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Dokumentenidentifikation DE102009044224A1 28.04.2011
Titel Methode zur Produktion von HCV Virus-ähnlichen Partikeln
Anmelder PomBio Tech GmbH Starterzentrum der Universität des Saarlandes Campus Geb. A1-1, 66123 Saarbrücken, DE
Erfinder Bureik, Matthias, Dr., 66117 Saarbrücken, DE;
Dragan, Anette, Dr., 66119 Saarbrücken, DE;
Dragan, Calin-Aurel, Dipl.-Biol., 66119 Saarbrücken, DE
Vertreter Fleuchaus & Gallo, 81479 München
DE-Anmeldedatum 09.10.2009
DE-Aktenzeichen 102009044224
Offenlegungstag 28.04.2011
Veröffentlichungstag im Patentblatt 28.04.2011
IPC-Hauptklasse C12N 7/02  (2006.01)  A,  F,  I,  20100212,  B,  H,  DE
IPC-Nebenklasse A61K 35/76  (2006.01)  A,  L,  I,  20100212,  B,  H,  DE
Zusammenfassung Die vorliegende Erfindung beschreibt eine Methode zur Produktion von auf HCV begründeten virus-ähnlichen Partikeln (VLPs) mit rekombinanten Hefezellen, insbesondere mit Spalthefen.

Beschreibung[de]
Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beschreibt eine Methode zur Produktion von Virus-ähnlichen Partikeln (VLPs) mit rekombinanten Hefezellen, insbesondere mit Spalthefezellen (Schizosaccharomyces).

Hintergrund

Die Erfindung des Impfschutzes gegen Infektionskrankheiten ist ohne Frage eine der größten Meilensteine in der Geschichte der Medizin. Gegenwärtig verhindern Impfungen mehr als 3 Millionen Todesfälle pro Jahr. Aus ökonomischer Sicht bedeutet dies Einsparungen von mehr als eine Milliarde Dollar pro Jahr.

Der Erfolg eines gentechnisch hergestellten Impfstoffes hängt jedoch stets auch von Sicherheitsaspekten hinsichtlich möglicher Mutations- und Rekombinationsereignissen ab. Darüberhinaus gibt es insbesondere für chronische Erkrankungen und Krebserkrankungen sehr oft keine wirksamen Therapien oder gar Impfstoffe, die die Krankheit heilen oder verhindern können. Ein Grund hierfür könnte darin liegen, dass zur Bekämpfung und Heilung von infizierten oder neoplastischen Zellen eine starke und wirksame Induktion der Immunantwort notwendig ist. Ein weiterer Grund könnte sein, eine noch spezifischere Selektion der Schlüsselantigene nötig ist, insbesondere zur Markierung von Neoantigenen auf Tumoren.

Aus diesen Gründen ist die Entwicklung von neuen Impfstoffen und Technologie-Plattformen als Träger für solche Impfstoffe oder einfach für die Produktion solcher Impfstoffe von großer Bedeutung.

Ein interessanter Ansatzpunkt ist die Verwendung von virus-ähnlichen Partikeln (VLPs) als nicht infektiöse Partikel aber dennoch immunogene Impfstoffe.. VLPs bestehen aus viralen Strukturproteinen, die sich in einer Wirtszelle durch selbst-Zusammenbau („self-assembly”) zu Virus-ähnlichen Partikeln zusammenfügen ohne dabei Nukleinsäuren in ihrem Inneren einzuschließen: es konnte gezeigt werden dass sie hoch immunogen sind und dabei die meisten der oben genannten Sicherheitsaspekte umgehen könnten (Noad & Roy, 2003).

Bezüglich der Immunogenität von VLPs wurde kürzlich gezeigt, dass eine Stimulation des adaptiven Immunsystems durch VLPs von verschiedenen Faktoren abhängig ist:

  • i. ein mittlerer Durchmesser der VLPs (< 0,05 &mgr;m), der optimal ist für die Aufnahme der VLPs durch dentritische Zellen (Fifis et al., 2004)
  • ii. eine effiziente Aktivierung der Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) (Lenz et al., 2003);
  • iii. eine Aktivierung von CD8 positiven cytotoxischen Killerzellen (Ruedl et al., 2002) und
  • iv. eine potente Stimulation der B-Zell vermittelten Immunantworten durch Aktivierung des B-Zellrezeptors auf der Oberfläche von B-Zellen.

Letztere Beobachtung wurde erstmals in Studien demonstriert, in denen organische Polymere verwendet wurden, deren Oberfläche mit Haptenen bestückt waren. Es konnte gezeigt werden, dass 20–25 Haptene, die in einem Abstand von 5–10 nm angeordnet waren, ausreichten, um eine T-Zell unabhängige B-Zell Aktivierung zu induzieren (Dintzis et al., 1976; Mond et al., 1995).

Gegenwärtig sind zwei VLP-basierte Impfstoffe, zur Prävention der Hepatitis B Infektion und der Infektion mit dem humanen Papilomavirus, zugelassen. Der Erfolg dieser Impfstoffe hat neue Erwartungen in diesem Bereich geweckt und die Wichtigkeit der Entwicklung neuer Impfstoffe gezeigt, insbesondere der Entwicklung von VLP-basierten Impfstoffe gegen weitere virale Pathogene.

Die Produktion von Hepatitis C Virus (HCV) VLPs erfolgt beispielsweise in Säugerzellkulturen. Hierbei exprimieren transient transfizierte Säugerzellen die viralen Strukturproteine, die sich selbstständig zu VLPs zusammenlagern und dann ins Zellmedium sekretiert werden. Die Verwendung von Säugerzellkulturen ist jedoch ein sehr aufwendiges und zeitintensives Verfahren und birgt darüber hinaus auch das Risiko von Kontaminationen.

Aus diesen Gründen gibt es stetige Forschun für die Entwicklung von neuen, kostengünstigen und zeitsparenden Techniken zur VLP-Produktion, um die oben genannten Nachteile zu umgehen.. Daraus resultierend konnte in den letzten Jahren gezeigt werden, dass einzellige Organismen wie Pilze und Hefen prinzipiell zur VLP-Produktion verwendet werden können. Zum Beispiel bildet das Hepatitis B S-Protein Partikel, wenn es in der Hefe Aspergillus niger exprimiert wird (Plueddemann & Zyl, 2003). Darüberhinaus konnte eine erfolgreiche Produktion von chimären VLPs, bestehend aus Hepatitis B und Hepatitis E Virusproteinen in der Hefe Pichia pastoris nachgewiesen werden (Li et al., 2004). Mit dieser Hefe wurde auch die Produktion von HCV VLPs intensiv erprobt, allerdings werden produzierte VLPs von diesem Organismus nur intrazellulär gebildet und nicht ins Kulturmedium sekretiert (Acosta-Rivero et al., 2001).

Ein wesentlicher Nachteil bei der beschriebenen Verwendung von Pilzen und Hefen zur VLP-Produktion stellt die fehlende Sekretion der VLPs dar. Entsprechend müssen nicht sekretierte VLPs durch mehrere Isolationsschritte aus dem Inneren der Wirtszellen gewonnen werden. Dies ist sowohl für die Hefe Saccharomyces cerevisiae als auch für die Hefe Schizosaccharomyces pombe beschrieben worden. Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe sind zwei sehr gut charakterisierte Hefearten, die einige VLPs effizient produzieren, jedoch nicht freisetzen oder sekretieren können. Sasagawa et al. (1995) konnte beispielsweise die Produktion von HPV VLPs mit der Hefe Schizosaccharomyces pombe zeigen, jedoch konnten diese nicht im Kulturmedium der Hefen nachgewiesen werden. Demzufolge mussten die Partikel aufwendig isoliert werden, was ebenfalls ein Risiko für Kontaminationen der VLP-Fraktionen birgt und stets einen Mengenverlust mit sich bringt.

