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Dokumentenidentifikation DE69935929T2 10.01.2008
EP-Veröffentlichungsnummer 0001137465
Titel VERFAHREN ZUR REINIGUNG VON BLUTBESTANDTEILEN
Anmelder Nuvue Technologies, Inc., Gilsum, N.H., US
Erfinder TRESE, Michael T., Bloomfield Hills, MI 48302, US;
WILLIAMS, George A., Grosse Pointe Park, MI 48230, US;
HARTZER, Michael, Rochester Hills, MI 48309, US;
DAILEY, Wendelin A., Lake Orion, MI 48359, US
Vertreter Merten & Kollegen, 90461 Nürnberg
DE-Aktenzeichen 69935929
Vertragsstaaten DE, ES, FR, GB, IT
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 19.10.1999
EP-Aktenzeichen 999565815
WO-Anmeldetag 19.10.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/US99/24273
WO-Veröffentlichungsnummer 2000024492
WO-Veröffentlichungsdatum 04.05.2000
EP-Offenlegungsdatum 04.10.2001
EP date of grant 25.04.2007
Veröffentlichungstag im Patentblatt 10.01.2008
IPC-Hauptklasse B01D 15/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse B01D 15/02(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   B01D 15/08(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 35/14(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 35/16(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 9/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 9/68(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
I. Gegenstand der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die schnelle Reindarstellung eines Blutbestandteils, insbesondere eines Plasminogens, das dann in Plasmin umgewandelt wird.

II. Beschreibung des Stands der Technik

Es gibt viele Situationen, in denen die Reindarstellung eines bestimmten Blutbestandteils wie z.B. Plasminogen aus menschlichem Blut wünschenswert ist. Die separierten Blutbestandteile können dann in weitere Teilbestandteile wie Plasmin zerlegt werden.

Zum Beispiel beschreibt unser am 19. April 1994 offengelegtes Patent Nr. 5,304.118 ein Verfahren für die Plasmin-Injektion ins menschliche Auge, um eine posteriore Glaskörperabhebung zu induzieren. Das Plasmin wird gewonnen, indem man dem aus menschlichem Blut entzogenem Plasminogen ein Enzym hinzugefügt.

Bei nicht-lebensgefährdenden chirurgischen Eingriffen wie z.B. Vitrektomie mit Plasmininjektion, ist das Infektionsrisiko wie z.B. einer AIDS-Infektion, durch unbekannte Ganzblutquellen einfach inakzeptabel. Es war daher bisher üblich, dem Patienten bei solchen nicht-lebensgefährdenden chirurgischen Eingriffen Blut zu entnehmen und dann seinem eigenen Blut den Blutbestandteil wie Plasminogen zu entziehen. Selbst wenn solches Blut nämlich virusinfiziert ist, entsteht dem Patienten durch die Re-Injektion des Blutbestandteils oder Teilbestandteils kein Schaden.

