die Teilsegmente werden beim Zusammenfügen entsprechend der Anordnung der entsprechenden Bereiche auf dem Objekt relativ zueinander angeordnet. Das Zusammenfügen kann beispielsweise durch Addition der Bilder erfolgen.

Die Beleuchtungsmuster selbst können unterschiedliche Strukturen aufweisen, sofern die Dunkel- und Hellbereiche und die Teilsegmente die zuvor genannten Eigenschaften aufweisen. Beispielsweise können Beleuchtungsmuster mit radial verlaufenden Hell- und Dunkelbereichen verwendet werden, die jeweils durch Drehung eines entsprechenden Grundmusters um einen Mittelpunkt um einen vorgegebenen Winkel erzeugt werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sind jedoch die Beleuchtungsmuster bevorzugt durch ein Grundmuster gegeben, das relativ zu dem Objekt jeweils unterschiedlich versetzt ist. Die Vorrichtung ist dazu bevorzugt so ausgebildet, daß die Beleuchtungsmuster durch ein Grundmuster gegeben sind, das relativ zu dem Objekt jeweils unterschiedlich versetzt ist. Die Beleuchtungsmuster besitzen also die gleiche Struktur, sind aber in der Objektebene gegeneinander versetzt. Solche Beleuchtungsmuster sind einfach zu erzeugen. Darüber hinaus gestaltet sich die Auswertung der mit den Beleuchtungsmustern jeweils erzeugten Bilder besonders einfach.

Besonders bevorzugt wird bei dem Verfahren als Grundmuster ein periodisches Grundmuster verwendet, wobei die versetzten Grundmuster durch Verschiebung des Grundmusters relativ zu dem Objekt erhältlich sind. Die Vorrichtung ist dazu vorzugsweise so ausgebildet, daß das Grundmuster ein periodisches Grundmuster ist, wobei die versetzten Grundmuster durch Verschiebung des Grundmusters erhältlich sind. Insbesondere kann jeweilige Versatz von der Periode des Grundmusters abhängen. Diese Art der Beleuchtungsmuster erlaubt nicht nur eine besonders einfache Erzeugung, sondern auch eine einfache Auswertung der erfaßten Bilder.

Dabei ist es besonders bevorzugt, daß der Betrag der Verschiebung oder Verschiebungen und die Anzahl der Verschiebungen und damit der Beleuchtungsmuster so gewählt werden, daß eine Tiefenresponse-Funktion im Bereich einer Fokusebene, in die die Beleuchtungsmuster fokussiert sind, ein Plateau aufweist. Die Vorrichtung kann dazu besonders bevorzugt so ausgebildet sein, daß der Betrag der Verschiebung oder Verschiebungen und die Anzahl der Verschiebungen und damit der Beleuchtungsmuster so gewählt sind, daß eine Tiefenresponse-Funktion im Bereich einer Fokusebene, in die die Beleuchtungsmuster fokussiert sind, ein Plateau aufweist. Unter der Tiefenresponse-Funktion wird dabei die schon zuvor erwähnte Funktion verstanden. Unter einem Plateau wird dabei verstanden, daß diese Funktion in einem nicht nur punktförmigen Bereich der Fokusebene einen konstanten Wert annimmt. Vorzugsweise fällt sie von dem Plateau über steile Flanken auf einen Wert nahe Null vorzugsweise auf einen Wert von Null ab.

Der Versatz der Beleuchtungsmuster relativ zu dem Objekt kann auf verschiedene Art und Weise erzielt werden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Objekt gegenüber dem Beleuchtungsmuster verschoben. Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist dazu ein Antrieb, mit dem das Objekt oder ein Objektträger bewegbar ist, von der Auswerteeinrichtung so steuerbar, daß auf dem durch Bewegung versetzten Objekt ein von dem als strukturierte Blende wirkenden Element erzeugtes Grundmuster eines der Beleuchtungsmuster bildet, und daß mittels der Auswerteeinrichtung Bilder nach jeder Lageänderung des Objekts automatisch erfaßbar sind. Als Antriebe können vorzugsweise Piezoaktoren oder Exzenterantriebe zum Einsatz kommen, die eine sehr genaue Positionierung erlauben. Der Antrieb kann gegebenenfalls auch zur ohnehin notwendigen Positionierung des Objekts relativ zu der Optik genutzt werden. Vorzugsweise kann ein ohnehin vorhandener motorisch bewegbarer Mikroskoptisch verwendet werden. Die Bewegung durch den Antrieb kann dabei, je nach verwendeten Beleuchtungsmustern, in ein oder zwei Richtungen entlang der Objektebene möglich sein. Die Auswerteeinrichtung kann insbesondere dazu ausgebildet sein, eine Folge von Beleuchtungsmustern auf bzw. in dem Objekt durch Ansteuerung des Antriebs zu erzeugen, wobei nach Einstellen jeweils eines Beleuchtungsmusters ein Bild erfaßt wird. Damit wird für den Benutzer der Vorrichtung die Bedienung wesentlich vereinfacht. Darüber hinaus kann durch entsprechende Programmierung der Auswerteeinrichtung die durch das Verfahren notwendige Abhängigkeit zwischen der Art der Beleuchtungsmuster und notwendigen Verschiebungen automatisch berücksichtigt werden.

Um eine Bewegung des Objekts relativ zu dem Detektor zu vermeiden, kann zur vorbeschriebenen Variante alternativ bevorzugt das Grundmuster mittels einer mechanischen Vorrichtung verschoben werden. Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist bevorzugt das als strukturierte Blende wirkende Element eine Feldblende. Ein Antrieb, mit dem die Feldblende oder ein Teil der Feldblende bewegbar ist, ist von der Auswerteeinrichtung so steuerbar, daß die Beleuchtungsmuster auf das Objekt gestrahlt werden. Nach jeder Änderung des Beleuchtungsmusters werden mittels der Auswerteeinrichtung Bilder automatisch erfaßt. Unter Feldblende wird hierbei insbesondere eine Blende verstanden, die zur Bildung der strukturierten Beleuchtung starre, nichttransparente bzw. opake Elemente aufweist.

Alternativ zur Bewegung der Beleuchtungsmuster kann vorgesehen sein, daß das als strukturierte Blende wirkende Element eine Feldblende ist und zur Erzeugung der mindestens zwei Beleuchtungsstrukturen hinter der Feldblende ein bewegliches, lichtablenkendes Element angeordnet ist. Die Feldblende kann dabei fest positioniert sein. Als lichtablenkendes Element kann insbesondere eine spiegelnde Fläche oder eine transparente planparallele Platte verwendet werden, die je nach verwendeten Beleuchtungsmustern um eine Achse oder zwei orthogonale Achsen kippbar ist. Als Antriebe können vorzugsweise piezoelektrische Antriebe oder Exzenterantriebe verwendet werden. Um die Einstellung der Beleuchtungsmuster und die Erfassung der entsprechenden Bilder zu vereinfachen, ist ein Antrieb, mit dem das lichtablenkende Element bewegbar ist, von der Auswerteeinrichtung so steuerbar, daß die Beleuchtungsmuster auf das Objekt gestrahlt werden. Nach jeder Änderung des Beleuchtungsmusters mittels der Auswerteeinrichtung werden Bilder automatisch erfaßt. Diese Weiterbildung hat die zuvor im Zusammenhang mit der automatischen Ansteuerung genannten Vorteile.

In beiden Ausführungsformen weist die Feldblende transparente und opake Bereiche auf, die so ausgebildet sind, daß in der Objektebene die gewünschten Beleuchtungsmuster erhalten werden.