Es wird angenommen, dass die äußere Zellwand der Hefezellen die Partikelbildung id Sekretion behindert. Aus diesem Grund wurde eine Methode entwickelt, bei der Sphäroblasten, die keine äußere Zellwand besitzen, erzeugt werden. Diese Methode wird auch von Sakuragi et al. (2002) verwendet, um HIV Partikel aus Zellen der Hefe Saccharomyces cerevisiae zu sekretieren, nachdem die Zellwand entfernt wird. Zum Entfernen der Zellwand muss ein enzymatischer Zellwandabbau durchgeführt werden, der jedoch sowohl Hefezellen als auch VLPs modifiziert. Bedauerlicherweise ist der Mangel an geeignete Expressionsraten ein bekanntes Phänomen in vielen etablierten Expressionssystemen wie z. B. bei der Hefe Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris. Aus bislang unerklärlichen Gründen werden einige Proteine besser als andere Proteine exprimiert, welche nicht exprimierbar oder sogar nicht nachweisbar sein können. Mögliche Gründe für dieses Phänomen gibt es einige: es wird vermutet, dass spezifische mikro-RNAs möglicherweise in einer Fehlexpression oder Fehltranslation verschiedener Proteine involviert sind. Andere Wissenschaftler vertreten die Meinung, dass verschieden Proteine oder Enzyme an einer raschen Degradation der rekombinanten Proteine beteiligt sind. Dies hat zur Folge, dass das gewünschte Protein nicht mehr nachweisbar ist.

Aus allen genannten Gründen ist ersichtlich, dass die Produktion von VLPs mit Hefezellen schwierig ist und verbesserte Expressionssysteme und geeignete Methoden zur VLP-Produktion benötigt werden. Dies trifft insbesondere auf die Produktion von funktionellen HCV VLPs mithilfe rekombinanter Mikroorganismen zu.

Gegenstand der Erfindung

Aus den oben genannten Gründen bietet die hier beschriebene Erfindung eine alternative Methode und ein alternatives Expressionssystem für die Produktion von VLPs, insbesondere von HCV VLPs. Hierbei handelt es sich um ein kostengünstiges, zeitsparendes und einfaches Verfahren, bei dem eine Modifikation der VLPs durch aufwendige Isolationsschritte vermieden wird und trotzdem wettbewerbsfähigen Mengen an VLPs produziert werden können. Des Weiteren ist es Gegenstand der Erfindung, HCV VLPs zu diagnostischen Zwecken, als Trägermoleküle und als Impfstoff zu verwenden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch die Methode entsprechend dem Anspruch 1 gelöst, welche die Verwendung von rekombinanten Hefestämmen umfasst, welche die Strukturgene funktional exprimieren können, welche für den selbst-Zusammenbau von auf HCV basierenden virus-ähnlichen Partikeln benötigt werden, und die Kultur dieser rekombinanten Hefe unter geeigneten Kulturbedingungen für die Produktion von virus-ähnlichen Partikeln. Des Weiteren umfasst diese Methode die Isolation der virus-ähnlichen Partikel aus dem Überstand aus den kultivierten Hefezellen.

Die dargestellte Methode der HCV VLP-Produktion basiert auf der Verwendung von rekombinanten Hefestämmen, welche die HCV-Strukturproteine exprimieren, die sich intrazellulär selbstständig zu VLPs zusammenlagern. Die Hefezellen werden unter geeigneten Bedingungen kultiviert und anschließend werden Zellen und Zellfragmente vom Kulturmedium getrennt. Optional können die Hefezellen mit einem Detergenz oder durch eine Beschallung behandelt werden und erneut vom Zellüberstand separiert werden. Im Anschluss erfolgt die Isolation der VLPs aus den Zellkulturüberständen.

Im Rahmen dieser Erfindung wird Natriumdodecylsulfat als Detergenz zur Behandlung der Zellen verwendet. Ferner umfasst diese Erfindung eine Methode, bei der die rekombinanten Hefestämme mit mindestens einem Vektor stabil transformiert wurden, der die genetische Information zur Expression der HCV Strukturproteine kodiert, die zur Bildung von HCV VLPs benötigt werden. Des Weiteren umfasst die Erfindung eine Methode, bei der die strukturellen Gene, die der intrazellulären Bildung von HCV VLP zugrunde liegen, aus der Gruppe von strukturellen Genen des HCV Genoms stammen. Diese Gruppe besteht aus folgenden strukturellen Genen: HCV-Core (Gentyp 1a), HCV-Envelopel (HCV-E1, Gentyp 1a) und HCV-Envelope2 (HCV-E2, Gentyp 1a). Ferner liegen bei dieser Methode die strukturellen Gene als Fusionsgene, bestehend aus Genen der Gruppe der HCV-Strukturgene und einem heterologen Gen vor. Des Weiteren umfasst diese Methode rekombinante Hefestämme, welche von mindestens einem der folgenden, elterlichen Stämme abstammen: Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces japanicus und Schizosaccharomyces kambucha.

Des Weiteren umfasst die Erfindung – unter anderem – die Verwendung von rekombinanten Spalthefen (Schizosaccharomyces) für die Produktion und Sekretion von HCV VLPs. Des Weiteren, die Verwendung von Spalthefen, die wie oben beschrieben, mit mindestens einem Vektor transient oder stabil transformiert wurden. Dieser Vektor kodiert die cDNA, die für die Expression der HCV Strukturproteine benötigt wird. Die vom Vektor kodierte genetische Information stammt aus der Gruppe folgender struktureller Gene des HCV-Genoms: HCV-Core (Gentyp 1a), HCV E1E2 (Gentyp 1a), Kombinationen dieser Gene oder Derivate davon, die zur Bildung von HCV VLPs benötigt werden. Außerdem umfasst die Methode Spalthefen (Schizosaccharomyces), welche von mindestens einem der folgenden elterlichen Stämme abstammen: Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces japanicus und Schizosaccharomyces kambucha.

Des Weiteren umfasst die Erfindung isolierte HCV VLPs, die von rekombinanten Spalthefen produziert und in den Zellüberstand sekretiert werden und die anschließend aus dem Medium isoliert werden. HCV VLPs die mittels dieser Methode gewonnen werden, bestehen aus HCV-Core-Proteinen (Gentyp 1a), HCV-Core-Proteinen (Gentyp 1a) und/oder HCV E1/E2-Proteinen (Gentyp 1a). Eine Verwendung der mittels dieser Methode generierten HCV VLPs ist die Entwicklung eines Medikamentes zur Behandlung oder zur Prävention von Virus-Infektionen oder als Bestandteil eines Kits.