Zur Reindarstellung von Blutbestandteilen wie Plasminogen aus dem Blut ist es bisher üblich gewesen, säulenchromatographische Trennverfahren anzuwenden. Hier werden die Säulen durch Schwerkraft gespeist; sie sind am Einlass offen. Die Flussrate durch die Säulen wird durch die Schwerkraft, aber auch die Abmessungen der Säulen begrenzt. Im US-Patent 3,943,245 offenbart Silverstein ein Verfahren zur Reindarstellung von Plasminogen aus menschlichem Plasma und dem Plasma anderer Säugetiere durch eine modifizierte Affinitätschromatographie unter Verwendung von Sepharose-L-Lysin. Das Sepharose-L-Lysin wird in eine Säule gefüllt, die niedrige Flussraten erfordert, um den Kollaps der Säule zu verhindern. Im US-Patent 5,371,007 offenbaren Linnau et al ein Verfahren zur Herstellung von Lys-Plasminogen unter Verwendung eines Lysin-Polyacrylamid-Gels als Matrix für Affinitätschromographie. Sowohl in den von Silverstein als auch in den von Linnau et al offenbarten Verfahren werden strukturell schwache Materialien als Affinitätsmedien verwendet, die im Einsatz unter hohem Druck zusammenfallen oder übermäßigen Staudruck hervorrufen. Außerdem möchte das Patent von Linnau et al ausdrücklich ein Verfahren für die Isolierung von Plasminogen in großem Maßstab schaffen. Während solche Verfahren effektiv sind, erfordern sie einen großen Zeitaufwand, nämlich oft einen ganzen Tag oder länger im Labor, und sie erfordern die Verwendung von gepoltem Plasma. Fisher, Linnau et al und Silverstein raten einen weiteren zeitraubenden Schritt, indem sie fordern, dass Plasma vor der Affinitätschromatographie durch zweistündiges Rühren bei 4°C in Phosphatpuffer gewonnen wird. Castellino, in Methods of Enzy., Vol. 80, 265-377, 19_, fordert die Beseitigung von E-ACA aus dem Plasminogen durch extensive Dialyse gegen Wasser bei 4°C. Das würde mindestens weitere vier Stunden beanspruchen und Zugang zu einem Kühlschrank voraussetzen. Linnau et al weisen darauf hin, E-ACA könne bei der Isolierung in großem Maßstab durch Gelfiltrierung oder Ionenaustauschchromatographie entzogen werden. Dies würde gepackte Säulen betreffen, die ein schwaches Säulenmaterial enthalten, das Schwerkraftspeisung, niedrigen Druck und eine niedrige Flussrate erfordert. Auch dadurch würde die zum Trennen erforderliche Zeit verlängert.

Zusammenfassung der vorliegenden Erfindung

Die vorliegende Erfindung behebt die bekannten Nachteile der Verfahren zur Blutbestandteiltrennung nach dem Stand der Technik, indem sie mittels eines in Anspruch 1 definierten Verfahrens die schnelle Trennung und Reindarstellung eines Blutbestandteils ermöglicht, wobei das eigene Blut eines Patienten verwendet wird und die Trennung in wenigen Minuten erzielt werden kann.

Kurz gefasst, wird dem Patienten zuerst Blut entnommen, und das Blutplasma wird mit bekannten Methoden wie Zentrifugieren von den zellularen Blutelementen getrennt. Nach dem Zentrifugieren wird das den Blutbestandteil enthaltende Blutplasma behalten und die zellularen Blutelemente werden entsorgt.

Eine Affinitätskartusche der Art, die sich mit dem gewünschten Blutbestandteil bindet, wird vor dem Gebrauch präpariert. L-Lysin (oder ein anderer proteinbindender Bestandteil) wird kovalent an epoxidaktiviertes Silicium gebunden. Silicium ist ein Stoff, der sehr hohen Drücken widerstehen und dabei seine Form behalten kann. Diese Matrix ergibt geringen Staudruck und hohe Flussraten. Drei ml Lysin-Silicium wird in die Kartusche geladen, und dann wird der Deckel geschlossen. Der Deckel hat einen mit Luer-Verschluss versehenen Einlass, in dem eine Spritze angebracht werden kann. Mit Hilfe einer Spritze können Flüssigkeiten mit einer Geschwindigkeit durch die Kartusche gedrückt werden, die bis zu zehnmal so hoch ist wie mit einer schwerkraft-gespeisten Säule erzielbar wäre.

An die Kartusche wird eine Spritze mit Äquilibrierungspuffer angeschlossen, und der Puffer wird durchgedrückt, um die Kartusche vorzubenetzen. Die Spritze wird entsorgt und gegen eine Plasma enthaltenden Spritze ausgetauscht (normalerweise 10 ml). Das Plasma wird so durch die Kartusche geführt, dass der gewünschte Blutbestandteil (PLGN) mit der Affinitätskartusche bindet, und er wird dann aus dem Plasma entfernt.

Anschließend bindet eine Affinitätskartusche der Art, die mit dem gewünschten Blutbestandteil bindet, und wird zuerst mit einem Äquilibrierpuffer gewaschen, um die Kartusche zu aktivieren. Dann wird das abgetrennte Blutplasma so durch die Affinitätskartusche geführt, dass sich der gewünschte Blutbestandteil mit der Affinitätskartusche bindet und effektiv aus dem Plasma entfernt wird. Dann wird das Plasma entsorgt.