Soll die Verwendung von mechanischen Mitteln zur Verschiebung des Grundmusters vermieden werden, kann eine elektrisch steuerbare Modulationseinheit für Licht vorgesehen sein, die so angesteuert wird, daß die Beleuchtungsmuster erzeugt werden. Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann zum Beispiel das als Blende wirkende Element als eine solche elektronisch ansteuerbare Modulationseinheit ausgebildet sein. Als elektrische steuerbare Modulationseinheiten für Licht können beispielsweise sogenannte DMDs ("digital mirror devices") oder auch elektronisch ansteuerbare Durchlicht- oder Reflexions-Flüssigkristallfelder bzw. -LCDs zum Einsatz kommen. Wie zuvor ist vorzugsweise die Auswerteeinrichtung so steuerbar, daß die Beleuchtungsmuster auf den zu untersuchenden Bereich gestrahlt werden und nach jeder Änderung des Beleuchtungsmusters mittels der Auswerteeinrichtung Bilder automatisch erfaßbar sind. Diese Ausführungsform der Erfindung erlaubt es nicht nur, auf mechanische Antriebe zu verzichten, sondern gestattet auch einen einfachen Wechsel zwischen verschiedenen Beleuchtungsmustertypen.

Bei einer bevorzugten Variante des Verfahrens kann als Grundmuster ein periodische Streifenmuster mit Periode p verwendet werden, dessen sich periodisch abwechselnde Hell- und Dunkelstreifen gleich breit sind und aus dem die anderen Beleuchtungsmuster durch Verschiebung um das m/n-fache der Periode p quer zur Längsrichtung der Streifen erzeugbar sind, wobei n die Anzahl der Beleuchtungsmuster und 0 < m < n ist. Bei der Vorrichtung hat dazu die Feldblende vorzugsweise eine streifenförmige Struktur aus einander abwechselnden transparenten und opaken Bereichen gleicher Breite aufweist. Die Streifen erstrecken sich dabei vorzugsweise über den ganzen Untersuchungsbereich bzw. das ganze Objekt. Je mehr Beleuchtungsmuster genutzt werden, desto weniger Anregungslicht wird bei der Erfassung eines entsprechenden Bildes verwendet. Hierdurch kann das Intensitätsrauschen im Untergrund des resultierenden Bildes nahezu beliebig gesenkt werden. Die Dimensionen der transparenten und opaken Bereiche sind dabei so gewählt, daß Beleuchtungsmuster mit den zuvor genannten Parametern erzeugt werden können. Bei Verwendung einer elektrisch ansteuerbaren Modulationseinheit genügt zur Erzeugung dieser Beleuchtungsmuster eine entsprechende Ausbildung bzw. Programmierung der Auswerteeinrichtung.

Alternativ können Beleuchtungsmuster mit jeweils einer in zwei Richtungen periodischen Anordnung von Hell- und Dunkelbereichen verwendet werden, wobei die Anordnungen in wenigstens einer der Richtungen gegeneinander versetzt sind. Bei Verwendung einer mechanisch verschiebbaren Feldblende weist die Feldblende bevorzugt eine in zwei Richtungen periodische Anordnung von transparenten und opaken Bereichen auf, wobei die opaken Bereiche aneinander angrenzen. Bei Verwendung einer elektrisch ansteuerbaren Modulationseinheit genügt zur Erzeugung dieser Beleuchtungsmuster eine entsprechende Ausbildung bzw. Programmierung der Auswerteeinrichtung. Die Richtungen können zueinander orthogonal sein, jedoch braucht dies nicht unbedingt der Fall zu sein. Bei dieser Ausführungsform wird die Auszeichnung einer Richtung durch Verwendung von Streifen vermieden, sodaß die Unterdrückung von Falschlicht weniger richtungsabhängig wird. Darüber hinaus verschwindet die Modulation durch die strukturierte Beleuchtung schneller außerhalb der Fokusebene bzw. Objektebene, sodaß Licht außerhalb der Schärfentiefe der Abbildungsoptik besser unterdrückt wird.

Werden periodische Beleuchtungsmuster verwendet, ist es möglich, daß in dem von Falschlicht befreiten Bild noch durch die Periodizität der Beleuchtungsmuster bedingte Beleuchtungsinhomogenitäten vorhanden sind. Es ist daher bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, daß die falschlichtkorrigierten Bilder vor der Bildung Schichtbildes niederfrequent gefiltert werden. Bei der Vorrichtung ist dazu die Auswerteeinrichtung vorzugsweise so ausgebildet, daß die falschlichtkorrigierten Bilder vor der Bildung des Schichtbildes niederfrequent gefiltert werden.

Soll ein Objekt mit einer Dunkelfeldbeleuchtung untersucht werden, was insbesondere bei quantitativer Fluoreszenzmikroskopie wünschenswert sein kann, ist die Beleuchtungsoptik zur Abbildung des als Blende wirkenden Elements auf das Objekt für eine Dunkelfeldbeleuchtung ausgebildet.

Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung sollte dann die Beleuchtungsoptik als ein Beleuchtungsobjektiv mit kleiner Apertur ausgebildet sein, wobei die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs und die durch die Abbildungsoptik definierte optische Achse einen Winkel &agr; einschließen. Diese Ausbildung ergibt einen großen Schärfentiefebereich. Der Winkel &agr; soll vorzugsweise größer als 50° sein, um die Strahlungsintensität auf der Unterseite von transparenten Objekten bzw. Proben zu minimieren.

Vorzugsweise ist in diesem Fall die Beleuchtungsoptik eine Scheimpflugoptik. Dabei kann eine größere numerische Apertur für die Dunkelfeldbeleuchtung vorgesehen werden, da die Fokusebene der Beleuchtung an die Oberseite der Probe angepaßt werden kann.

Ferner kann die Abbildungsoptik zur Abbildung des Objekts auf den Detektor eine Scheimpflugoptik umfassen. In diesem Fall steht die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs senkrecht zur Oberfläche der Probe, während die optische Achse des Abbildungsobjektivs unter einem Winkel &agr; zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs steht.

Sowohl das Verfahren als auch die Vorrichtung, mit der dieses Verfahren durchführbar ist, können vorteilhaft zum Auslesen von Biochips, in der quantitativen Fluoreszenzmikroskopie und bei photometrischen Messungen angewendet werden.

Die Erfindung wird nachfolgend beispielhaft anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

1 eine schematische Darstellung eines optischen Aufbaus einer Vorrichtung zur Erfassung eines Bildes eines Objekts nach einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung,

2 eine schematische teilweise Darstellung einer Einrichtung zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern mit einer Feldblende mit Exzenterantrieb in der Vorrichtung aus 1,

3 vier mit der Feldblende der Vorrichtung aus 1 erhältliche Beleuchtungsmuster,

4 eine Darstellung von Gesamttiefenresponsefunktionen in der Näherung geometrischer Optik für ein Beleuchtungsmuster mit einer in einer Dimension gemäß einer Sinusfunktion variierenden Intensität und ein binäres Beleuchtungsmuster mit sich mit der Periode der Sinusfunktion wiederholenden Hell- und Dunkelstreifen,

5 eine Darstellung von Gesamttiefenresponsefunktionen in Fresnell'scher Näherung für die Beleuchtungsmuster in 4,

6 eine schematische teilweise Darstellung einer Einrichtung zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern bei einer Vorrichtung zur Erfassung eines Bildes eines Objekts nach einer sechsten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung,

7 ein in zwei Richtungen periodisches Schachbrettbeleuchtungsmuster bei der Vorrichtung bzw. einem Verfahren nach der sechsten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung,

8 eine Darstellung von Gesamttiefenresponsefunktionen in der Näherung geometrischer Optik für ein Beleuchtungsmuster mit einer in zwei Dimensionen gemäß einer Sinusfunktion variierenden Intensität und ein binäres Beleuchtungsmuster mit sich mit der Periode der Sinusfunktion wiederholenden sdchachbrettartig angeordneten quadratischen Hell- und Dunkelstreifen,

9 eine schematische teilweise Darstellung einer Einrichtung zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern bei einer Vorrichtung zur Erfassung eines Bildes eines Objekts nach einer siebten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung,

10 eine schematische Darstellung eines optischen Aufbaus einer Vorrichtung zur Erfassung eines Bildes eines Objekts nach einer achten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, und

11 eine schematische Darstellung eines optischen Aufbaus einer Vorrichtung zur Erfassung eines Bildes eines Objekts nach einer neunten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung Eine in 1 stark vereinfacht und schematisch gezeigte Vorrichtung zur Erzeugung eines Bildes einer Schicht eines Objekts nach einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt eine Beleuchtungseinrichtung 1, eine dieser nachgeordnete Einrichtung 2 zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern in einer Objektebene 3 eines auf einem Träger bzw. Tisch angeordneten Objekts 4, eine Abbildungsoptik 5 zur Abbildung des Objekts 4 auf eine Bildebene B und einen in der Bildebene angeordneten ortsauflösenden Detektor 6. Eine Auswerteeinrichtung 7 ist über eine Detektorverbindung mit dem Detektor 6 und über eine Steuerleitung mit der Einrichtung 2 verbunden.