Kurzbeschreibung der Abbildungen

zeigt die schematische Darstellung der Aufarbeitung einzelner Proben aus dem Kulturüberstand von Spalthefestämmen, welche die HCV-Proteine unter verschiedenen Kulturbedingungen exprimieren.

zeigt Core-Konzentrationen im Kulturüberstand von Spalthefen, die mittels HCV-Core ELISA gemessen wurden. Die untersuchten Proben wurden mit Hilfe einer Membran, die Moleküle bis zu einem Molekulargewicht von 100 kDa trennt, konzentriert.

zeigt Core-Konzentrationen im Kulturüberstand von Sphäroblasten, die mittels HCV-Core ELISA gemessen wurden.

zeigt Core-Konzentrationen die nach Zentrifugation mit Hilfe eines 20 prozentigen Sucrose-Kissens in den Sedimenten mittels HCV-Core ELISA gemessen wurden.

zeigt Core-Konzentrationen im Kulturüberstand von Sphäroblasten, die nach Zentrifugation mit Hilfe eines 20 prozentigen Sucrose-Kissens mittels HCV-Core ELISA quantifiziert wurden.

zeigt Core-Konzentrationen im Kulturüberstand von Sphäroblasten, die mittels HCV-Core ELISA quantifiziert wurden. Die untersuchten Proben wurden mit Hilfe einer Membran, die Moleküle bis zu einem Molekulargewicht von 100 kDa trennt, konzentriert.

zeigt Core-Konzentrationen im Filtrat des Sphäroblasten-Überstandes, welches eine Membran mit einer Durchlässigkeit für Moleküle mit einem Gewischt < 100 kDa passiert hat.

zeigt Core-Konzentrationen im Kulturüberstand von Sphäroblasten, die mit 1% SDS behandelt wurden. Die untersuchten Proben wurden mit Hilfe einer Membran, welche Moleküle mit einem Gewischt > 100 kDa trennt, konzentriert.

zeigt Core-Konzentrationen im Filtrat des Sphäroblasten-Überstandes, die mit 1% SDS behandelt wurden. Das Filtrat hat eine Membran mit einer Durchlässigkeit für Moleküle mit einem Gewischt < 100 kDa passiert.

zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme von HCV VLPs im Kulturüberstand des unbehandelten Stammes CAD100.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Es wurde bereits in der Literatur beschrieben, dass Hefe-basierte VLPs nicht im Kulturmedium der produzierenden Zellen nachweisbar sind, sondern erst, nachdem die Hefezellwand enzymatisch abgebaut wurde. Diese Beobachtung ist auf den ersten Blick nicht sehr überraschend, da ebenfalls bekannt ist, dass sekretorische Hefeproteinen im periplasmatischen Raum zwischen äußerer Zellwand und Innerer Zellmembran verbleiben (Moreno et al., 1985; Schweingruber et al., 1986).

Eine weitere Erklärung für eine fehlende Sekretion ist die Größe der VLPs: In der Annahme, dass sich die Core-Proteine mit einem Molekulargewischt von 22 kDa zu VLPs, bestehend au ca. 200 Proteinen pro Partikel zusammenlagern, entstehen Proteinaggregate, die die Zellwand aufgrund ihrer Größe nicht passieren können. Dies würde insbesondere für umhüllte VLPs zutreffen, deren Durchmesser sogar noch größer ist. Aufgrund dieser Annahme wäre eine Sekretion nur durch die Herstellung von Sphäroblasten, so wie es bereits für die Sekretion von HIV-VLPs durch die Hefe Saccharomyces cerevisiae gezeigt wurde, zu erwarten (Sakuragi et al., 2002).

Entgegen allen Vorurteilen präsentieren die Erfinder mit der hier vorgestellten Methode ein neues und ein überraschend effizientes Expressionssystem, nämlich eine andere rekombinante Hefe für das Verfahren zur Produktion virus-ähnlicher Partikel (VLPs), wobei die VLPs aus dem Überstand der Zellkultur der besagten rekombinanten Hefen isoliert werden können.

Die in dieser Methode verwendete Hefe gehört zur Gattung der Spalthefen, die evolutionär gesehen entfernt von anderen und der Hefe Saccharomyces cerevisiae liegt und sich deshalb auch deutlich von dieser unterscheidet. Im Gegensatz zu einigen bislang veröffentlichten Arbeiten konnten die Erfinder zeigen, dass rekombinante Spalthefen in der Lage sind, HCV-Strukturproteine zu exprimieren und eine Virus-ähnliche Freisetzung der Partikel erlauben oder diese sogar aktiv sekretieren.

Entsprechen einer bevorzugten Ausführungsform ist die Hefeart für die in dieser Erfindung beschriebene Methode zur Produktion von HCV VLPs Schizosaccharomyces. Diese stammt aus der Gruppe folgender Stämme: Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces japonicus und Schizosaccharomyces kambucha oder Kombination hiervon.

Die Bezeichnung „virus-ähnliche Partikel” beruht auf der Virus-ähnlichen Struktur der Partikel, die aus den viralen Strukturproteinen der entsprechenden Viren zusammengebaut werden. Bei manchen Viren sind diese Proteine in eine Doppellipidschicht eingebettet. Solche Virus-ähnliche Partikel sind generell nicht infektiös, da sie keine Nukleinsäuren in Ihrem Inneren verpacken.

Die Methode, die in dieser Erfindung beschrieben wird, basiert auf der Verwendung von rekombinanten Hefestämmen, welche virale Strukturproteine exprimieren, die von strukturellen Genen kodiert werden. Die exprimierten viralen Strukturproteine sind für den selbst-Zusammenbau der VLPs notwendig.

Die Bezeichnung „virale Strukturgene” bedeutet und umfasst jene Gene, welche für die Produktion spezifischer Proteine oder Peptide verantwortlich sind, die für die Bildung der Partikelstruktur notwendig sind, die normalerweise in ihrem Innereren Nukleinsäuren und regulatorische Elemente umschließt. Diese Struktur wird oft als Kapsid, Core oder Kapsidstruktur bezeichnet. Die Bezeichnung „virale Strukturgene” bedeutet und umfasst ebenfalls auch modifizierte Strukturgene, die von einem gewünschten Virus abstammen, die jedoch Veränderungen, Nukleinsäure-Austausch, Deletionen oder Insertionen enthalten. Die Bezeichnung „virale Strukturgene” bedeutet und umfasst ebenso Fusionsgene, bestehend aus strukturellen Genen eines gewünschten Virus mit mindestens einem heterologen Gen.

Die Bezeichnung „selbst-Zusammenbau” der Viruspartikel im Zusammenhang mit dieser Erfindung bezeichnet jene Schritte, die bei der Virusvermehrung zur intrazellulären Organisation der Proteine zur Bildung von komplexen dreidimensionalen Viruspartikeln führt. Im Allgemeinen haben die Strukturproteine die Tendenz sich selbst zusammenzubauen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden rekombinante Hefezellen unter geeigneten Bedingungen kultiviert. Geeignete Bedingungen beinhalten Medium-Zusammensetzung, pH, Temperatur, Kultivierungsdauer, Rührgeschwindigkeit, etc. Unter geeigneten Bedingungen ist die Hefe in der Lage die produzierten und selbstgeformten VLPs ins Kulturmedium zu sekretieren und/oder zu exportieren, woraus sie mittels der in dieser Erfindung beschriebenen Methode isoliert werden.

Da Hefezellen nicht adherent wachsen, müssen zuerst die intakte Hefezellen bzw. Zellfrakmente aus dem Kulturmedium separiert werden z. B durch einen Filtration oder Zentrifugationsschritt. Die Verwendung von geeigneten Filtern oder die Zentrifugationsgeschwindigkeit muss in Abhängigkeit von der Größe der produzierten VLPs eingestellt werden, um eine simultane Separation der VLPs aus dem Medium zu vermeiden.

Darüber hinaus kann die Effizienz der vorliegenden Methode gesteigert werden, indem der Kulturüberstand, Retentat-Proben, Filtrat-Proben oder die Zell- bzw. Sphäroblasten-Sedimente nach der Zentrifugation entweder mit einem Detergenz behandelt oder beschallt (Ultraschall) werden, damit zusammenhängende oder aggregierte Partikel oder Partikel-Zellstrukturen vereinzelt werden.