Anschließend wird ein Äquilibrierpuffer durch die Affinitätskartusche geführt, um etwaige in der Affinitätskartusche enthaltene ungebundene Proteine und ähnliche Stoffe auszuwaschen und zu entsorgen. Nach Beendigung des Waschvorgangs bleibt nur der gebundene Blutbestandteil in der Affinitätskartusche zurück.

Danach wird der Blutbestandteil aus der Affinitätskartusche eluiert, indem man einen Elutionspuffer injiziert, der ein Trennmittel enthält. Das Trennmittel wird so gewählt, dass es den Blutbestandteil von der Affinitätskartusche freisetzt bzw. entbindet. Falls gewünscht, kann der Trennbestandteil (E-ACA) vom Blutbestandteil abgesondert werden, indem man vor der Flution des Blutbestandteils am Auslass (OUT) der Affinitätskartusche eine innenaustauschende Festphasenextraktions-Vorrichtung anschließt. Diese Vorrichtungen bestehen aus weiblichen Luer-Einlässen und männlichen Luer-Auslässen. Sie weisen feste Abstützmittel auf, die nicht zusammenfallen, wenn Material mit einer angeschlossenen Spritze durchgeleitet wird. Sie haben eine begrenzte Kapazität und könnten nicht für die Separation im größerem Maßstab verwendet werden.

Anschließend werden der Elutionspuffer, die Lösung von Trennmittel und Blutbestandteil durch eine Ionenaustauschkartusche geleitet. Die Ionenaustauschkartusche entfernt das Trennmittel effektiv, und darauf wird der eluierte Blutbestandteil in einem sterilen Röhrchen aufgenommen.

Dann wird dem eluierten Blutbestandteil eine bekannte Menge eines Enzyms beigefügt, um den gewünschten Teilbestandteil wie z.B. Plasmin zu erhalten. Der Blutbestandteil bzw. Teilbestandteil ist dann, wahlweise nach weiterem Filtrieren, so verwendbar, wie es für den chirurgischen Eingriff wünschenswert ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung folgt eine ausführliche Beschreibung unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen, wobei sich die Bezugszeichen jeweils auf Teile beziehen, die in allen Zeichnungen dieselben sind und wobei

1 zeigt ein Verfahrensdisagramm, das die Verfahrensschritte bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt;

2 zeigt eine Seitenansicht einer Affinitätskartusche;

3 zeigt eine Seitenansicht einer Affinitätskartusche mit angeschlossenem Ionenaustauschfilter;

4 zeigt einen seitlichen Querschnitt durch eine Ionenaustauschvorrichtung der vorliegenden Erfindung.

Ausführliche Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die Trennung des Blutbestandteils Plasminogen vom Blut beschrieben. Das Plasminogen wird anschließend in Plasmin umgewandelt und bei chirurgischen Eingriffen wie z.B. Vitrektomie eingesetzt. Natürlich versteht sich, dass alternativ auch andere Blutbestandteile unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens vom Blut getrennt werden können.

Unter Bezugnahme auf 1 wird zunächst auf Schritt 10 auf bekannte Weise wie z.B. mit einer Koagulans enthaltenden Spritze eine vorgegebene Menge an Blut, z.B. 10 cm3, vom Patienten entnommen. Die vom Patienten zu entnehmende Blutmenge richtet sich natürlich nach der für das chirurgische Verfahren erforderlichen Menge an Blutbestandteil.

Auf Schritt 12 wird das Blutplasma auf konventionelle Weise, wie z.B. durch Zentrifugieren, von den zellularen Blutelementen abgeschieden. Bei der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Blut bei 100 g zehn Minuten lang bei 5°C zentrifugiert. Anschließend wird das Blut in sterilen Spritzen aufgenommen.