Die Beleuchtungseinrichtung 1 verfügt über eine Licht- oder Strahlungsquelle 8, der ein Filter 9, ein Verschluß 10 und, nur optional, den Strahlengang homogenisierende optische Elemente 11, wie z.B. ein Lichtleitstab oder ein innen verspiegelter Glashohlstab, und erste Beleuchtungsoptiken 12 und 13 zur homogenen Ausleuchtung eines Bereichs einer Feldblendenebene 14 nachgeordnet sind.

Die Einrichtung 2 besitzt ein im Strahlengang der Beleuchtungseinrichtung 1 angeordnetes, durch diese homogen ausleuchtbares, als strukturierte Blende wirkendes, im Strahlengang in zwei zueinander orthogonalen Richtungen in der Feldblendenebene 14 definiert verschiebbar angeordnetes Element, im Beispiel eine strukturierte Feldblende 15, und einen in 1 nur schematisch gezeigten Antrieb 16, mit dem die Feldblende 15 verschiebbar ist.

Der mechanische Aufbau der Einrichtung 2 zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern ist in 2 genauer gezeigt. Exzenterantriebe 17 und 18 sind mit der Feldblende 15 so gekoppelt, daß dieses in der Feldblendenebene 14 in zwei zueinander orthogonalen Richtungen lateral verschoben und auf diese Weise definiert positioniert werden kann.

Die Feldblende 15 besitzt periodisch angeordnete, streifenförmige, opake Bereiche, die durch transparente Bereiche voneinander getrennt sind, so daß in der Objektebene 3 entsprechende streifenförmige Beleuchtungsmuster erzeugbar sind, wie weiter unten noch näher erläutert wird.

Wie weiter in 1 gezeigt, wird durch eine dem Element 15 nachgeordnete zweite Beleuchtungsoptik 19, die einen Beleuchtungstubus 20, einen Strahlenteiler 21 und ein Objektiv 22 umfaßt, die Feldblende 15 auf das zu untersuchende oder abzubildende Objekt 4 bzw. die Objektebene 3 abgebildet, so daß auf das Objekt 4 ein der Stellung der Feldblende 15 in der Feldblendenebene 14 und dessen Struktur entsprechendes Beleuchtungsmuster gestrahlt wird.

Die Abbildungsoptik 5, die eine Weitfeldoptik darstellt, umfaßt im Beispiel das Objektiv 22, den Strahlenteiler 21 sowie einen Abbildungstubus 23, und bildet das mit der jeweiligen Beleuchtungsstruktur beleuchtete Objekt 4 kontrastreich auf die Bildebene B bzw. den ortsauflösenden Detektor 6 für optische Strahlung ab.

Der Strahlenteiler 21 ist im Beispiel als Farbteiler ausgebildet und besitzt Filter 24 und 25, mit denen unerwünschte oder störende spektrale Strahlungsanteile ausgefiltert werden können. Der Strahlenteiler 21 und die Filter 24 und 25sind Bestandteile einer Vorrichtung für Auflichtfluoreszenz, wobei es vorteilhaft ist, wenn die Filter 25 und 26 um einige Winkelgrade schräg gestellt sind, um so störende Reflexe aus dem Strahlengang zu entfernen.

Der Detektor 6 umfaßt eine Matrix aus CCD- oder CMOS-Elementen und ist im Beispiel Bestandteil einer CCD- Kamera.

Der Detektor 6 ist mit der Auswerteeinrichtung 7 verbunden, welche Signale des Detektors 6 erfaßt, die Ermittlung bzw. Eliminierung des Falschlichtes bei der Abbildung des Objekts 4 durchführt und ein resultierendes Schichtbild erzeugt. Die Auswerteeinrichtung 7 verfügt hierzu über einen Prozessor, einen Speicher und entsprechende Schnittstellen. Die resultierenden Bilder können gespeichert und/oder über eine in 1 nicht gezeigte Anzeigevorrichtung oder einen Drucker ausgegeben werden.

Die Auswerteeinrichtung 7 dient weiterhin als Steuerung für den Antrieb 16, mit dem die von der strukturierten Feldblende 15 erzeugte Beleuchtungsstruktur verschiebbar ist. Die Auswerteeinrichtung 7 ist so ausgebildet, daß sie durch Ansteuerung des Antriebs 16 und des Verschlusses 10 eine Folge von Beleuchtungsmustern erzeugt und durch Erfassung der Signale des Detektors 6 eine Folge von jeweils den Beleuchtungsmustern entsprechenden Bildern des Untersuchungsbereichs bzw. des Objekts 4 erfaßt. Diese Bilder werden nach Erfassung des letzten Bildes der Folge in der Auswerteeinrichtung 7 verarbeitet.

Bei der Durchführung eines Verfahrens nach einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden vier der Struktur der Feldblende 15 entsprechende Beleuchtungsmuster verwendet, die in 3 genauer dargestellt sind.

Das erste Beleuchtungsmuster ist ein Grundmuster. Die anderen Beleuchtungsmuster gehen aus dem Grundmuster durch Verschiebung des Grundmusters um die Strecke v hervor. Das Grundmuster besitzt eine periodische Struktur der Periode p mit streifenförmigen Dunkelbereichen 26 der Breite d und jeweils zwischen den Dunkelbereichen 26 angeordneten streifenförmigen Hellbereichen 27, die dieselbe Breite h aufweisen wie die Dunkelbereiche 26.

Das Grundmuster wird in einer Richtung, die orthogonal zu der Längsrichtung der streifenförmigen Dunkelbereiche 26 bzw. Hellbereiche 27 ausgerichtet ist, dreimal um die Strecke v verschoben. Die Strecke v, um die die durch Verschiebung des Grundmusters entstandenen, aufeinanderfolgenden Beleuchtungsmuster gegeneinander versetzt sind, hat in diesem Beispiel die Länge von einem Viertel der Periode p. Bei Verwendung von N Beleuchtungsmustern statt der vier Beleuchtungsmuster in diesem Beispiel kann v insbesondere zu p/N gewählt sein.

Die Periode p liegt probenseitig vorzugsweise zwischen 1&mgr;m und 100&mgr;m.

Bei Überlagerung der vier Beleuchtungsmuster in der Objektebene 3 wird der Untersuchungsbereich bzw. das Objekt 4 vollständig durch die Dunkelbereiche 26 überdeckt. Bei Zusammenfügung der Dunkelbereiche 26 wird das Objekt 4 daher vollständig durch diese abgedeckt, so daß keine Interpolation zwischen den Dunkelbereichen 26 notwendig ist.

Entsprechendes gilt für die Hellbereiche 27.

Bei einem Verfahren zur Erzeugung eines Bildes einer Schicht des Objekts 4 mittels der Weitfeldoptik bzw. der Abbildungsoptik 5 auf den ortsauflösenden Detektor 6 nach einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Objekt 4 in der Objektebene 3 nacheinander mit den vier auf die Objektebene 3 fokussierten Beleuchtungsmustern beleuchtet, wozu die Auswerteeinrichtung 7 den Antrieb 16 und den Verschluß 10 entsprechend ansteuert. Für jedes der Beleuchtungsmuster wird mittels des Detektors 6 und der Auswerteeinrichtung 7 ein entsprechendes Bild automatisch erfaßt. Die erfaßten Bilder weisen gegebenenfalls in den Bereichen, in die die Dunkelbereiche 26 abgebildet werden, Aufhellungen durch Falschlicht auf, das aus mit Hellbereichen 27 beleuchteten Abschnitten des Objekts 4 abgegeben wird.