Nachfolgend werden sekretierte oder exportierte VLPs, wie in dieser Erfindung beschrieben, aus dem Hefekulturmedium isoliert z. B. durch eine Sucrose-Kissen Zentrifugation und/oder Ultrazentrifugation nach Angaben des Standardprotokolls.

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden rekombinante Hefezellen verwendet, die mit einem Vektor transformiert wurden, welcher die Expression heterologer Proteine, wie z. B. der viralen Strukturproteine kodiert.

Die Bezeichnung „Vektor” beschreibt lineare oder zirkuläre DNA-Transport Vehikel, wie z. B. DNA-Fragmente, Plasmide, Cosmide oder künstliche Chromosome, die zusätzlich zur gewünschten Nukleinsäure auch regulatorische Sequenzen, Selektionsmarker Gene und Replikons (zur autonomen Vermehrung des Vektors) beinhalten können. Daher können die in dieser Erfindung verwendeten Vektoren in einem einzelligen Organismus wie der Hefezelle vermehrt werden und ebenfalls aus diesen Organismen isoliert werden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung, wurden für die Herstellung rekombinanter Hefestämme der integrative Vektor pCAD1 (Dragan et al., 2005) und der autosomal replizierende Vektor pREP1 verwendet (Maundrell, 1993). Der Vektor pCAD1 integriert sich in den leu1 Locus des Chromosom II und geht sogar unter nicht selektiven Bedingungen nicht verloren.

Im Falle des autosomal replizierenden Vektors (pREP1) sind eine oder mehrere Kopien des Vektors in der Zelle vorhanden. Durch die autosomale Vermehrung des Vektors in der Zelle, enthalten die rekombinanten Hefestämme viele Kopien des Vektors und somit viele Kopien der Expressionskassette mit der gewünschten Nukleinsäure, hier den Genen für die Expression der viralen Strukturproteine.

Alternativ kann die Transformation auch durch Integration des Vektors oder Teilen davon in das Hefegenom als stabile Transformation erfolgen. Typischerweise, aber nicht ausschließlich, erfolgt eine Integration durch Rekombinationsereignissen zwischen homologen Sequenzen des Vektors und des Hefegenoms. In diesen Fällen ist nur die ins Genom integrierte Expressionskassette vorhanden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stammen die Strukturgene, die für den selbst-Zusammenbau der VIPs notwendig sind, von Hepatitis Viren ab. Gemäß der vorliegenden Erfindung stammen die Strukturproteine vom Hepatitis C Virus (HCV) ab, bevorzugt aus folgender Gruppe von Genen: HCV-Core-Protein (Genotyp 1a) und HCV E1/E2 (Gentyp 1a).

Wie detailliert in den Beispielen gezeigt wird, dient die Methode, die dieser Erfindung zugrunde liegt, der Produktion von VLPs mit rekombinanten Spalthefen. Während die Menge an nachzuweisenden Core-Proteinen (mittels Elisa-Technologie, beschrieben im Beispiel) trotz Konzentrierung in den Zellüberständen von Spalthefen sehr gering ist (), so kann die Menge durch vorherige Bearbeitung der Zellen zu Sphäroblasten und Bearbeitung der Proben (Sucrose-Kissen Zentrifugation, Filtration) mindestens um einen Faktor von 20, 40 oder 80 oder gar um den Faktor 100, durch vorherige Bearbeitung der Proben mit einem geeigneten Detergenz (), gesteigert werden. Alternativ können die Retentat-Fraktionen oder sedimentierten Zellfraktionen durch Beschallung, präferenziell durch Ultraschall, behandelt werden.

Es scheint als sei die Spalthefe (Schizosaccharomyces) überraschend gut geeignet für die Methode, die dieser Erfindung zugrunde liegt. Dies liegt höchstwahrscheinlich daran, dass sich die Spalthefe evolutionär deutlich von anderen Hefegattungen unterscheidet. Es wird angenommen, dass der Unterschied zwischen den Hefengattungen in der Struktur der äußeren Zellwand besteht, und dass dieser Unterschied dazu beiträgt, dass die Spalthefe als Wirtsorganismus für die VLP Produktion, die in dieser Erfindung beschrieben wird, geeignet ist.

Wie gezeigt, eignen sich Spalthefen erstaunlich gut für eine effiziente Produktion und Freisetzung der VLPs in den Zellkulturüberstand und dies stellt eine entscheidende Verbesserung im Vergleich zu herkömmlichen VLP-Produktionsmethoden dar. Dies trifft insbesondere für Methoden zu, bei denen ebenfalls mit der Herstellung von Sphäroblasten gearbeitet wird.

Ein Vergleich der dieser Erfindung zugrunde liegenden Methode – wie ebenfalls in den Beispielen demonstriert wird – mit Standardmethoden ergibt folgendes:

Der Nachweis von HCV Core-Proteinen in den Sedimenten () und Zellkulturüberständen () des Hefestammes CAD102, erhalten nach einer Sucrose-Kissen-Zentrifugation, zeigen anhand der theoretischen Verteilung von komplexen Viruspartikeln sehr deutlich die Formation von VLPs. Vor der Zentrifugation sind Core-Proteine im Kulturmedium detektierbar, während nach der Zentrifugation Core-Proteine fast ausschließlich in den Sedimenten nachweisbar sind. Das gleiche gilt in etwa für die untersuchten Proben des Hefestammes CAD103. Der Stamm CAD100, produziert nur Core-Proteine, die nach einer Sucrose-Kissen-Zentrifugation hauptsächlich in den Sedimenten nachweisbar sind (), während jedoch auch eine geringe Konzentration im Überstand nachweisbar ist. Anhand der theoretisch errechneten Sedimentationszeit kann davon ausgegangen werden, dass hier die meisten Core-Proteine VLPs bilden, denn sonst würde keine Sedimentation der Core-Proteine erfolgen. Die Detektion von Core-Proteinen im Überstand kann folgendermaßen erklärt werden: Möglicherweise werden einige Core-Partikel von der Wirtszellmembran umschlossen und haben daher andere Sedimentationsbedingungen oder es handelt sich um einzelne Core-Proteine, die keine Proteinaggregate bilden.

Eine Filtration mit Hilfe einer Membran, welche für Moleküle mit einem Molekulargewicht von < 100 kDa durchlässig ist, zeigt, dass Core-Proteine ausschließlich in den Retentat-Proben der Stämme CAD102 und CAD103 nachweisbar sind (vergleiche Signale beider Stämme in und ). Da einzelne Core-Proteine mit einer molekularen Masse von 22 kDa die Membran passiert hätten, liefert dies ebenfalls einen Hinweis auf die Bildung und Sekretion von VLPs mit den Hefestämmen CAD102 und CAD103.

In Proben des Stammes CAD100 passiert ein signifikanter Anteil an Core-Proteinen die Membran. Die Ergebnisse der Sucrose-Kissen Zentrifugation lassen den Schluss zu, dass monomere Core-Proteine vorhanden sind. Diese Annahme kann auch durch das Filtrationsergebnis bestätigt werden.