Unter Bezugnahme auf 1 und 2 wird eine Affinitätskartusche auf Schritt 16 (2) gewaschen und mit einer Äquilibrierungspufferlösung aktiviert. Die Affinitätskartusche 16 enthält ein festes Abstützmittel 18, das an eine Aminosäure wie z.B. L-Lysin angeschlossen ist. Die Affinitätskartusche enthält auch einen Luer-Auslass 20 und einen Luer-Einlass 22, sodass die gesamte in den Einlass 20 injizierte Flüssigkeit durch das feste Abstützmittel 18 sowie durch den Auslass 22 geleitet wird. Nach Aktivierung der Affinitätskartusche 16 mit dem Äquilibrierungspuffer wird dieser entsorgt.

Die Affinitätskartusche 16 enthält 3 ml gepacktes Volumen eines Affinitätsmediums wie z.B. L-Lysin, das an ein festes Abstützmittel wie epoxidaktivierte Silicaperlen gebunden ist. Alternativ können Perlen eine keramische Matrix enthalten, die über eine epoxidaktivierte Vernetzung mit Lysin verbunden ist. Die Affinitätsmedien müssen einer Druckbeaufschlagung standhalten können, welche erforderlich ist, um den schnellen Elutionsdurchsatz zu ermöglichen, ohne dabei in sich selbst zusammenzufallen. Die epoxidaktivierten Silicaperlen werden von der Firma Millipore Corporation, Waters Chromatography Division, hergestellt. Sie haben einen Durchmesser von 40 &mgr;m, eine Porengröße von 50 nm und eine Bindekapazität von 3-7 Mol Lysin pro ml Verpackungsmaterial.

Anschließend wird das Lysin (L-Lysin-Monohydrochlorid, Sigma Chemical L-6027) wie folgt an die Siliciumkartusche gebunden: Die Silicaperlen werden hydriert, und das überschüssige Wasser wird dekantiert. Dann werden die Perlen in Kopplungspuffer (100 &mgr;m Na-Phosphat, pH 8,0) fünf Minuten lang bebrütet, und der überschüssige Puffer wird dekantiert. Dies wird zweimal wiederholt. Nun wird den Perlen das im Kopplungspuffer solubilisierte Lysin in einem 20-Mol-Überschuss an den verfügbaren Bindungsstellen auf den Silicaperlen hinzugefügt und im Wasserbad bei 50°C fünf Tage lang geschüttelt. Anschließend wird das ungebundene Lysin durch Dekantieren beseitigt. Dann werden die Perlen in einem 2 M Ethanolamin enthaltenden Kopplungspuffer bei pH 9.5 48 Stunden lang bei 4°C bebrütet, um nicht besetzte Stellen zu blockieren. Die Blockierungslösung wird durch Dekantieren beseitigt. Darauf werden die Perlen einmal mit drei Volumen Kopplungspuffer, anschließend viermal mit drei Volumen 1-M-NaCl und zusätzlich mit drei Volumen Kopplungspuffer gespült. Die Perlen werden bei 4°C im Kopplungspuffer aufbewahrt.

Die Perlen werden in einer leeren Rezorian-Kartusche (Supelco) verpackt. Die Kartusche besteht aus Polypropylen mit Polyethylen-Fritten. Sie hat ein Luer-Lock-Fitting für den Anschluss von Spritzen.

Ein vorwiegend Natriumphosphat enthaltender Äquilibrierpuffer kann verwendet werden, um die Affinitätskartusche 16 zu aktivieren. Auf Aktivierschritt 14 werden mindestens 10 cm3 Äquilibrierpuffer durch die Kartusche 16 geleitet.

Auf Schritt 16 wird das auf Schritt 12 separierte Plasma in den Einlass 20 der Affinitätskartusche 16 injiziert, sodass das Plasma durch die feste Abstützung 18 und durch den Kartuschenauslass 22 führt. Dabei reagiert der Blutbestandteil Plasminogen mit der Aminosäure L-Lysin, und das Lysin bindet sich an die Aminosäure auf der festen Abstützung 18 in der Affinitätskartusche. Das Plasma, aus dem das Plasminogen entfernt wurde, wird an der Auslassöffnung 22 der Kartusche 16 gesammelt und dann entsorgt.