Aus den erfaßten Bildern wird dann in der Auswerteeinrichtung 7 ein Schichtbild des Objekts 4 erzeugt.

Dazu werden zunächst ein Hell- und ein Dunkelbild gebildet. Zur Erzeugung das Hell- bzw. Dunkelbild werden nur die Teilsegmente verwendet, die den Teilbereichen 37 bzw. 38 der Hell- bzw. Dunkelbereiche 27 bzw. 26 entsprechen, die jeweils in der Mitte der Hell- bzw. Dunkelbereiche liegende Streifen bilden. Diese Teilsegmente entsprechen in diesem Ausführungsbeispiel gerade den mittleren 50% der Bilder der Hell- bzw. Dunkelbereiche.

Das Hell- bzw. Dunkelbild entsteht dann durch Zusammenfügen dieser den Teilbereichen 37 und 38 entsprechenden Teilsegmente. Die Anordnung der Bereiche der erfaßten Bilder zueinander bzw. der Teilsegmente entspricht dabei der Anordnung der den Bereichen der erfaßten Bilder entsprechenden Hell- bzw. Dunkelbereiche der Beleuchtungsmuster auf dem Objekt 4.

Das Dunkelbild wird dann zur Rauschunterdrückung unter Verwendung eines entsprechenden Tiefpaßfilters rechnerisch von der Auswerteeinrichtung 7 geglättet.

Schließlich wird in der Auswerteeinrichtung 7 das Dunkelbild von dem Hellbild subtrahiert, wobei ein resultierendes Schichtbild des Objekts 4 entsteht, in dem Falschlicht unterdrückt ist, aber die Intensität in der Schicht mit hoher Genauigkeit erfaßt wird.

Mit diesem Verfahren wird erreicht, daß eine Gesamttiefenresponsefunktion, die für Punkte auf der optischen Achse die detektierte Intensität von optischer Strahlung, die von einem Ort auf der optischen Achse im Abstand z von der Objektebene ausgeht, als Funktion der eingestrahlten Intensität angibt, eine solche Form aufweist, daß eine konfokale Unterdrückung für weit von der Objektebene entfernten Ebenen erreicht und dabei Fluoreszenzstrahlung, die in einem bestimmten Tiefenbereich um die Fokusebene herum entsteht, mit voller Effizienz detektiert wird. Das bedeutet, daß die Gesamttiefenresponsefunktion in der Mitte ein Plateau mit dem Wert 1 bzw. nahezu 1 aufweist.

Die Gesamttiefenresponsefunktion für verschiedene strukturierte Beleuchtungen kann folgendermaßen berechnet oder abgeschätzt werden kann. Für den Fall, daß die Strukturen, die dabei auf das Objekt abgebildet werden, deutlich grober als die Auflösungsgrenze des optischen Systems, genauer der Abbildungsoptik 5 sind, kann diese Berechnung mit den Modellen der geometrischen Optik angenähert werden.

Die Modelle der geometrischen Optik können allgemein angewendet werden, wenn die Übertragungsfunktion des optischen Systems, die auch als PSF (Point Spread Function) bezeichnet wird, im Fokus durch eine Deltafunktion angenähert werden kann. In einem ersten Schritt soll davon ausgegangen werden, daß diese Bedingung erfüllt ist. Darüber hinaus wird angenommen, daß das Lichtwellenfeld in der Pupillenebene einem homogen ausgeleuchteten Kreis entspricht. Aus dem Verhältnis des Durchmessers des beleuchteten Feldes in der Pupille und der Brennweite der Abbildungsoptik 5 kann die numerische Apertur der Abbildungsoptik 5 berechnet werden. Die PSF als Funktion vom Abstand zur Fokusebene ergibt sich dann als Kreis, dessen Radius RPSF vom Abstand zur Fokusebene z, der Brennweite f der Abbildungsoptik 5 sowie dem Pupillenradius RPupille wie folgt abhängt:

Die Intensitätsverteilung, die in einer Ebene im Abstand z von der Objektebene entsteht, ergibt sich dann als Faltung der Beleuchtungsstruktur IStrukturBelucht mit der defokussierten PSF: IProbe(z) = PSF(z)⊗IStruktur.Beleucht.

Der Detektor 6 für das Fluoreszenzlicht steht in einer zu der Fokus- bzw. Objektebene konjugierten Ebene. Für die Intensität Idetektor in der Detektorebene ergibt sich damit: IDetektor = PSF(z)⊗(PSF(z)⊗IStruktur.Beleucht).

Insofern kann PSF(z) als Tiefenresponsefunktion verstanden werden. Da in diesem Beispiel die Abbildungsoptik 5 gleichzeitig zur Beleuchtung genutzt wird, ergibt sich die Gesamttiefenresponsefunktion durch zweimalige Anwendung von PSF(z).

Mit der so bestimmten Intensitätsverteilung auf dem Detektor als Funktion der Defokussierung z kann nun die Gesamttiefenresponsefunktion bestimmt werden.

Bei dem im Stand der Technik beschriebenen Verfahren, wird eine sinusförmige Intensitätsverteilung auf die Oberfläche projiziert und die Modulation auf dem Detektor gemessen. Das heißt, daß gilt Istruktur.Beleucht. = 1 + sin(&ohgr;xx), wobei &ohgr;x die Ortsfrequenz in einer Ebene orthogonal zu der Richtung der optischen Achse der Abbildungsoptik 5 bzw. der Strahlrichtung oder der z-Achse und x einen Ort in der Ebene bezeichnen.

Diese Intensitätsverteilung wird zwei mal mit einem Kreis, mit von der Tiefe z abhängenden Radius, gefaltet. Die Fouriertransformierte der PSF(z) entspricht daher einer modifizierten Besselfunktion. Das Quadrat dieser Funktion ist als Airyfunktion bekannt. Die Beleuchtungsfunktion ergibt drei Peaks bei Null, +&ohgr;x und –&ohgr;x. Multipliziert man diese Funktion mit der Airyfunktion, so ergeben sich auch nur an diesen drei Stellen von Null verschiedene Werte. Durch das Verfahren der strukturierten Beleuchtung wird nur die Modulation der Intensitätsverteilung gemessen. Durch die zwei Peaks bei +&ohgr;x und –&ohgr;x werden daher nur zwei Werte aus der Airyfunktion herausgeschnitten. Variiert man jetzt die Tiefe z so ergeben sich Airyfunktionen mit verschiedenen Maßstäben aus denen die Fouriertransformierte der Beleuchtungsfunktion jeweils nur die Werte bei +&ohgr;x und –&ohgr;x ausschneidet. Zusammenfassend kann man deshalb sagen, das im Modell der geometrischen Optik die Gesamttiefenresponsefunktion bei der Beleuchtung mit einer sinusförmigen Intensitätsverteilung und den oben beschriebenen Auswertealgorithmen einer Airyfunktion entspricht.

Betrachtet man einen klassischen konfokalen Punktscanner mit den Modellen der geometrischen Optik so ergibt sich eine Gesamttiefenresponsefunktion von (vgl. die gestrichelte Kurve in 4):

Eine genaue wellenoptische Beschreibung ergibt: Tresponse(z) = sinc2(az), wobei a ein Proportionalitätsfaktor ist (vgl. die gestrichelte Kurve in 5).

Auch hier fällt die Gesamttiefenresponsefunktion in unmittelbarer Nähe zum Fokuspunkt ab.

Das erfindungsgemäße Verfahren führt dagegen zu einer Gesamttiefenresponsefunktion, die ein Plateau mit dem Wert 1 in unmittelbarer Fokusnähe, d.h. in unmittelbarer Nähe der Objektebene aufweist.