Wenn Retentat-Proben der Filtration mit 1% SDS behandelt werden und anschließend wieder filtriert werden, so lässt sich ein erstaunlicher Anstieg der Core-Konzentration verzeichnen. Diese Zunahme kann bei allen Core-exprimierenden Stämmen und insbesondere beim Stamm CAD102 () beobachtet werden. Die Signalstärke gemessen beim Kontrollstamm MB163 wird nicht durch die SDS-Behandlung beeinflusst. Darüberhinaus wird die Core-Signalstärke innerhalb der Fraktionen, die die Membran passiert hat, ebenfalls nicht signifikant durch eine SDS-Behandlung verändert (vergleiche mit ). Werden Retentat-Proben von Hefezellen mit intakter Zellwand mit SDS behandelt, so kann erstmals ein Core-Signal mittels der ELISA-Technologie nachgewiesen werden.

Die Ergebnisse einer Behandlung von Retentat-Proben des Sphäroblasten-Überstandes mit SDS zeigen, dass kaum Core-Proteine die Membran passiert haben (vergleiche mit ). Möglicherweise führt eine SDS-Behandlung dazu, dass sich die Hüllen der Viren lösen und/oder macht die Epitope der Core-Proteine für eine Detektion mit Antikörpern leichter zugänglich ohne jedoch deren Struktur zu verstören. Dies könnte erklären, warum nach SDS-Behandlung Core-Proteine im Retentat verbleiben. Eine SDS-Behandlung des Stammes CAD100 zeigt, analog zu den Experimenten ohne SDS-Behandlung (), dass Core-Proteine von der Membran durchgelassen werden (). Auch dies bestätigt unsere Hypothese, dass nicht alle Core-Proteine als VLPs vorkommen sondern auch in monomerer Form.

Abschließend haben elektronenmikroskopische Aufnahmen des Kulturmediums des Stammes CAD100 die Sekretion von VLPs bestätigt ().

Zusammenfassend ist die dieser Erfindung zugrundeliegende Methode besonders geeignet, um VLPs zu produzieren und erhebliche VLP Mengen direkt aus dem Kulturüberstand zu isolieren.

Gemäß dieser Erfindung ist die ihr zugrunde liegenden Methode geeignet, um VLPs zu produzieren und zu isolieren, welche aus einem oder mehreren Strukturproteinen, die für den Zusammenbau von VLPs notwendig sind. Die VLPs können aus der Gruppe der Flaviviren, Retroviren, Hepatitis Viren und insbesondere vom Hepatitis C Virus abstammen. Für diese Methode werden Hefestämme benutzt, welche die Strukturgene enthalten, die zur VLP Bildung benötigt werden und die aus der Gruppe der Flaviviren, Retroviren und Hepatitis Viren stammen.

Alternativ können die Hefestämme Fusionsgene, bestehend aus den Strukturgenen der oben genannten ausgewählten Gruppe enthalten oder Kombination dieser Gene oder Fusionsgene aus einem Strukturprotein der genannten Gruppe mit mindestens einem weiteren heterologen Gen, enthalten.

Die in dieser Methode verwendeten rekombinanten Hefestämme können aus der Gruppe Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces japonicus und Schizosaccharomyces kambucha stammen. Die Verwendung von rekombinanten Spalthefen für die Produktion ausgewählter VLPs ist möglicherweise wegen ihrer evolutionären Unterschiede zur Hefe Saccharomyces von Vorteil. Es wird angenommen, dass insbesondere die intrazelluläre Enzymzusammensetzung oder der Vorrat von mikro-RNAs zwischen beiden Hefearten sehr verschieden sind, sodass die Fähigkeit verschiedene Proteine funktional zu exprimieren nicht vergleichbar oder vorhersagbar ist.

Gemäß dieser Erfindung sind rekombinante Spalthefen mit mindestens einem Vektor transformiert, der die Strukturgene, welche für die Bildung von VLPs benötigt werden, kodiert (wie oben beschrieben). Insbesondere sind die rekombinanten Spalthefen in der Lage, Strukturproteine des HCV zu produzieren, insbesondere die Proteine HCV-Core (Gentyp 1a) sowie HCV E1/E2 (Gentyp 1a).

Die beschriebene Erfindung bietet eine Methode zu Herstellung isolierter VLPs, welche von rekombinanten Spalthefen produziert und in den Kulturüberstand sekretiert werden, woraus sie anschließend isoliert werden können. Die mit der in dieser Erfindung beschriebenen Methode isolierten VLPs bestehen im Wesentlichen aus HCV Core-Proteinen (Gentyp 1a) und/oder HCV E1/E2 Proteinen (Gentyp 1a) oder Kombinationen davon.

Gemäß dieser Erfindung sind die isolierten VLPs zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Prävention von Virus-Infektionen nützlich. Im Falle der HCV VLPs sind diese besonders geeignet um einen therapeutischen oder präventiven Impfstoff zu entwickeln.

Ein geeignetes Medikament umfasst die isolierten VLPs in einem geeigneten Puffer oder einer Lösung wie z. B. Wasser oder Phosphatpuffer. Aber auch andere geeignete Zusätze, Trägermoleküle, Verdünnungen oder Bindemittel für beispielsweise orale, intramuskuläre oder intravenöse Anwendungen können für die Herstellung des Medikamentes oder Impfstoffes verwendet werden.

Des Weiteren werden die gemäß der vorliegenden Erfindung isolierten VLPs als Komponenten eines Kits verwendet, der die isolierten VLPs und mindestens ein Gefäß enthält. Viele Anwendungen eines solchen Kits sind denkbar und umfassen, jedoch nicht ausschließlich, diagnostische Test für Human- und Tiermedizin oder die Immunisierung von Tieren wie Kaninchen, Maus, Ratte...zur Produktion von Antikörpern, sowie zur Immunisierung von Menschen. Des Weiteren werden die gemäß dieser Erfindung isolierten VLPs als bildgebende Verfahren in der Diagnostik eingesetzt. Zu diesen Zwecken wird eines der Strukturproteine an ein Schwermetall fusioniert. Des Weiteren können VLPs beispielsweise mit Kontrastmitteln beladen werden.

Beispiele BEISPIEL 1: HERSTELLUNG VON HCV VLPs MIT REKOMBINANTEN SPALTHEFEN RNA-Herkunft und RNA-Extraktion

Die cDNA, welche die Expression der viralen Strukturproteine Core und E1/E2 kodiert, stammt aus einem Patientenserum mit der Nummer 22057, aus der Serumbank der Klinik für Innere Medizin II – Gastroenterologie, Hepatologie, Endokrinologie, Diabetologie und Ernährungsmedizin, der Universitätsklinik in Frankfurt. Die RNA-Extraktion erfolgte mit Hilfe des QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) nach Angaben der Hersteller

Vektor

Die amplifizierten cDNAs wurden in den TOPO XL Vektor des Kits pCR TOPO XL cloning kit der Firma Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) kloniert. Als Expressionsvektoren für die Spalthefe wurde der integrative Vektor pCAD1 (Dragan et al., 2005) und der autosomal replizierende Vektor pREP1 (Maundrell, 1993) verwendet.

Reverse Transkription (RT-PCR) der RNA

Die cDNA wurde mittels einer RT-PCR hergestellt. Hierzu wurden 3 &mgr;l der extrahierten RNA (#22057) mit 1,5 &mgr;l Random-Hexameren (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) und 0.5 &mgr;l RNAse freiem Wasser gemischt und für 10 Minuten bei 65°C inkubiert und sofort im Eisbad gekühlt. Parallel wurden folgende PCR Komponenten miteinander vermischt: 7,5 &mgr;l RNAse freies Wasser, 5 &mgr;l des vorbehandelten RNA-Gemischs aus vorherigem Schritt, 1, 4 &mgr;l 25 mM MgCl2, 4 &mgr;l 10 mM dNTPs (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 2.5 10 × PCR Reaktionspuffer + MgCl2 (Roche, Basel, Switzerland), 1 &mgr;l RNaseOUT (recombinant ribonuclease inhibitor) 40 U &mgr;l-1 (Invitrogen), 1 &mgr;l Superscript II reverse Transcriptase. Anschließend erfolgte eine Inkubation bei 42°c für 60 Minuten.