Auf Schritt 24 wird die das gebundene Plasminogen enthaltende Kartusche dann gewaschen, um das in der Kartusche 16 enthaltene ungebundene Protein zu beseitigen. Dieses Waschen wird dadurch erzielt, dass man ca. 48 cm3 eines Äquilibrierpuffers durch die Kartusche 16 schickt. Der durch die Kartusche 16 injizierte Puffer wird anschließend entsorgt. Dabei bleibt nur das gebundene Plasminogen an der Affinitätskartusche 16 haften.

Unter Bezugnahme auf 1, 3 und 4 ist eine Ionenaustausch- oder Größenausschlussvorrichtung 30 mit dem Auslass 22 der Affinitätskartusche in Reihe angeschlossen, z.B. mit einer Luer-Kopplung, sodass die gesamte durch die Kartusche 16 fließende Lösung auch durch den Ionenaustausch- oder Größenausschlussfilter 30 läuft. Eine Maxi-Clean-Scheibe (Alltech Associates, Inc.) kann beispielsweise eine Festphasenextraktions-Vorrichtung aufweisen, die aus hochreinen Polystyrol-Divinylbenzol-Kationenaustausch-Harzperlen besteht, die zwischen in einem Polypropylengehäuse klinischer Güte untergebrachten Polyethylenfritten 40 eingebettet sind. Auf Schritt 26 (1) wird das Plasminogen dann von der Affinitätskartusche 16 eluiert, indem man eine 2-cm3-Lösung Elutionspuffer mit einem Trennmittel wie z.B. e-Amino-n-Capronsäure injiziert. Das Trennmittel trennt das gebundene Plasminogen effektiv von der Affinitätskartusche 16, sodass die Lösung aus der Affinitätskartusche Elutionspuffer, das Trennmittel und den Blutbestandteil Plasminogen enthält.

Da die Ionenaustausch- oder Größenausschlussvorrichtung in Reihe mit der Affinitätskartusche gekoppelt ist, laufen die eluierte Lösung des Elutionspuffers. das Trennmittel und das Plasminogen durch dem Ionenaustausch- oder Größenausschlussfilter 30. Der Ionenaustausch- oder Größenausschlussfilter 30 bindet mit dem Trennmittel und beseitigt das Trennmittel effektiv aus der Lösung. Infolgedessen enthält die durch den Auslass 32 des Ionenaustauschfilters 30 laufende gefilterte Lösung nur den Elutionspuffer und das eluierte Plasminogen. Diese gefilterte Lösung wird in einem sterilen Röhrchen 34 aufgenommen, das eine bekannte Menge am Enzym 36, wie z.B. Streptokinase, enthalten kann. Das Enzym wandelt das Plasminogen bei Raumtemperatur effektiv in Plasmin um. Nach der Umwandlung wird das pH eingestellt, indem man eine bekannte Menge an Natriumhydroxid hinzufügt.

Wahlweise wird auf Schritt 38 das Plasmin sterilisiert, indem man es vor dem Gebrauch durch einen Filter wie z.B. einen 0,22-&mgr;m-Filter (z.B. Corning 21032-13) laufen lässt, der eine Zelluloseacetatmembrane in einem Polypropylen-Gehäuse enthält. Wenn vor dem Gebrauch des Plasmins eine Verzögerung nötig ist, sollte es bei niedrigeren Temperaturen aufbewahrt werden.

Die vorstehend beschriebene Trennung des Blutbestandteils Plasminogen und dessen nachfolgende Umwandlung in Plasmin kann innerhalb von wenigen Minuten im OP vollzogen werden. Die vorliegende Erfindung kann auch ein Set zur schnellen Reindarstellung von Plasmin aus menschlichem Plasma enthalten. Das Set kann eine Spritze, eine Lysin-Affinitätskartusche, einen Kationenaustauscher, einen an eine Spritze anzuschließenden Filter (d.h. 0,22 &mgr;m) Puffer und Reagenzien enthalten, die sich für die Trennung und Reindarstellung von Plasmin eignen.