Das Grundprinzip für die Veränderung der Gesamttiefenresponsefunktion kann folgendermaßen plausibiliert: Beleuchtet man die Probe mit Rechteckstreifengittern und verwendet das dargestellte Verfahren um die vier Bilder zu verarbeiten, so ist gewährleistet, daß alle Objektpunkte mindestens einen Viertelstreifen von der Kante zwischen hellen und dunklen Streifen entfernt sind. Unter der Annahme, daß die Übertragungsfunktion PSF(z) einem Kreis mit von der Defokussierung z abhängendem Radius entspricht, folgt, daß die Information über eine benachbarte Streifenkante erst dann in einen Objektpunkt gelangt, wenn die Defokussierung so groß wird, daß der Radius des Zerstreuungskreises dem Abstand zur Streifenkante entspricht. Dieser Abstand variiert für die Objektpunkte je nach ihrer Lage zwischen einem Viertel und der Hälfte der Streifenbreite. Man hat deshalb bei Verwendung der vereinfachten Modelle der geometrischen Optik in der Gesamttiefenresponsefunktion ein Plateau mit dem Wert 1, das eine von der Lage in der Probe abhängende Breite Z hat. Die minimale Breite Z berechnet sich nach:

Die maximale Plateaubreite beträgt für die Punkte in der Mitte der Streifen gerade 2Z. Verwendet man mehr als vier Aufnahmen, so kann die minimale Plateaubreite (in 5 die durchgezogene Linie) weiter erhöht werden und erreicht theoretisch für unendlich viele Messungen die maximale Plateaubreite 2Z (lang gestrichelte Linie in 5).

Diese sehr einfache Erklärung kann in Fresnelnäherung wellenoptisch nachgerechnet werden. Die Ergebnisse die dabei zu erwarten sind, können in drei Fälle unterschieden werden:

  • 1. Die Beleuchtungsstrukturen sind wesentlich größer als die optische Auflösung des Systems. In diesem Fall werden geometrische und wellenoptische Beschreibung die gleichen Ergebnisse liefern.
  • 2. Die Beleuchtungsstrukturen sind nicht wesentlich größer als die Auflösungsgrenze. In diesem Fall muß eine wellenoptische Rechnung für die Gesamttiefenresponsefunktion angewendet werden. Je nach der Größe der Strukturen wird das Plateau der Gesamttiefenresponsefunktion „abgerundet". Dadurch wird die effektiv nutzbare Plateaubreite verringert.
  • 3. Die Größe der Beleuchtungsstrukturen liegt in der Nähe der Auflösungsgrenze. In diesem Fall wird nur noch die erste Frequenzkomponente des Beleuchtungsgitters vom optischen System übertragen. In diesem Fall wird kein Plateau in der Gesamttiefenresponsefunktion auftreten. Die Gesamttiefenresponsefunktion wird in diesem Fall im wesentlichen der Gesamttiefenresponsefunktion in geometrischer Näherung für sinusförmige Streifenbeleuchtung entsprechen.

Der zweite Fall kann wellenoptisch mit den Modellen der paraxialen Fresnellnäherung simuliert werden. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Darin sind das Resultat für eine sinusförmige Beleuchtungsstruktur durch eine gestrichelte Linie und das Resultat für die oben genannte Streifenstruktur gleicher Periode gezeigt. Die Übertragungsfunktion PSF wurde für diesen Fall in der Nähe des Fokuspunktes wellenoptisch berechnet und gemäß der Gleichung für IDetektor mit sich selbst und mit dem binären Streifenmuster gefaltet. 5 zeigt den erhaltenen Signalverlauf. In dieser Figur sind Gesamttiefenresponsefunktionen für sinusförmige und binäre Beleuchtungsstrukturen, dargestellt durch gestrichelte bzw. durchgezogene Linien, in Abhängigkeit von der Lage von Punkten auf der optischen Achse bzw. z-Achse dargestellt, wobei der Nullpunkt der Fokusebene entspricht. Man erkennt im Vergleich mit 4, daß das Plateau der Gesamttiefenresponsefunktion deutlich abgerundet ist.

Um die strukturierte Beleuchtung in Form eines Beleuchtungsgitters für eine bestimmte Meßaufgabe zu optimieren, braucht bei ansonsten unveränderten Auswerteverfahren nur die Frequenz des Beleuchtungsgitters variiert zu werden. Diese Variation zieht zwei Effekte nach sich. Zum einen wird die konfokale Unterdrückung von Licht aus Nichtfokusebenen um so schlechter, je größer die Gitterperiode des Beleuchtungsgitters wird. Dabei skaliert im wesentlichen die Gesamttiefenresponsefunktion und damit das Maß der konfokalen Unterdrückung mit der Gitterfrequenz. Zum zweiten skaliert auch die Breite des Plateaus in der Gesamttiefenresponsefunktion und damit der Tiefenbereich der Probe, der mit der Intensitätseffizienz 1 auf den Detektor abgebildet wird mit der Frequenz des Beleuchtungsgitters. Diese einfache lineare Abhängigkeit der konfokalen Unterdrückung/Plateaubreite mit der Gitterfrequenz des Beleuchtungsgitters gilt aber nur für Gitterwellenlängen, die deutlich größer als die Auflösungsgrenze des optischen Systems sind.

Ist diese Bedingung nicht erfüllt, so muß die Gesamttiefenresponsefunktion für jede Gitterfrequenz separat wellenoptisch berechnet werden. Auf diesen Daten kann dann eine Optimierung der Gitterfrequenz für verschiedene Meßaufgaben erfolgen.

Ein zweites Ausführungsbeispiel unterscheidet sich von dem ersten Ausführungsbeispiel allein dadurch, daß die Erzeugung des Schichtbildes modifiziert und dazu die Auswerteeinrichtung entsprechend modifiziert ist. Alle Erläuterungen zu den unveränderten Teilen des ersten Ausführungsbeispiels gelten daher auch hier und es werden die gleichen Bezugszeichen verwendet.

Es werden nun durch Subtraktion des ersten Bildes von dem dritten Bild und des zweiten Bildes von dem vierten Bild zwei temporäre Bilder erzeugt, in denen so eine wenigstens teilweise Falschlichtkorrektur vorgenommen wurde.

Aus dem ersten temporären Bild wird dann die den Teilbereichen 37 und aus dem zweiten temporären Bild die den Teilbereichen 38 entsprechenden Teilsegmente zu dem Schichtbild zusammengefügt.

Ein drittes und ein viertes Ausführungsbeispiel unterscheiden sich von dem ersten bzw. zweiten Ausführungsbeispiel dadurch, daß aus den Bildern der Hell- bzw. Dunkelbereiche als Teilsegmenten entsprechende Teilbereiche 37 bzw. 38 nun nicht die Mittelstreifen der Breite p/2, sondern solche der Breite 3/4p verwendet werden, so daß sich die Teilsegmente überlappen. Da sich die Teilsegmente überlappen, entstehen bei der Summation in den Überlappungsbereichen Intensitätsüberhöhungen, die durch Referenzierung bzw. Renormierung beseitigt werden.

Die anderen Schritte erfolgen wie in dem ersten bzw. zweiten Ausführungsbeispiel.

Bei einer fünften bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird die Feldblende 15 nicht bewegt, sondern das Objekt 4. Hierzu kann ein Tisch verwendet werden, auf welchem das Objekt angeordnet ist und der mittels eines von der Auswerteeinrichtung 7 gesteuerten Antriebs in Richtungen parallel zu der Objektebene 3 bewegbar ist. Die Auswertung der erfaßten Bilder erfolgt analog zu dem ersten Ausführungsbeispiel. Zur Positionierung des Objekts 4 in der Objektebene 3 sind als Antriebe Piezoaktoren, Exzenterantriebe oder andere geeignete Verstellmechanismen einsetzbar, vorzugsweise aber ein motorisierter Mikroskoptisch. Entsprechend können die zweiten bis vierten Ausführungsbeispiele modifiziert werden.

Eine Vorrichtung nach einer sechsten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich von der Vorrichtung des ersten Ausführungsbeispiels dadurch, daß eine modifizierte Einrichtung 28, prinzipiell dargestellt in 6, zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern und eine entsprechend modifizierte Auswerteeinrichtung verwendet werden. Da die anderen Komponenten im wesentlichen unverändert sind, werden für diese die gleichen Bezugszeichen verwendet und es gelten die Erläuterungen zu dem ersten Ausführungsbeispiel entsprechend.