Amplifikation der cDNA

Weil die Spalthefe keine Signalpeptid-Sequenz besitzt, (Weihofen et al., 2002), die jedoch für eine korrekte Prozessierung der HCV-Proteine benötigt wird, wurden folgende Expressionskassetten hergestellt: NH2-CORE-ExportSignal-COOH (Protein 1) und NH2-ExportSignal-E1-E2-COOH (Protein 2).

HCV-Core und Hüllproteine E1/E2 wurden mit Hilfe des Expand Long Template Kit (Roche) amplifiziert. Die Komponenten der PCR wurden folgendermaßen zusammengemischt: 27 &mgr;l RNAse freies Wasser, 6 &mgr;l der mittels RT-PCR generierten cDNA als Template zur Amplifikation des Core-Gens, 1 &mgr;l Plasmid M289 + 22057 im Falle der Amplifikation der Hüllproteine, 5 &mgr;l 10 mM dNTPs (Invitrogen), 5 &mgr;l of 10 × Expand PCR Puffer 3, 1.5 &mgr;l 25 mM MgCl2, 1 &mgr;l DMSO, 1 &mgr;l Expand enzyme mix mit 3.5 U &mgr;l-1.

Zur Amplifikation des Core-Gens wurden folgende Primer verwendet:

Zur Amplifikation der Gene E1/E2 wurden folgende Primer verwendet:

Der erste Primer versieht das Core-Gen mit einer 5'-terminalen NdeI und einer 3'-terminalen BamHI Schnittstelle. Ein Stop-Kodon wurde durch den zweiten Primer eingeführt. Die Hüllproteine E1 und E2 wurden mit den Primern 3 und 4 als Fusionsgene mit einer ER-Lokalisationssequenz (vom Core-Gen stammend) amplifiziert. Ebenso wurde mit den Primern eine 5'-terminale NdeI und eine 3'-terminale BamHI Schnittstelle eingeführt.

PCR Programm

  • 1 T = 95°C, t = 2.0 min
  • 2 T = 95°C, t = 10 s
  • 3 T = 50°C, t = 30 s
  • 4 T = 68°C, t = 2.5 min
  • 5 GOTO 2, 35 times
  • 6 T = 68°C, t = 10 min
  • 7 T = 10°C, t = .

Die korrekte Größe des Amplifikates wurde mittels Agarosegelelektrophorese bestätigt. Die amplifizierte DNA wurde aus dem Gel isoliert und in den pCR TOPO XL Vektor (Invitrogen) kloniert.

Die für das HCV-Core-Protein kodierende cDNA wird im Folgenden Core und die für die Hüllproteine kodierende cDNA wird ENV genannt.

Sequenzierung

Die Sequenzierung der amplifizierten Gene erfolgte mit Hilfe des BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kits und dem ABI Prism 3100 Genetic Analyzer. Die Sequenz-PCR wurde folgendermaßen hergestellt: 7.5 &mgr;l Wasser, 2 &mgr;l BigDye Lösung, 2 &mgr;l pCR TOPO XL Vektor und 0.5 &mgr;l Sequenzierprimer (M13 Primer, welche im Topo XL cloning Kit enthalten sind).

PCR-Programm:

  • 1 T = 95°C, t = 2.0 min
  • 2 T = 95°C, t = 10 s
  • 3 T = 45°C, t = 15 s
  • 4 T = 60°C, t = 4 min
  • 5 T = 72°C, t= 10 min
  • 5 GOTO 2, 35 times
  • 6 T = 72°C, t = 10 min
  • 7 T = 10°C, for storage

Für die Sequenzierung der E1/E2-Sequenz wurden weitere sequenzspezifische Primer verwendet (E1-257-2s, HVR1-inner sense, E2-1b-6a).

Konstruktion der Expressionsvektoren

Der pCR TOPO XL Vektor mit den kodierenden Sequenzen für die Expression der Core- und Hüllproteine E1/E2 wurden mit den Enzymen NdeI/BamHI verdaut und die entsprechenden Fragmente nach elektrophoretischer Auftrennung aus dem Agarosegel isoliert. Anschließend wurden Core und ENV Sequenzen in beide Vektoren pCAD1 und pREP1 kloniert. Die daraus resultierenden Expressionsvektoren wurden pCAD1-CORE, pCAD1-ENV, pREP1-CORE and pREP1-ENV genannt.

Konstruktion der Spalthefestämme

Der Spalthefestamm NCYC2036 (MB163) mit dem Gentyp h-ura4.dl18 wurde als Startpunkt für die Herstellung von HCV-Protein exprimierenden Spalthefestämmen verwendet. Kryokompetente MB163 Zellen wurden wie beschrieben hergestellt (Suga and Hatakeyama, 2005) und entweder mit den Vektoren pCAD1-CORE oder pCAD1-ENV transformiert, was zur Herstellung der Spalthefestämme CAD100 und CAD101 führte. Die korrekte Integration des pCAD1 Plasmids ins Genom der Hefezelle wurde durch eine Wachstumskontrolle auf EMM-Medien, welche Phloxin B beinhalteten, überprüft. Die Integration der gewünschten cDNAs wurde zusätzlich mittels einer Kolonie-PCR unter Verwendung der Primer 1, 2, 3 und 4 bestätigt.

In einem zweiten Schritt wurde der Stamm pCAD100 mit dem Vektor pREP1-ENV und der Stamm pCAD101 mit dem Vektor pREP1-CORE mittels der Lithium-Acetat Methode transformiert (Okazaki et al., 1990). Die hergestellten Hefestämme sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Table 2: Spalthefestämme Stamm Herkunft exprimierte Proteine Art der Replikation Expressionkassette pro Zelle CAD100 NCYC2036 CORE chromosomal 1 CAD101 NCYC2036 ENV chromosomal 1 CAD102 CAD100 CORE chromosomal 1 ENV autosomal viele CAD103 CAD101 ENV chromosomal 1 CORE autosomal viele