Beispiel

Ein oben beschriebenes, für die schnelle Reindarstellung und Aktivierung von autologem Plasmin eingerichtetes Set wurde benutzt. Das entnommene Blut gelangt in 3 gelb-verkappte ADC-Röhrchen, die mit dem Set geliefert werden können. Die das Blut enthaltenden Röhrchen werden bei 750 × g fünfzehn Minuten lang zentrifugiert, um das Plasma abzutrennen. Eine sterile 21-GA – Nadel kann an eine 10-cm3-Spritze (Spritze A) angeschlossen werden, die Nadel kann durch die Kappe des Blutentnahme-Röhrchens eingeführt werden, und das Plasma kann aspiriert werden. Dieser Schritt kann für das zweite und dritte Röhrchen wiederholt werden, bis 10 cm3 Plasma in der Spritze A gesammelt worden sind.

Die Kationenaustauschscheibe kann vorbenetzt werden, indem man eine steriles Wasser enthaltende 10-cm3-Spritze an den Ionenaustauscher anschließt und den Inhalt der Spritze durch den Austauscher injiziert. Danach wird das Wasser entfernt, und der Kationenaustauscher kann bis zum Voraktivierungsschritt beiseite gesetzt werden.

Dann wird die Affinitätskartusche an das Ende der Spritze A angeschlossen, und das Plasma wird langsam durch die Kartusche injiziert, damit sich das Plasminogen an die Kartusche binden kann. Darauf kann die Spritze entsorgt werden.

Anschließend wird die Affinitätskartusche an eine 60-cm3-Spritze (Spritze B) angeschlossen, die 40 cm3 steriles 100-&mgr;m-Natriumphosphat mit pH 8,0 enthält. Der Puffer wird durch die Kartusche injiziert, um ungebundenes Material aus der Affinitätskartusche zu beseitigen. Für optimale Wiedergewinnung ist es unerlässlich, zu warten, bis das Tropfen vom Ende der Kartusche vollständig aufgehört hat, bevor man zum nächsten Schritt übergeht. Dann kann die Kartusche abgenommen und entsorgt werden.

Die Kationenaustauschscheibe kann voraktiviert werden, indem man der Scheibe eine 3-cm3-Spritze (Spritze C), die 1,2 cm3 sterile 15 &mgr;m-e-Amino-Caproinsäure (AMICAR, American Reagent Laborstories) in 100 &mgr;m Natriumphosphat mit pH 8,0 enthält, anschließt und den Inhalt der Spritze durch die Scheibe injiziert.

Die Affinitätskartusche kann an eine 10-cm3-Spritze (Spritze D) angeschlossen werden, die 2 cm3 sterile 15 &mgr;m-e-Amino-Caproinsäure (AMICAR, American Reagent Laborstories) in 100 &mgr;m Natriumphosphat mit pH 8,0 enthält. Der Inhalt der Spritze D wird anschließend durch die Kartusche injiziert und entsorgt.

Dann wird die Kationenaustauschvorrichtung am Ende der Affinitätskartusche angeschlossen, und darauf kann der Sterilisationsfilter an das freie Ende der Kationenaustauschvorrichtung angeschlossen werden. Dann kann das zusammengebaute Aggregat an das Ende der Spritze E angeschlossen werden. Anschließend wird der Inhalt von Spritze E (1 cm3 steriles 100 &mgr;m Natriumphosphat mit pH 8,0 und 15 &mgr;m -e-Amino-Caproinsäure von AMICAR, American Reagent Laborstories) durch das Aggregat injiziert werden. Diese Lösung wird verwendet, um das Plasminogen aus der Affinitätskartusche zu eluieren. Anschließend wird das Plasminogen in einer sterilen Ampulle gesammelt, die 50 000 IU sterile Streptokinase (Kabikinase, NabiVitrum) und Natriumphosphatpuffer mit pH 3,3 enthält. Die Ampulle wird 10 Minuten lang schonend gerührt, um die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin herbeizuführen.