Die teilweise in 6 gezeigte Einrichtung 28 besitzt nun als als strukturierte Blende wirkendes Element eine in der Feldblendenebene 14 angeordnete Feldblende 29 mit einer Schachbrettstruktur, die in zwei zueinander orthogonalen Richtungen periodisch mit gleicher Periode ausgebildete transparente und opake quadratische Bereiche aufweist (vgl. 7). Zur Erzeugung unterschiedlicher Beleuchtungsstrukturen verfügt die Einrichtung 28, wie in 6 schematisch dargestellt, über eine der strukturierten Feldblende 29 in Lichtrichtung nachgeordnete, planparallele Glasplatte 30, die um zwei zueinander orthogonale Achsen kippbar ist. Zur gesteuerten, definierten Kippung dieser Glasplatte 30 sind als Antrieb 31 in vorteilhafter Weise Piezoaktoren 32 vorgesehen, welche durch eine Steuerung der nicht dargestellten Auswerteeinrichtung entsprechend angesteuert werden. Durch die Kippung der Glasplatte 30 erfolgt bekanntermaßen ein optischer Strahlenversatz des Strahlenganges und damit eine versetzte Abbildung der Feldblende 29 auf das Objekt 4. Die in der 7 eingezeichneten Pfeile kennzeichnen die Kipprichtungen der Glasplatte 30.

Zur Erzeugung des Strahlenversatzes können auch andere geeignete Elemente eingesetzt werden. Als Antriebe für die Glasplatte 30 können bei einer anderen Ausführungsform auch Exzenterantriebe oder andere geeignete Antriebsmechanismen vorgesehen werden.

Bei Abbildung der Feldblende 29 in die Objektebene 3 ergibt sich ein in 7 dargestelltes Grundmuster mit in zwei zueinander orthogonalen Richtungen periodisch angeordneten quadratischen Hellbereichen 33 und Dunkelbereichen 34, die ein Schachbrettmuster bilden. Das Grundmuster weist in der ersten, im Folgenden durch die Ziffer 1 gekennzeichneten Richtung eine Periode p1 und in der zweiten, im Folgenden durch Ziffer 2 gekennzeichneten Richtung die Periode p2 auf, wobei in diesem Ausführungsbeispiel die Perioden gleichgroß gewählt sind.

Zur Erzeugung der in diesem Beispiel sechzehn Beleuchtungsmuster wird das Grundmuster, das selbst ein erstes Beleuchtungsmuster darstellt, zunächst dreimal nacheinander um die Strecke v1 in der Richtung 1, d.h. parallel zu der in 7 horizontalen Seite der Hellbereiche 33, verschoben, wobei ein zweites, drittes und viertes Beleuchtungsmuster entstehen. Zur Erzeugung eines fünften Beleuchtungsmusters erfolgt dann eine Verschiebung um die Strecke v2 in einer Richtung 2 orthogonal zu der Richtung der ersten Verschiebung, d.h. parallel zu der in 7 vertikalen Seite der Hellbereiche. Danach werden drei weitere Beleuchtungsmuster durch Verschiebung um jeweils die Strecke v1 in Richtung der ersten Verschiebungen erzeugt. Es erfolgen dann weitere Verschiebungen um v2, danach dreimal um v1, wiederum um v2 und danach dreimal um v1.

Die Perioden p1 und p2 liegen in der Objektebene vorzugsweise im Bereich zwischen 1&mgr;m und 100&mgr;m. Sie können in anderen Ausführungsbeispielen verschieden groß gewählt sein.

Bei Überlagerung der sechzehn Beleuchtungsmuster decken deren Hellbereiche 33 das Objekt 4 in der Objektebene 3 vollständig ab. Entsprechendes gilt für die Dunkelbereiche 34.

Das Verfahren zur Abbildung des Objekts 4 nach der sechsten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt analog zu dem ersten Ausführungsbeispiel. Die Teilsegmente entsprechen nun jeweils quadratisch Bereichen 37 bzw. 38 in einem Quadrat des Schachbrettmusters, dessen Rand von dem jeweiligen Rand des Hell- bzw. Dunkelbereichs einen Abstand von einem Viertel der Seitenlänge des Hell- bzw. Dunkelbereichs aufweist.

Das Verfahren hat gegenüber dem Verfahren des ersten Ausführungsbeispiels, d.h. der Verwendung von Beleuchtungsmustern mit Streifen, den Vorteil, daß die Modulation durch die strukturierte Beleuchtung schneller außerhalb der Fokusebene bzw. Objektebene verschwindet, so daß Licht außerhalb der Schärfentiefe der Abbildungsoptik besser unterdrückt wird.

In der 8 ist beispielhaft die Gesamttiefenresponsefunktion in der Näherung geometrischer Optik für das binäre Beleuchtungsmuster mit schachbrettmusterförmiger Intensitätsverteilung (durchgezogene Linie) und für ein Beleuchtungsmuster mit in zwei Dimensionen sinusförmiger Intensitätsverteilung (gestrichelte Linie) gezeigt. Wie in 4 und 5 beschreibt die Abszisse den Abstand von der Fokusebene in skalierten, beliebigen Einheiten und die Ordinate den jeweiligen Wert der Gesamttiefenresponsefunktion ebenfalls in beliebig skalierten Einheiten. Danach wird eine bessere Annäherung an ein kastenförmiges Profil erreicht.

Eine Vorrichtung zur Erfassung eines Bildes eines Objekts nach einer siebten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich von der Vorrichtung des ersten Ausführungsbeispiels durch einen anderen Antrieb für die Feldblende 15. Alle anderen Komponenten sind unverändert, sodaß für diese die gleichen Bezugszeichen verwendet werden und die Erläuterungen im Zusammenhang mit dem ersten Ausführungsbeispiel gemäß 1 entsprechend gelten.

9 zeigt eine schematische teilweise Darstellung der veränderten Einrichtung zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern. Der von der Steuerung in der Auswerteeinrichtung gesteuerte Antrieb umfaßt Piezoaktoren 35 und 36, welche mit der Feldblende 15 gekoppelt sind, so daß die Feldblende 15 mittels der Piezoaktoren 35 und 36 definiert durch laterale Verschiebung längs zweier zueinander orthogonaler Richtungen in der Feldblendenebene 14 verstellt werden kann. Durch die Abbildung der in unterschiedlichen Positionen eingestellten Feldblende 15 auf das Objekt 4 werden wie zuvor unterschiedliche Beleuchtungsstrukturen in der Objektebene 3 erzeugt, welche dann zusammen mit dem Objekt 3 auf den Detektor 6 abgebildet werden.

Eine achte bevorzugte Ausführungsform der Erfindung unterscheidet sich von den bisher beschriebenen Ausführungsbeispielen dadurch, daß die Einrichtung zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern nun weder eine Feldblende noch einen Antrieb, sondern statt dessen als als strukturierte Blende wirkendes Element eine in der Feldblendenebene 14 angeordnete elektrisch steuerbare Modulationseinheit 45 in Form eines Durchlicht-LCD besitzt. Wie in 10 schematisch dargestellt ist die Modulationseinheit 45 über eine Steuerleitung mit einer Auswerteeinrichtung 46 verbunden, die gegenüber der Auswerteeinrichtung 7 des ersten Ausführungsbeispiels dahingehend verändert ist, daß in der Auswerteeinrichtung gespeicherte Hell-Dunkel-Muster auf dem Durchlicht-LCD dargestellt werden, sodaß auf die Objektebene 3 entsprechende Beleuchtungsmuster gestrahlt werden.

Eine Vorrichtung nach einer neunten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, deren optischer Gesamtaufbau schematisch vereinfacht in 11 gezeigt ist, unterscheidet sich von der Vorrichtung des ersten Ausführungsbeispiels dadurch, daß das als Blende wirkende Element zur Dunkelfeldbeleuchtung scharf auf das Objekt abbildbar ist. Hierzu ist die zweite Beleuchtungsoptik 19 durch eine modifizierte zweite Beleuchtungsoptik 40 ersetzt, der Strahlenteiler 21 ist nicht mehr notwendig. Für Komponenten, die gegenüber dem ersten Ausführungsbeispiel im Wesentlichen unverändert sind, gelten die Ausführungen des ersten Ausführungsbeispiels entsprechend und es werden die gleichen Bezugszeichen verwendet.