Produktion von HCV-Proteinen mittels Spalthefen

Die Spalthefestämme MB163, CAD100, CAD101, CAD102 und CAD103 wurden auf EMM-haltigen Medien, denen entweder 0.01% Urazil (für MB163) oder 0.01% Leuzin (für CAD100 und CAD101) zugesetzt wurden, ausgesät. Alle Platten enthielten Thiamin in einer Konzentration von 5 M um die Expression rekombinanter Proteine während der Wachstumsphase bei 30°C zu reprimieren. Nach drei Tagen Wachstumszeit wurden 10 ml Vorkulturen von den Hefestämmen mit EMM und den entsprechenden Aminosäure-Zusätzen und ohne Zugabe von Thiamin hergestellt und für 24 h, bei 30°C und einer Schüttelgeschwindigkeit von 150 rpm. inkubiert. Danach wurde in einer 100 ml Kultur Biomasse in Abwesenheit von Thiamin und in Anwesenheit der entsprechenden Aminosäure-Substitutionen (30°C 24 h, 150 rpm) produziert. Die Zellen wurden bei 3000 g für 5 Minuten zentrifugiert und zweimal in ZymDig Puffer gewaschen (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH = 8, 2% Glucose, 16% Sucrose) und schließlich in 4 ml ZymDig Puffer resuspendiert. Zymolyase 20T von ICN Biomedicals (Aurora, OH, USA) wurde in einer Konzentration von 20 mg mL-1 zugesetzt und diese Zellsuspension wurde bei 30°C für 24 h unter Schütteln (150 rpm) inkubiert. Zymolyase 20T ist ein Enzym-Mix, der aus dem Organismus Arthrobacter luteus gewonnen wird. Seine -1,3-Glucan laminaripentaohydrolase Aktivität ist für den Abbau der Zellwand verantwortlich, was zur Bildung von Sphäroblasten führt. Im Anschluss wurden die Zellen zentrifugiert (3000 g, 5 min) und der Überstand wurde wegen der hohen Zymolyasekonzentration verworfen. Nach drei Waschschritten mit ZymDig Puffer wurden die Zellen erneut mit 4 ml ZymDig Puffer resuspendiert und über Nacht inkubiert (30°C 150 rpm). Abschließend wurde die Zellsuspension zentrifugiert (3000 g, 5 min) und der Überstand wurde nach Zugabe von 1 mM PMSF und 1 mM DTE bei 4°C gelagert.

Vorbereitung der Proben

zeigt einen schematischen Überblick über die Vorbereitung der einzelnen Proben. Der Kulturmedium-Überstand wurde als M bezeichnet, während die Proben, welche nach der zweiten Behandlung mit ZymDig Puffer behandelt wurden, als S Proben bezeichnet wurden. Die Buchstaben A bis G beziehen sich auf die Position in der Schemazeichnung. Unbehandelte Proben von M und S wurden als MA und SA-Proben bezeichnet und aufbewahrt.

Es wurden 1.5 ml Überstand auf ein Sucrose-Kissen (20%) geschichtet und zentrifugiert (105 g, 1 h). Probe B ist eine Probe, die aus der Flüssigkeit oberhalb des Sucrose-Kissens entnommen wurde, während Probe C das mit PBS resuspendierte Sediment darstellt. Weitere 2 ml des Überstandes wurden mit Hilfe einer Membran, welche für Proteine mit einem Molekulargewicht von < 100 kDa durchlässig ist, filtriert (103 g, 1 h). Hieraus resultierten die Proben D (Durchfluß) und E (Retentat). Die Retentat-Proben wurden weiterhin noch mit 1% SDS für 30 min inkubiert und anschließend wieder unter den oben genannte Bedingungen filtriert. Diese Proben wurden F (Durchfluß) und G (Retentat) bezeichnet.

Proteinkonzentrationsbestimmung

Die Messung der Proteinmenge in den Proben erfolgte mit Hilfe des BCA-Assays von Pierce (Rockford, IL, USA) mit wenigen Änderungen. Das Endvolumen der gemessenen Lösung wurde folgendermaßen zusammengesetzt: 100 &mgr;l einer 1:40 Verdünnung bestehend aus Lösung B und Lösung A wurden mit entweder 50 &mgr;l BSA oder einer 1:10 Verdünnung der Überstände gemischt. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer Mikrotiterplatte inkubiert. Im Anschluss wurde die Farbreaktion photometrisch bei einer Wellenlänge von = 595 nm in dem Tecan Genios MTP reader (Geneva, Switzerland) gemessen.

Nachweis des HCV-Core

HCV Core-Proteine im Überstand der Spalthefen wurden mittels des HCV CORE antigen ELISA test system der Firma Ortho-Clinical Diagnostics (Raritan, NJ, USA) nach Angaben der Hersteller durchgeführt. Dieser Kit ist ein qualitativer, diagnostischer Assay, beidem spezielle Qualitätsmerkmale für zuverlässige diagnostische Ergebnisse empfohlen werden. Da wir den ELISA Kit nur zum Nachweis einer erfolgreichen CORE-Expression verwendeten, wurden die vom Hersteller empfohlenen Richtwerte der Qualitätskontrolle nicht beachtet. Die gemessenen Konzentrationen des Core-Proteins wurden anhand der Gesamtproteinmenge der jeweiligen Proben normalisiert. Da des Weiteren keine konzentrationsabhängige Kalibrierung durchgeführt wurde, ist nicht bekannt, ob ein linearer Zusammenhang zwischen der Core-Konzentration und den Signalstärken besteht. In den Proben D, E, F und G des Stammes CAD101, welcher nur die HCV-Hüllproteine exprimiert, wurden folglich keine Core-Signale detektiert. Die Signalstärken bei diesen Proben sind vergleichbar mit denen des Kontrollstammes MB163.

Proteinproduktion mit Spalthefen

Die Integration der gewünschten cDNAs CORE und/oder ENV wurde für alle konstruierten Spalthefestämme (Tab. 2) mittels Kolonie-PCR bestätigt. Für die Konstruktion von VLP-sekretierenden Spalthefestämmen wurden zwei Kombinationen gewählt. Der Ausgangsstamm exprimiert entweder CORE oder ENV mit Hilfe eines integrativen Vektors (mit nur einer Expressionskassette pro Zelle). Zusätzlich wurden ENV oder CORE cDNAs mit Hilfe eines autosomal replizierenden Vektors (viele Expressionskassetten pro Zelle) in die Zellen eingeschleust, damit VLPS gebildet werden können. Diese Prozedur diente hauptsächlich dazu, um herauszufinden, welches Mengen cDNA für die VLP-Produktion geeignet sind. Die Stämme CAD100 und CAD101 zeigen ein normales Wachstum im Vergleich zum Kontrollstamm MB163, während der Stamm CAD102 signifikant langsamer wächst. Im Phasenkontrastmikroskop kann ein untypischer Phänotyp bei den Stämmen Cad100 und CAD102 festgestellt werden, basierend auf einem Anstieg an intrazellulären, veränderten Strukturen und an einer Veränderung der Zellform.

Core-Proteine werden ins Kulturmedium sekretiert

In den MA Proben konnte ein schwaches Signal im Vergleich zum Kontrollstamm MB163 nachgewiesen werden. Eine Sucrose-Kissen Zentrifugation konnte die Signal-Stärke nicht verbessern. Nach Filtration der Proben durch eine Membran, welche für Proteine < 100 kDa durchlässig ist, konnten Unterschiede zwischen dem Kontrollstamm und den Stämmen CAD100 und CAD102 gemessen werden ().

Core-Proteine werden von Sphäroblasten sekretiert

Nachdem Sphäroblasten mittels enzymatischem Zymolyase 20 T Verdau hergestellt wurden, wurden diese für weitere 24 Stunden in ZymDig Puffer inkubiert. Überstände dieser Proben (SA-Proben) wurden mittels Core-ELISA analysiert und eine signifikante Core-Konzentration konnte in den Proben der Stämme CAD100, CAD102 und CAD103 gemessen werden (). Nur sehr geringe Core-Konzentrationen (nicht signifikante Mengen) waren in Proben des Kontrollstamms und des ENV exprimierenden Stamms CAD101 zu messen. Im Vergleich zu den Core-Konzentrationen intakter Zellen waren die Core-Signale in den Überständen von Sphäroblasten erheblich stärker. Darüberhinaus resultierte eine Behandlung der Überstände mit 1% SDS und anschließender Filtration in einer weiteren Verstärkung der Core-Signale in den Proben der Stämme CAD100 und CAD102, verglichen mit dem Kontrollstamm MB163.