Um das Vorkommen von aktivem Plasmin zu bestätigen, kann ein Tropfen Plasmin in die Vertiefung einer Mikrotitrationsplatte eingebracht werden, die ein synthetisches Substrat (D-val-leu-lys-PHA von Sigma: V-0882) enthält. Bei der Spaltung des Substrats entsteht eine gelbe Färbung, die mit einem mitgelieferten Standard verglichen werden kann.

Nun ist das Plasmin gebrauchsfertig und kann z.B. ins Auge injiziert werden. Es versteht sich natürlich, dass verschiedene Blutbestandteile, die verschiedene Bindemittel und verschiedene Trennmittel brauchen, alternativ benutzt werden können, ohne von der erfinderischen Idee oder dem Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen.


Anspruch[de]
Verfahren für die schnelle Trennung und Reindarstellung eines Blutbestandteils aus dem Blut, wozu folgende Verfahrensschritte gehören:

Blutgewinnung;

Trennung des Blutplasmas von den zellularen Blutelementen;

Aufbewahrung des den Blutbestandteil enthaltenden Blutplasmas;

Aktivierung einer Affinitätskartusche bestehend aus einer festen Unterlage aus epoxidaktiviertem Silicium und einer Keramik-Matrix, die dem bei manueller Betätigung der Spritze

entstehenden hohen Druck widerstehen kann,

Injektion des Blutplasmas mit einer Spritze durch die Affinitätskartusche, sodass der Blutbestandteil in der Affinitätskartusche verbleibt, und

einem darauf angeordneten Molekül mit Affinität für den Blutbestandteil;

danach Eluierung des Blutbestandteils von der Affinitätskartusche,

indem ein Trennmittel durch die Affinitätskartusche geleitet wird, wobei das Trennmittel den Blutbestandteil aus der Affinitätskartusche herauslöst, und

anschließend Filtrierung des Trennmittels aus der Lösung von eluiertem Trennmittel und Blutbestandteil.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es den weiteren Verfahrensschritt enthält, den Blutbestandteil nach erfolgter Separation des Trennmittels umzuwandeln. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Verfahrensschritt des Umwandelns den Schritt enthält, ein Enzym in den Blutbestandteil einzuführen. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Affinitätsmedien ein Molekül enthalten, das so gewählt ist, dass es sich mit dem Blutbestandteil bindet. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Affinitätsmedium L-Lysin enthält. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Blutbestandteil Plasminogen ist. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Unterlage Silicaperlen enthält. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Injektionsspritze an die Affinitätskartusche angeschlossen wird. Verfahren gemäß Anspruch 7 wenn in Abhängigkeit von Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das L-Lysin mittels einer Epoxidvernetzung kovalent an den Silicaperlen angebunden sind. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trennmittel eine e-Amino-n-Caproinsäure enthält. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Separation des Trennmittels aus der Lösung den Schritt enthält, die Lösung aus Trennmittel und Blutbestandteil durch einen Ionenaustauschfilter oder Größenausschlussfilter zu leiten, der das Trennmittel aus der Lösung Trennmittel/Blutbestandteil beseitigt. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Verfahrensschritt der Absonderung den weiteren Schritt enthält, die Lösung Trennmittel/Blutbestandteil durch einen Ionenaustauscher oder eine Größenausschlussvorrichtung zu leiten, wodurch das Trennmittel von der Lösung Trennmittel/Blutbestandteil beseitigt wird. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Ionenaustauscher oder die Größenausschlussvorrichtung eine feste Unterlage aufweist, welche dem bei der Injektion mit der Spritze ausgeübten Druck widerstehen kann. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Blutbestandteil Plasminogen ist und dass das Verfahren weiterhin den Schritt enthält, das Plasminogen nach Absonderung des Trennmittels von der Lösung umzuwandeln. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Umwandelns den Schritt enthält, dem Plasminogen ein Enzym hinzuzufügen, um das Plasminogen in Plasmin umzuwandeln. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Streptokinase enthält. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt der Trennung des Blutplasmas von den zellularen Blutelementen einen Zentrifugierschritt enthält.






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