Die Vorrichtung umfaßt die Beleuchtungseinrichtung 1 mit der Licht- oder Strahlungsquelle 8, der optional der Verschluß 10 und, vorteilhaft, den Strahlengang homogenisierende optische Elemente 11, wie z.B. ein Lichtleitstab oder ein innen verspiegelter Glashohlstab, und Beleuchtungsoptiken 12 und 13 zur homogenen Ausleuchtung einer in der Feldblendenebene 14 im Strahlengang angeordneten Einrichtung 2 zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern, die im Beispiel die strukturierte Feldblende 15 umfaßt, nachgeordnet sind. Diese Feldblende 15 ist im Strahlengang in zwei zueinander orthogonalen Richtungen der Feldblendenebene 14 definiert positionierbar angeordnet. Sie kann also mittels des mit der Feldblende 15 gekoppelten Antriebs 16 in dieser Ebene 14 verschoben werden.

Durch die der Feldblende 15 nachgeordnete modifizierte zweite Beleuchtungsoptik 40, die im Beispiel einen Beleuchtungstubus 41, einen Ablenkspiegel 42, einen Anregungsfilter 43, und ein Objektiv 44, wird das als strukturierte Blende wirkende Element, d.h. hier die strukturierte Feldblende 15, in Dunkelfeldbeleuchtung auf das zu untersuchende oder zu messende Objekt 4 bzw. die Objektebene 3 abgebildet. Die zweite Beleuchtungsoptik 40 bildet eine sogenannte Scheimpflugoptik, deren optische Achse unter einem Winkel &agr; zur senkrecht zur Oberfläche des Objekts 4 bzw. der Objektebene 3 verlaufenden optischen Achse der Abbildungsoptik 5 angeordnet ist. Vorteilhaft ist der Winkel &agr; > 50°. Durch diese Abbildungsoptik 5, die beispielsweise das Objektiv 22, den Filter 25 sowie den Abbildungstubus 23 umfaßt, wird das Objekt 4 kontrastreich zusammen mit der ihr überlagerten Beleuchtungsstruktur auf den ortsauflösenden Detektor 6 für optische Strahlung abgebildet.

In analoger Weise kann jedoch auch bei einer modifizierten Ausführungsform die Abbildungsoptik als eine Scheimpflugoptik ausgebildet sein. In diesem Fall steht die optische Achse der zweiten Beleuchtungsoptik 40 senkrecht auf der Oberfläche des Objekts 4 bzw. der Objektebene 3. Mit dieser optischen Achse bildet dann die optische Achse der Abbildungsoptik den Winkel &agr;.

1
Beleuchtungseinrichtung
2
Einrichtung zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern
3
Objektebene
4
Objekt
5
Abbildungsoptik
6
Detektor
7
Auswerteeinrichtung
8
Strahlungsquelle
9
Filter
10
Verschluß
11
homogenisierendes optisches Element
12, 13
erste Beleuchtungsoptiken
14
Feldblendenebene
15
Feldblende
16
Antrieb
17, 18
Exzenterantrieb
19
zweite Beleuchtungsoptik
20
Beleuchtungstubus
21
Strahlenteiler
22
Objektiv
23
Abbildungstubus
24, 25
Filter
26
Dunkelbereiche
27
Hellbereiche
28
Einrichtung zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern
29
Feldblende
30
Glasplatte
31
Antrieb
32
Piezoaktoren
33
Hellbereiche
34
Dunkelbereiche
35
Piezoaktor
36
Piezoaktor
37
Teilbereiche
38
Teilbereiche
39
Zellen
40
zweite Beleuchtungsoptik
41
Beleuchtungstubus
42
Ablenkspiegel
43
Anregungsfilter
44
Objektiv
45
Modulationseinheit
46
Auswerteeinrichtung


Anspruch[de]
Verfahren zur Erzeugung eines Bildes einer Schicht eines Objekts (4) mittels einer Weitfeldoptik (5) auf einem ortsauflösenden Detektor (6), bei dem

– das Objekt (4) in wenigstens einer Objektebene (3) mit wenigstens zwei binären Beleuchtungsmustern (26, 27; 33, 34) fokussiert beleuchtet wird und für jedes der Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) entsprechende Bilder erfaßt werden, wobei die Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) jeweils Dunkelbereiche (27; 34) und Hellbereiche (26; 33) aufweisen, von denen die Hellbereiche und/oder die Dunkelbereiche bei Überlagerung der Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) das Objekt (4) vollständig überdecken, und

– aus den erfaßten Bildern ein Schichtbild ermittelt wird, das Teilsegmente umfaßt, die jeweils einen Teilbereich des Objekts (4) wiedergeben, der so innerhalb eines Hellbereichs wenigstens eines der verwendeten Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) liegt, daß dessen Ränder von den Rändern des Hellbereichs um wenigstens einen vorgegebenen Mindestabstand beabstandet sind, und die jeweils unter wenigstens teilweiser Falschlichtkorrektur unter Verwendung von wenigstens zwei Bildern ermittelt sind, die bei jeweils verschiedenen Beleuchtungsmustern (26, 27; 33, 34) erfaßt wurden, in denen der dem jeweiligen Teilsegment entsprechende Teilbereich ganz innerhalb eines Hellbereichs eines ersten der verschiedenen Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) bzw. ganz innerhalb eines Dunkelbereichs eines zweiten der verschiedenen Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Teilsegmente lückenlos aneinander anschließen oder sich überlappen. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Teilsegmente sich weniger als 10% der minimalen Ausdehnung überlappen. Verfahren einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Mindestabstand größer als 1/5 des geringsten Abstands benachbarter Grenzen ist. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem, zur Ermittlung des Schichtbildes zunächst aus den erfaßten Bildern ein Hell- und ein Dunkelbild gebildet werden, wobei jeweils Bereiche des Objekts (4) wiedergebende Teilsegmente der erfaßten Bilder verwendet werden, die in einem Hell- bzw. Dunkelbereich eines bei der Erfassung des jeweiligen Bildes verwendeten Beleuchtungsmusters (26, 27; 33, 34) liegenden Bereich (37, 38) des Objekts (4) wiedergeben und deren Rand den Mindestabstand von den Übergängen zwischen den Hell- und Dunkelbereichen des Beleuchtungsmusters (26, 27; 33, 34) aufweist,

– und durch Differenzbildung aus dem Hell- und dem Dunkelbild ein wenigstens teilweise korrigiertes Schichtbild erzeugt wird.
Verfahren nach einem 1 bis 5, bei dem eine gerade Anzahl von Beleuchtungsmustern (26, 27; 33, 34) verwendet wird, und zunächst wenigstens teilweise falschlichtkorrigierte Bilder durch Bildung eines Differenzbildes aus erfaßten Bildern ermittelt werden, bei denen die jeweils verwendeten Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) zueinander komplementär sind, und aus den wenigstens teilweise falschlichtkorrigierten Bildern das Schichtbild ermittelt wird. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) durch ein Grundmuster gegeben, das relativ zu dem Objekt (4) jeweils unterschiedlich versetzt ist. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem als Grundmuster ein periodisches Grundmuster verwendet, wobei die versetzten Grundmuster durch Verschiebung des Grundmusters relativ zu dem Objekt (4) erhältlich sind. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der Betrag der Verschiebung oder Verschiebungen und die Anzahl der Verschiebungen und damit der Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) so gewählt werden, daß eine Tiefenresponse-Funktion im Bereich einer Fokusebene, in die die Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) fokussiert sind, ein Plateau aufweist. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, bei dem das Objekt (4) gegenüber dem Grundmuster (26, 27) verschoben wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, bei dem das Grundmuster (26, 27; 33, 34) mittels einer mechanischen Vorrichtung (15, 9; 15, 16; 15, 31) verschoben wird. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem eine elektrisch steuerbare Modulationseinheit (45) für Licht so angesteuert wird, daß die Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) erzeugt werden. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11 oder nach einem der Ansprüche 7 bis 11 und Anspruch 12, bei dem als Grundmuster ein periodisches Streifenmuster mit Periode p verwendet wird, dessen sich periodisch abwechselnde Hell- und Dunkelstreifen gleich breit sind und aus dem die anderen Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) durch Verschiebung das m/n-fache der Periode p quer zur Längsrichtung der Streifen erzeugbar sind, wobei 0 < m < n ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11 oder nach einem der Ansprüche 7 bis 11 und Anspruch 12, bei dem Beleuchtungsmuster (33, 34) mit jeweils einer in zwei Richtungen periodischen Anordnung von Hell- und Dunkelbereichen (33, 34) verwendet werden, wobei die Anordnungen in wenigstens einer der Richtungen gegeneinander versetzt sind. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem Hell- und/oder Dunkelbilder niederfrequent gefiltert werden. Vorrichtung zur Erzeugung eines Bildes einer Schicht eines Objekts (4), mit