Sucrose-Kissen Zentrifugation

Bei der Sucrose-Kissen Zentrifugation handelt es sich um eine Zentrifugation, bei der die Proben über einen Zuckergradient (hier bestehend aus 20 prozentiger Sucrose) geschichtete werden. Dies ist eine gängige Methode zur Separation von VLPs aus Kulturmedien. Sowohl die resuspendierten Sedimente als auch die Flüssigkeit oberhalb des Zuckerkissens wurden mittels HCV Core ELISA analysiert. Da das Sediment mit 0,5 ml PBS resuspendiert wurde, kann von einer ca. 3-fach konzentrierten Probe ausgegangen werden. In den Sedimenten der Stämme CAD100 und CAD102 war eine deutlich höhere Core-Konzentration messbar, verglichen mit unbehandelten Überständen (). In den Proben des Stamms CAD103 konnte keine Verbesserung, sondern eine Verringerung der Konzentration gemessen werden. Auch bei den Kontrollstämmen (MB163 und CAD101), welche keine Core-Proteine exprimieren, konnte ein nicht signifikanter Anstieg der Core-Konzentration beobachtete werden. Dies ist möglicherweise eine Folge der Konzentrierung der Proben. In allen Proben, bei denen eine Verstärkung der Core-Signale in den Sediment-Proben gemessen wurde, war gleichzeitig ein Schwund der Core-Signale in der Flüssigkeit oberhalb des Sucrose-Kissens messbar ().

Core-Proteine werden von einer Membran, welche für Proteine mit einem Molekulargewicht von < 100 kDa durchlässig ist, zurückgehalten

Mittels Filtration der Überstände von Sphäroblasten, welche in ZymDig Puffer resuspendiert wurden, wurden die Core-Proteine von der Membran zurückgehalten (Retentat-Proben) (). Jedoch konnte kein eindeutiger Konzentrierungseffekt beobachtet werden. Für den Stamm CAD103 konnte ebenfalls wieder eine Verringerung der Core-Konzentration detektiert werden. Ebenfalls interessant erscheint, dass nur bei Proben des Stammes CAD100, welcher nur das Core-Protein überexprimiert, Core-Signale auch in den Durchfluß-Proben messbar waren. Die war nicht der Fall für Proben der Stämme CAD102 und CAD103 (). Subtrahiert man die Core-Konzentrationen des Kontrollstammes MB163 in den Durchfluß-Proben (Hintergrund-Signale) von den gemessenen Werten der Stämme CAD102 und CAD103, so ist in diesen Durchfluß-Proben kein Core-Signal mehr vorhanden (vergleiche mit ).

Core-Konzentrationen nach SDS-Behandlung

Es wurden jeweils 0,3 ml der Retentat-Proben mit 1% SDS behandelt und anschließend erneut filtriert. Dies führte zu erstaunlichen Anstiegen der Core-Konzentration. Der Anstieg konnte bei allen Core-exprimierenden Stämmen verzeichnet werden und besonders deutlich bei Proben des Stammes CAD102 (). Bei Proben des Kontrollstammes MB163 war dieser Effekt nicht nachweisbar. Auch für die Durchfluß-Proben führte eine SDS-Behandlung zu keinem Anstieg der Core-Konzentration (vergleiche mit ).

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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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  • Suga and Hatakeyama, 2005 [0080]
  • Okazaki et al., 1990 [0081]


Anspruch[de]
Methode zur Herstellung von auf HCV begründeten virus-ähnlichen Partikeln (VLPs) umfassend

– die Verwendung einer rekombinanten Hefezelle, welche die Strukturproteine exprimiert, die zum selbst-Zusammenbau des virus-ähnlichen Partikels benötigt werden,

– die Kultur der rekombinanten Hefe unter geeigneten Bedingungen,

– die Trennung der Hefezellen und Zellfragmente vom Überstand,

– optional, die Behandlung der Hefezell-Fraktion oder der Retentat-Fraktion mit einem Detergenz oder durch Beschallung, und die Trennung der behandelten Hefezell-Fraktion oder Retentat-Fraktion vom Überstand, und

– die Trennung von der virus-ähnlichen Partikel vom Überstand der rekombinanten Hefezellkultur.
Methode gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefestämme ausgewählt sind aus von wenigstens einem elterlichen Stamm aus der Gruppe bestehend aus Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces japonicus und Schizosaccharomyces kambucha. Methode gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Detergenz Natriumdodecylsulfat ist. Methodegemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Hefestamm mit wenigstens einer Kopie eines Vektors transformiert, welcher die Gene kodiert die für die Expression der viralen Strukturproteine notwendig sind und die zur intrazellulären Bildung von auf HCV begründeten virus-ähnlichen Partikeln benötigt werden. Methodegemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadruch gekennzeichnet, dass der rekombinante Hefestamm durch die Insertion von wenigstens einer Kopie eines Vektors, welcher die Expression der viralen Strukturproteine, die zur Bildung von auf HCV begründeten virus-ähnlichen Partikeln benötigt werden, kodiert stabil transformiert ist. Methode gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Strukturgene, welche für den selbst-Zusammenbau der virus-ähnlichen Partikel benötigt werden ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Structurgene des Hepatitis C Virus HCV. Methode gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Strukturgene, die für den selbst-Zusammenbau eines virus-ähnlichen Partikels benötigt werden ausgewählt sind aus einer Gruppe bestehend aus den Strukturgenen HCV Core-Protein, HCV subtyp 1a-Core-Protein (wieder Gentyp 1a) und HCV E1E2-Protein. Methode gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Strukturgene ein Fusionsgen aus einem Strukturgen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Strukturgenen des Hepatitis Virus und einem heterologen Gen aufweisen und kodieren. Verwendung von rekombinanten Schizosaccharomyces-Zellen zur Produktion sekretierter auf HCV begründeter virus-ähnlicher Partikel. Verwendung gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der rekombinante Spalthefestamm stabil oder transient mit wenigstens einer Kopie eines Vektors transformiert ist, welcher die Strukturgene oder Derivate der Strukturgene des Hepatitis C Virus (HCV) ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Strukturgenen für das HCV Core-Protein, HCV subtyp 1a-Core-Protein (wieder Gentyp 1a), HCV E1E2-Protein, Kombinationen hiervon und Derivate hiervon, welche für den selbst-Zusammenbau eines virus-ähnlichen Partikels benötigt werden Verwendung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Schizosaccharomyces ausgewählt ist aus wenigstens einem Stamm aus der Gruppe bestehend aus Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces japonicus und Schizosaccharomyces kambucha. Isolierte auf HCV begründete virus-ähnliche Partikel, welche von rekombinanten Schizosaccharomyces produziert und in den Überstand sekretiert wurden, und welche aus dem Überstand der Schizosaccharomyces Zellkulturisoliert wurden. Isolierte auf HCV begründete virus-ähnliche Partikel, hergestellt nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die virus-ähnlichen Partikel im Wesentlichen aus HCV Core-Protein, HCV subtyp 1a-Core-Protein und/oder HCV E1E2-Protein (Gentyp 1a) bestehen. Verwendung der isolierten auf HCV begründeten virus-ähnlichen Partikel gemäß den Ansprüchen 12 und 13, zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung oder zur Prävention von Virus-Infektionen oder einer HCV-Infektion. Verwendung der isolierten auf HCV begründeten virus-ähnlichen Partikel gemäß den Ansprüchen 12 und 13, in einem Kit, der die isolierten wirus-ähnlichen Partikel und wenigstens ein Behältnis beinhaltet.






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