– einer Beleuchtungseinrichtung (1) zur fokussierten Beleuchtung des Objekts (4) in einer Objektebene (3),

– einer Einrichtung (2; 28; 45) zur Erzeugung wenigstens zweier vorgegebener Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) zur Beleuchtung des Objekts (4) in der Objektebene (3) mit einem im Strahlengang nach der Beleuchtungseinrichtung (1) angeordneten als strukturierte Blende wirkenden Element, wobei die Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) jeweils Dunkelbereiche (27; 34) und Hellbereiche (26; 33) aufweisen, von denen die Hellbereiche und/oder die Dunkelbereiche bei Überlagerung der Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) das Objekt (4) vollständig überdecken,

– einer, vorzugsweise als Weitfeldoptik ausgebildeten Abbildungsoptik (5) zur Abbildung der Objektebene (3) auf eine Bildebene (B),

– einem in der Bildebene (B) angeordneten ortsauflösenden Detektor (6) zur Detektion der von dem Objekt (4) ausgehenden optischen Strahlung, und

– einer Auswerteeinrichtung (7, 46) zur Auswertung von Detektionssignalen des Detektors (6), die dazu ausgebildet ist, auf der Basis der Detektionssignale Bilder zu erfassen und die der Bilderfassung folgenden Schritte eines Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche auszuführen und insbesondere aus den erfaßten Bildern ein Schichtbild zu ermitteln, das Teilsegmente umfaßt, die jeweils einen Teilbereich des Objekts (4) wiedergeben, der so innerhalb eines Hellbereichs eines der verwendeten Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) liegt, daß dessen Ränder von den Rändern des Hellbereichs um wenigstens einen vorgegebenen Mindestabstand beabstandet sind, und die jeweils unter wenigstens teilweiser Falschlichtkorrektur unter Verwendung von wenigstens zwei Bildern ermittelt sind, die bei jeweils verschiedenen Beleuchtungsmustern (26, 27; 33, 34) erfaßt wurden, in denen der dem jeweiligen Teilsegment entsprechende Teilbereich ganz innerhalb eines Hellbereichs eines ersten der verschiedenen Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) bzw. ganz innerhalb eines Dunkelbereichs eines zweiten der verschiedenen Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) liegt.
Vorrichtung nach Anspruch 16, die so ausgebildet ist, daß die Teilsegmente lückenlos aneinander anschließen oder sich überlappen. Vorrichtung nach Anspruch 17, die so ausgebildet ist, daß die Teilsegmente sich weniger als 10% der minimalen Ausdehnung überlappen. Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, die so ausgebildet ist, daß die Mindestabstände größer als 1/5 des geringsten Abstands benachbarter Grenzen eines Hell- oder Dunkelbereichs sind. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, bei der die Auswerteeinrichtung dazu ausgebildet ist, zur Ermittlung des Schichtbildes zunächst aus den erfaßten Bildern ein Hell- und ein Dunkelbild zu bilden, wobei jeweils Bereiche des Objekts (4) wiedergebende Teilsegmente der erfaßten Bilder verwendet werden, die in einem Hell- bzw. Dunkelbereich eines bei der Erfassung des jeweiligen Bildes verwendeten Beleuchtungsmusters (26, 27; 33, 34) liegenden Bereich des Objekts (4) wiedergeben und deren Rand den Mindestabstand von den Übergängen zwischen den Hell- und Dunkelbereichen des Beleuchtungsmusters (26, 27; 33, 34) aufweist, und durch Differenzbildung aus dem Hell- und dem Dunkelbild ein wenigstens teilweise korrigiertes Schichtbild zu erzeugen. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, die so ausgebildet ist, daß eine gerade Anzahl von Beleuchtungsmustern (26, 27; 33, 34) verwendet wird, und bei der die Auswerteeinrichtung dazu ausgebildet ist, zunächst wenigstens teilweise falschlichtkorrigierte Bilder durch Bildung eines Differenzbildes aus erfaßten Bildern zu ermitteln, bei denen die jeweils verwendeten Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) zueinander komplementär sind, und aus den wenigstens teilweise falschlichtkorrigierten Bildern das Schichtbild zu ermitteln. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 21, die so ausgebildet ist, daß die Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) durch ein Grundmuster gegeben sind, das relativ zu dem Objekt (4) jeweils unterschiedlich versetzt ist. Vorrichtung nach Anspruch 22, die so ausgebildet ist, daß das Grundmuster ein periodisches Grundmuster ist, wobei die versetzten Grundmuster durch Verschiebung des Grundmusters erhältlich sind. Vorrichtung nach Anspruch 23, die so ausgebildet ist, daß er Betrag der Verschiebung oder Verschiebungen und die Anzahl der Verschiebungen und damit der Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) so gewählt sind, daß eine Tiefenresponse-Funktion im Bereich einer Fokusebene, in die die Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) fokussiert sind, ein Plateau aufweist. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 24, bei der ein Antrieb (16; 31), mit dem das Objekt (4) oder ein Träger für das Objekt (4) bewegbar ist, von der Auswerteeinrichtung (7) so steuerbar ist, daß auf dem mit dem Träger bewegten Objekt (4) ein von dem als strukturierte Blende wirkenden Element erzeugtes Grundmuster (26, 27; 33, 34) ein Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) abbildet, und

– mittels der Auswerteeinrichtung (7, 46) Bilder des Detektors (6) nach jeder Änderung der Lage des Objekts (4) automatisch erfaßbar sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 25, bei der ein Antrieb (16; 31), mit dem das Objekt (4) oder ein Träger für das Objekt (4) bewegbar ist, von der Auswerteeinrichtung (7) so steuerbar ist, daß auf dem mit dem Träger bewegten Objekt (4) ein von dem als strukturierte Blende wirkenden Element erzeugtes Grundmuster (26, 27; 33, 34) ein Beleuchtungsmuster (26, 27; 33, 34) abbildet, und

– mittels der Auswerteeinrichtung (7, 46) Bilder des Detektors (6) nach jeder Änderung der Lage des Objekts (4) automatisch erfaßbar sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 26, bei der das als strukturierte Blende wirkende Element eine Feldblende (15) ist und zur Erzeugung der mindestens zwei Beleuchtungsstrukturen hinter der Feldblende (15) ein bewegliches, lichtablenkendes Element (30) angeordnet ist. Vorrichtung nach Anspruch 27, bei der die Feldblende (15) eine streifenförmige Struktur aus einander abwechselnden transparenten und opaken Bereichen aufweist. Vorrichtung nach Anspruch 27, bei der die Feldblende (15) eine in zwei Richtungen periodische Anordnung von transparenten und opaken Bereichen aufweist, wobei die opaken Bereiche aneinander angrenzen. Vorrichtung nach Anspruch 27, bei der das als Blende wirkende Element eine elektronisch ansteuerbare Modulationseinheit (45), insbesondere ein LCD oder ein DMD, ist. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 30, bei der eine Beleuchtungsoptik (40) zur Abbildung des als Blende wirkenden Elements auf das Objekt (4) als eine Beleuchtungsoptik für eine Dunkelfeldbeleuchtung ausgebildet ist. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 31, bei der die Auswerteeinrichtung so ausgebildet ist, daß Hell- und/oder Dunkelbilder niederfrequent gefiltert werden.






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